Involvement of proteasome activation

Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia worldwide, characterized by a progressive decline in a variety of cognitive and non-cognitive functions. The amyloid beta protein cascade hypothesis places the formation of amyloid beta protein aggregates on the first position in the complex pathological cascade leading to neurodegeneration, and therefore AD might be considered to be a protein-misfolding disease. The Ubiquitin Proteasome System (UPS), being the primary protein degradation mechanism with a fundamental role in the maintenance of proteostasis, has been identified as a putative therapeutic target to delay and/or to decelerate the progression of neurodegenerative disorders that are characterized by accumulated/aggregated proteins. The purpose of this study was to test if the activation of proteasome in vivo can alleviate AD pathology. Specifically by using two compounds with complementary modes of proteasome activation and documented antioxidant and redox regulating properties in the 5xFAD transgenic mice model of AD, we ameliorated a number of AD related deficits. Shortly after proteasome activation we detected significantly reduced amyloid-beta load correlated with improved motor functions, reduced anxiety and frailty level. Essentially, to our knowledge this is the first report to demonstrate a dual activation of the proteasome and its downstream effects. In conclusion, these findings open up new directions for future therapeutic potential of proteasome-mediated proteolysis enhancement.publishersversionpublishe

Study of the role of the proteasome in stem cell senescence

Aging is a complex multifactorial phenomenon, characterized by a gradual decline of defense mechanisms, reduced regenerative capacity of all tissues and organs, and an exponential accumulation of damage at the molecular, cellular and organismal level. Adult stem cells are critical for rejuvenating tissues and the age-associated demise of their function contributes to the physiological decline of homeostasis during ageing, leading to tissue degeneration. The proteasome, being the main cellular proteolytic system, plays a key role in the maintenance of protein homeostasis and its failure is associated with various biological phenomena including cellular senescence and ageing. Even though stem cell biology has attracted intense attention during the recent years, the role of proteasome in stemness and in the age-dependent deterioration of stem cell function remains largely unclear. In order to shed light on this process, we employed both Wharton-jelly and Adipose derived adult mesenchymal stem cells (hMSCs). We revealed a significant age-related decline in proteasome content and peptidase activities, accompanied by alterations of proteasomal complexes. Additionally, we show that senescence and the concomitant failure of proteostasis negatively affects the expression of the core pluripotency factors and the cellular differentiation capability. Remarkably, the overexpression of the β5 catalytic subunit, activated and sustained the function of the proteasome during stem cell senescence, resulting in a significant enhancement of their lifespan and counteracting the senescence-related loss of their stemness. In addition, proteasome activation lessened the telomere attrition during the extended culture and eliminated the senescence-associated accumulation of oxidised proteins. We also identified several novel compounds with antioxidant properties or with the ability to activate the proteasome and extend the lifespan of hMSC. At the mechanistic level, our study revealed a previously unrecognized connection between pluripotency factors and the proteasome machinery in hMSCs. Specifically, we demonstrated for the first time that Oct4 binds at the promoter region of β2 and β5 proteasome subunits and thus possibly regulates their expression. A firm understanding of the mechanisms regulating proteostasis in stem cells will pave the way to innovative stem cell-based interventions to improve healthspan and lifespan.