Die Rolle zweier Zn(II)2Cys6 binukleärer Clusterproteine in der sexuellen Entwicklung von Aspergillus nidulans

Der filamentöse Ascomyzet Aspergillus nidulans ist ein ubiquitär vorkommender Bodenorganismus. Sein homothallischer Lebenszyklus ermöglicht ihm die Bildung von asexuellen und sexuellen Sporen auch ohne Kreuzungspartner. Die asexuelle Entwicklung vollzieht sich in einem kurzen Zeitraum und die asexuellen Sporen, Konidien genannt, können durch Wind und Wasser verbreitet werden. Die Bildung der sexuellen Sporen ist komplizierter und zeitaufwendiger. Die sexuellen Sporen können nach ihrer Reifung viele Jahre im Boden verweilen, bis sie unter günstigen Bedingungen wieder auskeimen. Die Differenzierung einfacher Hyphen zu komplexen Fruchtkörpern, in denen die Prozesse der Karyogamie und Meiose stattfinden, ist sehr energieaufwendig und bedarf großer Umstellungen in den Zellen. Deshalb ist die Fruchtkörperbildung strikt reguliert. Viele äußere Faktoren, wie z.B. das Nährstoffangebot oder Licht entscheiden über die Einleitung der sexuellen Entwicklung. Die Regulierungen und die morphogenetischen Veränderungen des Pilzes während dieses Prozesses sind bisher weitestgehend nicht untersucht. In dieser Arbeit wurden zwei putative Transkriptionsfaktoren, rosA („repressor of sexual development“) und nosA („no sex“), identifiziert und charakterisiert, die einen wichtigen Einfluss auf die sexuelle Entwicklung in A. nidulans haben. Beide gehören zu der Familie der Zn(II)2Cys6 binukleären Clusterproteine. Im Fall von nosA hat sich gezeigt, dass dieser Regulator für die funktionsfähige sexuelle Reproduktion essentiell ist. Die Einleitung der sexuellen Entwicklung ist nicht betroffen, doch bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt stoppt dieser Prozess. Der Effekt der geblockten sexuellen Entwicklung ist nicht 100%ig, da noch in sehr geringen Mengen Fruchtkörper gebildet werden. Diese weisen allerdings nur noch ein Bruchteil der Größe von Kleistothezien eines Wildtyps auf. Es konnte gezeigt werden, dass die Transkription zweier Gene der sexuellen Entwicklung, cpeA und hxtA, von nosA abhängig ist. Da die Überexpression eines bereits beschriebenen Regulators, nsdD, den Effekt der Deletion von nosA nicht ausgleichen konnte, wurde geschlossen, dass NosA in der Regulationskaskade NsdD nachgeschaltet ist oder in parallelen Wegen fungiert. Im Fall des zweiten Transkriptionsfaktors rosA wurde gezeigt, dass dieser Regulator als ein Repressor der sexuellen Entwicklung fungiert. Er verhindert die Einleitung der sexuellen Entwicklung in Flüssigkulturen, sowie auf Medien mit niedrigen Glukose-Konzentrationen. In Flüssigkultur wirkt RosA als ein Repressor der bereits bekannten Regulatoren veA, nsdD, stuA und auch nosA. RosA kann im Kern lokalisieren, jedoch wird der Kerneintritt offensichtlich durch eine Region im Mittelteil des Proteins erschwert, bzw. verhindert. Diese Region konnte auf ca. 150 Aminosäuren eingeengt werden. Diese Befunde weisen auf eine postranskriptionelle Regulation des Proteins hin. Neben der Charakterisierung von rosA und nosA erfolgte ein ungerichteter Ansatz zur Identifizierung von Proteinen, die während der Fruchtkörperbildung differenziell exprimiert werden. Dies geschah mit einem Vergleich von Proteinmustern zu zwei verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung, jeweils im Wildtyp und zwei Entwicklungsmutanten. Eine der untersuchten Mutanten, die ?nsdD-Mutante, bildet nur asexuelle Sporen und es findet keine sexuelle Entwicklung statt. Die zweite Mutante war die in dieser Arbeit charakterisierte ?nosA-Mutante, in der die sexuelle Differenzierung zu einem frühen Zeitpunkt stoppt. So war ein Vergleich zwischen früher und später sexueller und asexueller Entwicklung möglich. Zusätzlich konnten potentielle Zielproteine des Regulators NosA gefunden werden. Die Auftrennung der Proteine erfolgte mittels 2D-Gelelektrophorese. Es wurden starke Unterschiede in den Proteinmustern der verschiedenen Entwicklungsstadien gefunden. Einige der differenziell exprimierten Proteine konnten mittels Massenspektroskopie identifiziert werden. Darunter befanden sich unbeschrieben Proteine mit einer möglichen Funktion in der Fruchtkörperbildung (z.B. zwei 14-3-3 Proteine). Außerdem fanden sich Proteine, deren Funktion in der sexuellen Entwicklung bereits bekannt ist (CpeA); sowie bereits beschriebene Proteine, deren mögliche Rolle in der sexuellen Entwicklung neu ist (CatB)