Η γήρανση αποτελεί ένα σύνθετο πολυπαραγοντικό φαινόμενο, το οποίο χαρακτηρίζεται από σταδιακή μείωση των αμυντικών μηχανισμών, μειωμένη αναγεννητική ικανότητα όλων των ιστών και οργάνων και εκθετική συσσώρευση βλαβών σε μοριακό, κυτταρικό και οργανισμικό επίπεδο. Τα βλαστικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για την ιστική ανανέωση και η απώλεια της λειτουργικότητάς τους συμβάλλει στη γήρανση των ιστών. Το πρωτεάσωμα, καθώς είναι το κύριο κυτταρικό πρωτεολυτικό σύστημα, διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο στη διατήρηση της πρωτεόστασης. Οι αλλοιώσεις του πρωτεασώματος συνδέονται με διάφορα βιολογικά φαινόμενα συμπεριλαμβανομένης της γήρανσης. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο του πρωτεασώματος και των άλλων αντιοξειδωτικών αποκρίσεων στη γήρανση των βλαστικών κυττάρων. Προκειμένου να αποκρυπτογραφηθούν αυτές οι διεργασίες, χρησιμοποιήθηκαν μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (hMSCs) που προέρχονταν από τη ζελατινώδη ουσία του Wharton (WJ-MSCs) και από το λιπώδη ιστό (ASCs). Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης, παρατηρήθηκε μια σημαντική ελάττωση σε όλες τις ενεργότητες πεπτιδάσης του πρωτεασώματος, συνοδευόμενη από μείωση της έκφρασης των υπομονάδων και τροποποιήσεις των πρωτεασωμικών συμπλόκων στα γηρασμένα hMSCs. Ταυτόχρονα, τόσο τα επίπεδα έκφρασης χαρακτηριστικών δεικτών πολυδυναμικότητας, όσο και η ικανότητα διαφοροποίησης των hMSCs μειώνεται κατά τη διάρκεια της γήρανσης τους. Καθώς η γήρανση των βλαστοκυττάρων χαρακτηρίζεται από μειωμένο πρωτεασωμικό περιεχόμενο και από τις επακόλουθες διαταραχές της πρωτεόστασης, η διατήρηση της λειτουργίας του πρωτεασώματος ενδεχομένως θα μπορούσε να καθυστερήσει την πρόοδό της. Προς αυτή την κατεύθυνση, πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση της β5 καταλυτικής υπομονάδας του πρωτεασώματος σε WJ-MSCs και διαπιστώθηκε ότι ήταν αρκετή για να αυξήσει και να διατηρήσει τις πρωτεασωμικές λειτουργίες κατά τη γήρανση και ακολούθως να αυξήσει την αναδιπλασιαστική διάρκεια ζωής και την πολυδυναμικότητά τους. Ταυτόχρονα, η ενεργοποίηση του πρωτεασώματος άμβλυνε τη μείωση του μήκους των τελομερών κατά την εκτεταμένη καλλιέργεια των βλαστικών κυττάρων και εξάλειψε τη σχετιζόμενη με την αναδιπλασιαστική γήρανση, αύξηση των επιπέδων των οξειδωτικά τροποποιημένων πρωτεϊνών. Προς την ίδια κατεύθυνση, ταυτοποιήθηκαν νέες αντιοξειδωτικές ενώσεις και νέοι ενεργοποιητές του πρωτεασώματος με ικανότητα να καθυστερούν τη γήρανση των βλαστικών κυττάρων. Τέλος, διαπιστώθηκε μια νέα σύνδεση μεταξύ των παραγόντων πολυδυναμικότητας και του πρωτεασώματος. Συγκεκριμένα, αποκαλύφθηκε για πρώτη φορά η ύπαρξη ενεργών σημείων πρόσδεσης του κεντρικού παράγοντα πολυδυναμικότητας Oct4 στους υποκινητές των γονιδίων των πρωτεασωμικών υπομονάδων β2 και β5 και ως εκ τούτου ενδεχομένως συμμετέχει τη ρύθμιση της έκφρασης τους. Η κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν την πρωτεόσταση στα βλαστικά κύτταρα θα ανοίξει το δρόμο σε καινοτόμες βασιζόμενες σε βλαστοκύτταρα παρεμβάσεις, οι οποίες θα αποσκοπούν στη θεραπεία ηλικιοεξαρτώμενων ασθενειών και στη βελτίωση της διάρκειας ζωής