Die Rolle zweier Zn(II)2Cys6 binukleärer Clusterproteine in der sexuellen Entwicklung von Aspergillus nidulans

Der filamentöse Ascomyzet Aspergillus nidulans ist ein ubiquitär vorkommender Bodenorganismus. Sein homothallischer Lebenszyklus ermöglicht ihm die Bildung von asexuellen und sexuellen Sporen auch ohne Kreuzungspartner. Die asexuelle Entwicklung vollzieht sich in einem kurzen Zeitraum und die asexuellen Sporen, Konidien genannt, können durch Wind und Wasser verbreitet werden. Die Bildung der sexuellen Sporen ist komplizierter und zeitaufwendiger. Die sexuellen Sporen können nach ihrer Reifung viele Jahre im Boden verweilen, bis sie unter günstigen Bedingungen wieder auskeimen. Die Differenzierung einfacher Hyphen zu komplexen Fruchtkörpern, in denen die Prozesse der Karyogamie und Meiose stattfinden, ist sehr energieaufwendig und bedarf großer Umstellungen in den Zellen. Deshalb ist die Fruchtkörperbildung strikt reguliert. Viele äußere Faktoren, wie z.B. das Nährstoffangebot oder Licht entscheiden über die Einleitung der sexuellen Entwicklung. Die Regulierungen und die morphogenetischen Veränderungen des Pilzes während dieses Prozesses sind bisher weitestgehend nicht untersucht. In dieser Arbeit wurden zwei putative Transkriptionsfaktoren, rosA („repressor of sexual development“) und nosA („no sex“), identifiziert und charakterisiert, die einen wichtigen Einfluss auf die sexuelle Entwicklung in A. nidulans haben. Beide gehören zu der Familie der Zn(II)2Cys6 binukleären Clusterproteine. Im Fall von nosA hat sich gezeigt, dass dieser Regulator für die funktionsfähige sexuelle Reproduktion essentiell ist. Die Einleitung der sexuellen Entwicklung ist nicht betroffen, doch bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt stoppt dieser Prozess. Der Effekt der geblockten sexuellen Entwicklung ist nicht 100%ig, da noch in sehr geringen Mengen Fruchtkörper gebildet werden. Diese weisen allerdings nur noch ein Bruchteil der Größe von Kleistothezien eines Wildtyps auf. Es konnte gezeigt werden, dass die Transkription zweier Gene der sexuellen Entwicklung, cpeA und hxtA, von nosA abhängig ist. Da die Überexpression eines bereits beschriebenen Regulators, nsdD, den Effekt der Deletion von nosA nicht ausgleichen konnte, wurde geschlossen, dass NosA in der Regulationskaskade NsdD nachgeschaltet ist oder in parallelen Wegen fungiert. Im Fall des zweiten Transkriptionsfaktors rosA wurde gezeigt, dass dieser Regulator als ein Repressor der sexuellen Entwicklung fungiert. Er verhindert die Einleitung der sexuellen Entwicklung in Flüssigkulturen, sowie auf Medien mit niedrigen Glukose-Konzentrationen. In Flüssigkultur wirkt RosA als ein Repressor der bereits bekannten Regulatoren veA, nsdD, stuA und auch nosA. RosA kann im Kern lokalisieren, jedoch wird der Kerneintritt offensichtlich durch eine Region im Mittelteil des Proteins erschwert, bzw. verhindert. Diese Region konnte auf ca. 150 Aminosäuren eingeengt werden. Diese Befunde weisen auf eine postranskriptionelle Regulation des Proteins hin. Neben der Charakterisierung von rosA und nosA erfolgte ein ungerichteter Ansatz zur Identifizierung von Proteinen, die während der Fruchtkörperbildung differenziell exprimiert werden. Dies geschah mit einem Vergleich von Proteinmustern zu zwei verschiedenen Zeitpunkten der Entwicklung, jeweils im Wildtyp und zwei Entwicklungsmutanten. Eine der untersuchten Mutanten, die ?nsdD-Mutante, bildet nur asexuelle Sporen und es findet keine sexuelle Entwicklung statt. Die zweite Mutante war die in dieser Arbeit charakterisierte ?nosA-Mutante, in der die sexuelle Differenzierung zu einem frühen Zeitpunkt stoppt. So war ein Vergleich zwischen früher und später sexueller und asexueller Entwicklung möglich. Zusätzlich konnten potentielle Zielproteine des Regulators NosA gefunden werden. Die Auftrennung der Proteine erfolgte mittels 2D-Gelelektrophorese. Es wurden starke Unterschiede in den Proteinmustern der verschiedenen Entwicklungsstadien gefunden. Einige der differenziell exprimierten Proteine konnten mittels Massenspektroskopie identifiziert werden. Darunter befanden sich unbeschrieben Proteine mit einer möglichen Funktion in der Fruchtkörperbildung (z.B. zwei 14-3-3 Proteine). Außerdem fanden sich Proteine, deren Funktion in der sexuellen Entwicklung bereits bekannt ist (CpeA); sowie bereits beschriebene Proteine, deren mögliche Rolle in der sexuellen Entwicklung neu ist (CatB)

Grundwasser - Altlasten - Boden aktuell

Neun Fachbeiträge dokumentieren die Ergebnisse der aktuellen Projekt- und Forschungsarbeit des Landesamtes in den Themenbereichen Grundwasser, Altlasten und Boden

Sequencing of \u3ci\u3eAspergillus nidulans\u3c/i\u3e and comparative analysis with \u3ci\u3eA. fumigatus\u3c/i\u3e and \u3ci\u3eA. oryzae\u3c/i\u3e

The aspergilli comprise a diverse group of filamentous fungi spanning over 200 million years of evolution. Here we report the genome sequence of the model organism Aspergillus nidulans, and a comparative study with Aspergillus fumigatus, a serious human pathogen, and Aspergillus oryzae, used in the production of sake, miso, and soy sauce. Our analysis of genome structure provided a quantitative evaluation of forces driving long-term eukaryotic genome evolution. It also led to an experimentally validated model of mating-type locus evolution, suggesting the potential for sexual reproduction in A. fumigatus and A. oryzae. Our analysis of sequence conservation revealed over 5,000 non-coding regions actively conserved across all three species. Within these regions, we identified potential functional elements including a previously uncharacterized TPP riboswitch and motifs suggesting regulation in filamentous fungi by Puf family genes. We further obtained comparative and experimental evidence indicating widespread translational regulation by upstream open reading frames. These results enhance our understanding of these widely studied fungi as well as provide new insight into eukaryotic genome evolution and gene regulation. Document includes all supplementary information (820 pages). Supplementary files are also attached below as Related files. THERE IS NO SUPPLEMENTARY FILE #7. PDF file size (with supplementary files included) is 10 Mbytes. An optimized version of the ARTICLE ONLY is attached as a Related File and is 1.9 Mbytes

Sequencing of \u3ci\u3eAspergillus nidulans\u3c/i\u3e and comparative analysis with \u3ci\u3eA. fumigatus\u3c/i\u3e and \u3ci\u3eA. oryzae\u3c/i\u3e

The aspergilli comprise a diverse group of filamentous fungi spanning over 200 million years of evolution. Here we report the genome sequence of the model organism Aspergillus nidulans, and a comparative study with Aspergillus fumigatus, a serious human pathogen, and Aspergillus oryzae, used in the production of sake, miso, and soy sauce. Our analysis of genome structure provided a quantitative evaluation of forces driving long-term eukaryotic genome evolution. It also led to an experimentally validated model of mating-type locus evolution, suggesting the potential for sexual reproduction in A. fumigatus and A. oryzae. Our analysis of sequence conservation revealed over 5,000 non-coding regions actively conserved across all three species. Within these regions, we identified potential functional elements including a previously uncharacterized TPP riboswitch and motifs suggesting regulation in filamentous fungi by Puf family genes. We further obtained comparative and experimental evidence indicating widespread translational regulation by upstream open reading frames. These results enhance our understanding of these widely studied fungi as well as provide new insight into eukaryotic genome evolution and gene regulation. Document includes all supplementary information (820 pages). Supplementary files are also attached below as Related files. THERE IS NO SUPPLEMENTARY FILE #7. PDF file size (with supplementary files included) is 10 Mbytes. An optimized version of the ARTICLE ONLY is attached as a Related File and is 1.9 Mbytes