Μελέτη του ρόλου του πρωτεασώματος στη γήρανση βλαστικών κυττάρων

Η γήρανση αποτελεί ένα σύνθετο πολυπαραγοντικό φαινόμενο, το οποίο χαρακτηρίζεται από σταδιακή μείωση των αμυντικών μηχανισμών, μειωμένη αναγεννητική ικανότητα όλων των ιστών και οργάνων και εκθετική συσσώρευση βλαβών σε μοριακό, κυτταρικό και οργανισμικό επίπεδο. Τα βλαστικά κύτταρα είναι υπεύθυνα για την ιστική ανανέωση και η απώλεια της λειτουργικότητάς τους συμβάλλει στη γήρανση των ιστών. Το πρωτεάσωμα, καθώς είναι το κύριο κυτταρικό πρωτεολυτικό σύστημα, διαδραματίζει θεμελιώδη ρόλο στη διατήρηση της πρωτεόστασης. Οι αλλοιώσεις του πρωτεασώματος συνδέονται με διάφορα βιολογικά φαινόμενα συμπεριλαμβανομένης της γήρανσης. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το ρόλο του πρωτεασώματος και των άλλων αντιοξειδωτικών αποκρίσεων στη γήρανση των βλαστικών κυττάρων. Προκειμένου να αποκρυπτογραφηθούν αυτές οι διεργασίες, χρησιμοποιήθηκαν μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (hMSCs) που προέρχονταν από τη ζελατινώδη ουσία του Wharton (WJ-MSCs) και από το λιπώδη ιστό (ASCs). Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης, παρατηρήθηκε μια σημαντική ελάττωση σε όλες τις ενεργότητες πεπτιδάσης του πρωτεασώματος, συνοδευόμενη από μείωση της έκφρασης των υπομονάδων και τροποποιήσεις των πρωτεασωμικών συμπλόκων στα γηρασμένα hMSCs. Ταυτόχρονα, τόσο τα επίπεδα έκφρασης χαρακτηριστικών δεικτών πολυδυναμικότητας, όσο και η ικανότητα διαφοροποίησης των hMSCs μειώνεται κατά τη διάρκεια της γήρανσης τους. Καθώς η γήρανση των βλαστοκυττάρων χαρακτηρίζεται από μειωμένο πρωτεασωμικό περιεχόμενο και από τις επακόλουθες διαταραχές της πρωτεόστασης, η διατήρηση της λειτουργίας του πρωτεασώματος ενδεχομένως θα μπορούσε να καθυστερήσει την πρόοδό της. Προς αυτή την κατεύθυνση, πραγματοποιήθηκε υπερέκφραση της β5 καταλυτικής υπομονάδας του πρωτεασώματος σε WJ-MSCs και διαπιστώθηκε ότι ήταν αρκετή για να αυξήσει και να διατηρήσει τις πρωτεασωμικές λειτουργίες κατά τη γήρανση και ακολούθως να αυξήσει την αναδιπλασιαστική διάρκεια ζωής και την πολυδυναμικότητά τους. Ταυτόχρονα, η ενεργοποίηση του πρωτεασώματος άμβλυνε τη μείωση του μήκους των τελομερών κατά την εκτεταμένη καλλιέργεια των βλαστικών κυττάρων και εξάλειψε τη σχετιζόμενη με την αναδιπλασιαστική γήρανση, αύξηση των επιπέδων των οξειδωτικά τροποποιημένων πρωτεϊνών. Προς την ίδια κατεύθυνση, ταυτοποιήθηκαν νέες αντιοξειδωτικές ενώσεις και νέοι ενεργοποιητές του πρωτεασώματος με ικανότητα να καθυστερούν τη γήρανση των βλαστικών κυττάρων. Τέλος, διαπιστώθηκε μια νέα σύνδεση μεταξύ των παραγόντων πολυδυναμικότητας και του πρωτεασώματος. Συγκεκριμένα, αποκαλύφθηκε για πρώτη φορά η ύπαρξη ενεργών σημείων πρόσδεσης του κεντρικού παράγοντα πολυδυναμικότητας Oct4 στους υποκινητές των γονιδίων των πρωτεασωμικών υπομονάδων β2 και β5 και ως εκ τούτου ενδεχομένως συμμετέχει τη ρύθμιση της έκφρασης τους. Η κατανόηση των μηχανισμών που ρυθμίζουν την πρωτεόσταση στα βλαστικά κύτταρα θα ανοίξει το δρόμο σε καινοτόμες βασιζόμενες σε βλαστοκύτταρα παρεμβάσεις, οι οποίες θα αποσκοπούν στη θεραπεία ηλικιοεξαρτώμενων ασθενειών και στη βελτίωση της διάρκειας ζωής.Aging is a complex multifactorial phenomenon, characterized by a gradual decline of defense mechanisms, reduced regenerative capacity of all tissues and organs, and an exponential accumulation of damage at the molecular, cellular and organismal level. Adult stem cells are critical for rejuvenating tissues and the age-associated demise of their function contributes to the physiological decline of homeostasis during ageing, leading to tissue degeneration. The proteasome, being the main cellular proteolytic system, plays a key role in the maintenance of protein homeostasis and its failure is associated with various biological phenomena including cellular senescence and ageing. Even though stem cell biology has attracted intense attention during the recent years, the role of proteasome in stemness and in the age-dependent deterioration of stem cell function remains largely unclear.  In order to shed light on this process, we employed both Wharton-jelly and Adipose derived adult mesenchymal stem cells (hMSCs). We revealed a significant age-related decline in proteasome content and peptidase activities, accompanied by alterations of proteasomal complexes. Additionally, we show that senescence and the concomitant failure of proteostasis negatively affects the expression of the core pluripotency factors and the cellular differentiation capability. Remarkably, the overexpression of the β5 catalytic subunit, activated and sustained the function of the proteasome during stem cell senescence, resulting in a significant enhancement of their lifespan and counteracting the senescence-related loss of their stemness. In addition, proteasome activation lessened the telomere attrition during the extended culture and eliminated the senescence-associated accumulation of oxidised proteins. We also identified several novel compounds with antioxidant properties or with the ability to activate the proteasome and extend the lifespan of hMSC. At the mechanistic level, our study revealed a previously unrecognized connection between pluripotency factors and the proteasome machinery in hMSCs. Specifically, we demonstrated for the first time that Oct4 binds at the promoter region of β2 and β5 proteasome subunits and thus possibly regulates their expression. A firm understanding of the mechanisms regulating proteostasis in stem cells will pave the way to innovative stem cell-based interventions to improve healthspan and lifespan

Antioxidant and Antiaging Properties of a Novel Synergistic Nutraceutical Complex: Readouts from an In Cellulo Study and an In Vivo Prospective, Randomized Trial

Aging is a dynamic procedure that is developed in multiple layers and characterized by distinct hallmarks. The use of biomarkers that target different hallmarks of aging is substantial in predicting adverse outcomes during the aging process, implementing specifically designed antiaging interventions and monitoring responses to these interventions. The present study aimed to develop a novel composition of plant extracts, comprising identified active ingredients that synergistically target different hallmarks of aging in cellulo and in vivo. The selected single extracts and the developed composition were tested through a powerful set of biomarkers that we have previously identified and studied. The composition of selected extracts simultaneously increased cellular lifespan, reduced the cellular oxidative load and enhanced antioxidant defense mechanisms by increasing proteasome activity and content. In addition, the combination prevented telomere attrition and preserved optimum DNA methylation levels. Remarkably, biomarker profiling of healthy volunteers who received the identified combination in the form of a nutritional supplement within the frame of a prospective, randomized, controlled 3-month trial revealed an unprecedented antioxidant capacity in humans. In conclusion, our results support the notion that interventions with specifically designed combinations of natural compounds targeting multiple hallmarks of aging represent an effective way to improve healthspan and well-being

Diverse Functions of mRNA Metabolism Factors in Stress Defense and Aging of <i>Caenorhabditis elegans</i>

<div><p>Processing bodies (PBs) and stress granules (SGs) are related, cytoplasmic RNA-protein complexes that contribute to post-transcriptional gene regulation in all eukaryotic cells. Both structures contain translationally repressed mRNAs and several proteins involved in silencing, stabilization or degradation of mRNAs, especially under environmental stress. Here, we monitored the dynamic formation of PBs and SGs, in somatic cells of adult worms, using fluorescently tagged protein markers of each complex. Both complexes were accumulated in response to various stress conditions, but distinct modes of SG formation were induced, depending on the insult. We also observed an age-dependent accumulation of PBs but not of SGs. We further showed that direct alterations in PB-related genes can influence aging and normal stress responses, beyond their developmental role. In addition, disruption of SG-related genes had diverse effects on development, fertility, lifespan and stress resistance of worms. Our work therefore underlines the important roles of mRNA metabolism factors in several vital cellular processes and provides insight into their diverse functions in a multicellular organism.</p></div

Aggregation of DCAP-1 protein in response to heat-shock.