The Zn(II)(2)Cys(6) Putative Aspergillus nidulans Transcription Factor Repressor of Sexual Development Inhibits Sexual Development Under Low-Carbon Conditions and in Submersed Culture

Here we have characterized the putative Zn(II)(2)Cys(6) transcription factor RosA from the filamentous fungus Aspergillus nidulans. The rosA gene encodes a protein of 713 aa, which shares 38% sequence similarity to Pro1 from Sordaria macrospora. In contrast to Pro1, which promotes the transition from protoperithecia to perithecia, RosA is a negative regulator of sexual development in A. nidulans. Transcript levels of rosA were usually very low and were only transiently upregulated upon carbon starvation and at 12 hr of asexual development. Deletion of rosA only slightly induced fruiting-body formation under standard culture conditions, but enabled sexual development under low-glucose and high-osmolarity conditions and the production of Hülle cells under submersed growth conditions. Stimulation of fruiting-body formation on agar surfaces was dependent on veA. In ΔrosA strains, transcript levels of the sexual developmental regulators nsdD, veA, and stuA were increased. Overexpression of rosA led to a reduction of hyphal growth and to a fluffy phenotype. Post-transcriptional regulation of RosA, with a regulated accumulation in the nucleus, was shown using a RosA-GFP fusion protein. We propose that RosA represses sexual development upon integration of several environmental signals

Use of Laccase as a Novel, Versatile Reporter System in Filamentous Fungi

Laccases are copper-containing enzymes which oxidize phenolic substrates and transfer the electrons to oxygen. Many filamentous fungi contain several laccase-encoding genes, but their biological roles are mostly not well understood. The main interest in laccases in biotechnology is their potential to be used to detoxify phenolic substances. We report here on a novel application of laccases as a reporter system in fungi. We purified a laccase enzyme from the ligno-cellulolytic ascomycete Stachybotrys chartarum. It oxidized the artificial substrate 2,2′-azino-di-(3-ethylbenzthiazolinsulfonate) (ABTS). The corresponding gene was isolated and expressed in Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, and Trichoderma reesei. Heterologously expressed laccase activity was monitored in colorimetric enzyme assays and on agar plates with ABTS as a substrate. The use of laccase as a reporter was shown in a genetic screen for the isolation of improved T. reesei cellulase production strains. In addition to the laccase from S. charatarum, we tested the application of three laccases from A. nidulans (LccB, LccC, and LccD) as reporters. Whereas LccC oxidized ABTS (K(m) = 0.3 mM), LccD did not react with ABTS but with DMA/ADBP (3,5-dimethylaniline/4-amino-2,6-dibromophenol). LccB reacted with DMA/ADBP and showed weak activity with ABTS. The different catalytic properties of LccC and LccD allow simultaneous use of these two laccases as reporters in one fungal strain

Development of an Automated, High-Throughput Bactericidal Assay That Measures Cellular Respiration as a Survival Readout for Neisseria meningitidis▿

Complement-mediated bactericidal activity has long been regarded as the serological correlate of protective immunity against Neisseria meningitidis. This was affirmed in 2005 at a WHO-sponsored meningococcal serology standardization workshop. The assay currently employed by most laboratories involves determining surviving bacterial colony counts on agar as a readout which is labor-intensive, time-consuming, and not amendable to rapid data analysis for clinical trials. Consequently, there is an acute need to develop a sensitive, high-throughput bactericidal assay to enable a rapid and robust assessment of the effectiveness of vaccine candidates. To this end, we have developed an automated, kinetic assay based on the fluorescent respiration product of resazurin which reduces assay volume, shortens assay time, and facilitates automation of data analysis. We demonstrate proof of concept for applicability of this high-throughput system with multiple meningococcal strains and utilizing different lots of human complement. The assay is robust and highly reproducible. Titers obtained by the fluorescence readout method are strongly correlated with the data obtained using the conventional, agar plate-based assay. These results demonstrate that the detection of bacteria that have survived the bactericidal reaction by measuring metabolic activity using a fluorescent dye as an alternative readout is a promising approach for the development of a high-throughput bactericidal assay