<p>(A) Representative confocal images of somatic tissues in 1-day adult worms expressing the transcriptional fusion <i>P_dcap-1</i>::<i>gfp</i> (BRF154) or the translational fusion <i>dcap-1::gfp</i> in N2 (BRF155 and BRF261) and germline-deficient <i>glp-1(e2141)</i> worms (BRF219), normally grown at 25°C (-HS) or transiently subjected to heat-shock (+HS, 35°C for 3 h). Arrows point to DCAP-1::GFP granules in body wall muscles that are highly induced upon stress. Asterisks denote the intestinal autofluorescence. Scale bar: 25 µm. (B) Quantification of data in (A). Values on Y axis show the number of granules per 2500 µm² per worm (mean±SD, see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#s2" target="_blank">Materials and Methods</a> and <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#pone.0103365.s012" target="_blank">Table S4</a>). (C) Endogenous <i>dcap-1</i>(mRNA) levels in 1-day adults N2, grown at 25°C before (-HS) or after heat shock (+HS, 35°C for 3 h) were measured by quantitative RT-PCR and normalized to endogenous <i>ama-1(mRNA)</i> levels. Error bars represent the standard deviation of the means of five independent experiments (p-value = 0.3466, calculated by Student's <i>t</i>-test). (D) Western blot analysis of DCAP-1::GFP protein expression in 1-day adult BRF155 transgenic animals, before (-HS) or after heat shock (+HS), using anti-GFP or anti-Actin (as a loading control) antibodies. Band intensity of DCAP-1::GFP normalized to actin gives a value of 0.83, showing similar protein levels in the two conditions.</p

Disruption of mRNA degradation, but not of translation factors, triggers PBs formation that lack <i>ife-2</i>/eIF4E.

<p>(A) Representative confocal images of 1-day adults expressing <i>dcap-1::gfp</i> in N2 (BRF155 and BRF261) fed with <i>ife-2(RNAi)</i>, <i>eIF2a(RNAi), rsks-1(RNAi), eIF2Bγ(RNAi)</i> or <i>xrn-1(RNAi)</i> bacteria. (B) Quantification of data in (A). Values on Y axis show the number of granules per 2500 µm² per worm (mean±SD, see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#s2" target="_blank">Materials and Methods</a> and <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#pone.0103365.s012" target="_blank">Table S4</a>). (C) Endogenous <i>eIF2Bγ</i>(mRNA) levels in 1-day adults BRF155 worms grown at 25°C and fed with <i>eIF2Bγ(RNAi)</i> from eggs, were measured by quantitative RT-PCR and normalized to <i>ama-1(mRNA)</i> levels. Error bars represent the standard deviation of the means of three independent experiments (***p-value<0.0001, in unpaired <i>t</i>-test). (D) Representative confocal images of 1-day adults expressing <i>dcap-1::gfp</i> in N2 (BRF155) or <i>ife-2(ok306)</i> (BRF220) background. (E) Representative confocal images of 1-day adults co-expressing <i>dcap-1::rfp</i> and <i>ife-2::gfp</i> (BRF313), and treated with <i>xrn-1(RNAi)</i> to monitor the lack of co-localization of the two proteins. In all cases, targeted RNAi was initiated from eggs at 25°C in parallel with Control(RNAi) to assess the localization of DCAP-1::GFP into PBs. Asterisks show the intestinal autofluorescence. Scale bar: 25 µm.</p

PB components are important for normal lifespan and stress response.

<p>(A) Survival curves of N2, <i>dcap-1</i> and <i>dcap-2</i> mutants at 20°C. (B) Survival of adults <i>dcap-1</i> and <i>dcap-2</i> mutants in heat-shock (1-day adults at 35°C for 6 h), oxidative stress (1-day adults in 5 mM sodium arsenite for 48 h) and UV-irradiation (5-day adults at 0.2 J/cm²), compared to N2. (C) Survival curves of N2 worms treated post-developmentally with <i>dcap-1/-2(RNAi)</i>, <i>patr-1(RNAi)</i> or <i>xrn-1(RNAi)</i> at 20°C. (D) Lifespan of <i>daf-2</i>, <i>daf-2; dcap-1</i> and <i>daf-2; dcap-</i>2 mutants at 20°C and (E) survival of 1-day adults after heat-shock (35°C for 8 h). (F) Survival of 1-day adult <i>glp-1</i> germline-deficient mutants that overexpress <i>dcap-1::gfp</i> after heat-shock (at 35°C for 6 h) or oxidative stress (5 mM sodium arsenite for 48 h). In lifespan assays the p-values were determined using the log-rank test (see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#pone.0103365.s013" target="_blank">Tables S5</a> and <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#pone.0103365.s014" target="_blank">S6</a>) and in stress assays the error bars show the SD in unpaired <i>t</i>-tests (see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#s2" target="_blank">Materials and Methods</a>). ** indicates very significant (p-value 0.001 to 0.01); *** indicates extremely significant (p<0.001).</p

Accumulation of DCAP-1-containing granules under heat-shock is rapid, reversible and sensitive to <i>cgh-1(RNAi)</i>.

<p>(A) Representative confocal images of 1-day adult worms expressing <i>dcap-1::gfp</i> (BRF155 and BRF261 strains) normally grown at 25°C (-HS) or transiently subjected to heat-shock (+HS, 35°C for 3 h),following recovery for 3 h at 20°C (Recovery). (B) Quantification of data in (A). (C) Representative confocal images of 1-day adult worms expressing <i>dcap-1::gfp</i> (BRF155) fed from eggs with Control(RNAi) or <i>cgh-1(RNAi)</i> bacteria and grown at 25°C (-HS) or subjected to heat-shock at 35°C for 3 h (+HS). In all cases arrows point to DCAP-1::GFP granules in body wall muscles. (D). Quantification of data in (C). Values on Y axis show the number of granules per 2500 µm² per worm (mean±SD, see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#s2" target="_blank">Materials and Methods</a> and <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#pone.0103365.s012" target="_blank">Table S4</a>). Scale bar: 25 µm.</p

Effects of <i>tiar</i> genes deletion on development, fertility, lifespan and stress survival.

<p>(A) Developmental rate and brood size of <i>tiar-1</i>, <i>tiar-2</i>, <i>tiar-3</i> and <i>tiar-1;tiar-2</i> mutant worms, compared to N2. (B) Survival curves of the above mutants or of N2 worms treated post-developmentally with <i>tiar-1(RNAi)</i>, <i>tiar-2(RNAi)</i> or <i>tiar-3(RNAi)</i>. (C) Survival of adults of the above mutants in oxidative stress (1-day adults at 5 mM sodium arsenite for 48 h), heat-shock (1-day adults at 35°C for 6 h), UV-irradiation (5-day adults at 0.2 J/cm²) or osmotic stress (1-day adults at 400 mM NaCl for 24 h, compared to N2. (D) Survival of <i>tiar-</i>1 mutants expressing the <i>gfp::tiar-1</i> rescuing transgene in oxidative stress (1-day adults at 5 mM sodium arsenite for 24 h) compared to N2 or <i>tiar-1</i> animals carrying only the <i>rol-6(su1006)</i> roller marker. In lifespan assays the p-values were determined using the log-rank test (see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#pone.0103365.s013" target="_blank">Tables S5</a> and <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#pone.0103365.s014" target="_blank">S6</a>) and in stress assays the error bars show the SD in unpaired <i>t</i>-tests (see <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0103365#s2" target="_blank">Materials and Methods</a>). ns indicates not significant (p>0.05); * indicates significant (p-value 0.01 to 0.05); ** indicates very significant (p-value 0.001 to 0.01); *** indicates extremely significant (p<0.001).</p