Caracterización parcial del epítope de fimbria K88ab de la Escherichia coli (ECET) reconocido por un anticuerpo monoclonal dirigido hacia la adhesina

A conformable epitope was partially characterized at  the  “b” region of enterotoxigenic Escherichia coli K88ab.  The epitope is recognized by the  monoclonal antibody secreted by  the   hybridoma  11/70.   The   specificity  of  the   monoclonal  antibody  for  antigen detection,  was defined by the  ELISA test  and  agglutination  with  fimbrial  bacteria.  Mab 11/70  proved  its usefulness to design diagnosis systems for epizootiological studies as an essential tool for vaccination against ETEC strains in swine breeding farms.  Se  caracterizó parcialmente un epítope conformacional, localizado en la región “b” de la K88ab  de  la  Escherichia  coli  enterotoxigénica,  que  es reconocido por  el  anticuerpo monoclonal   secretado  por   el   hibridoma   11/70.    La   especificidad   del   anticuerpo monoclonal  fue  definida  por  ensayos  tipo  ELISA  y  por  aglutinación  con  bacterias portadoras de fimbrias, para  la detección del antígeno. Ello demostró que  el AcM 11/70 es útil  para   ser empleado  en  el  diseño  de  sistemas de  diagnóstico  dirigidos  a  la realización de  estudios epizooteilógicos, como  una  herramienta ineludible a la hora  de aplicar vacunas contra  cepas de ECET en las granjas porcinas

Contraception and immunocastration vaccines. Use in veterinary medicine

Globally, development and application of vaccines to control fertility in animals is growing relentlessly. Their productive benefits to animal management and welfare are corroborated, while improvement in public perception on their positive impact. This paper reviews current developments in this area, particularly, immunocastration vaccines, upon assessment of application results in recent years. Main targets of these vaccines are proteins of the zona pellucida, the structural proteins of spermatozoa as well as the sexual hormones. Various GnRH-based vaccines with proven effectiveness and efficiency for immunocastration of males and fertility control in females are commercially available today. However, issues like a reduction in the number of immunizations, achieving of increased immunogenicity, and the development new formulations to facilitate the application and release of vaccines in the wide diversity of the animal habitats and in the different conditions of animal husbandry, should be addressed. Fertility control relied on methods that guarantee productive efficiency and animal welfare is an incessant need of modern veterinary medicine practice.A nivel mundial, el desarrollo y la aplicación de vacunas para controlar la fertilidad en los animales, está creciendo indeteniblemente. En los últimos años se han corroborado sus beneficios productivos para el manejo y el bienestar de los animales, lo que ha contribuido a mejorar la percepción pública sobre sus impactos. Este artículo revisa los avances obtenidos en este campo, en particular, las vacunas de inmunocastración, tras la evaluación de los resultados de su aplicación en los últimos años. Las principales dianas antigénicas de estas vacunas son las proteínas de la zona pelúcida, las proteínas estructurales de los espermatozoides y las hormonas sexuales. En la actualidad están disponibles en el mercado varias vacunas basadas en GnRH, con eficacia y eficiencia comprobadas para la inmunocastración de los machos y el control de la fertilidad en las hembras. Sin embargo, los investigadores deberán resolver cuestiones como la reducción del número de inmunizaciones, el logro de una mayor inmunogenicidad y el desarrollo de nuevas formulaciones para facilitar la aplicación y liberación de estas vacunas en los diversos hábitats donde transcurre la vida animal y en las diferentes condiciones de la crianza ganadera. El control de la fertilidad basado en métodos que garantizan la eficiencia productiva y el bienestar animal es una necesidad incesante de la práctica moderna de la medicina veterinaria

Caracterización de dos anticuerpos monoclonales hacia las fimbrias K99

K99   are   proteins   which   enhance  enterotoxigenic   Escherichia   coli   (ETEC) adhesion and  colonization in a host small bowel. These fimbriae are  commonly expressed through  swine and  bovine ETEC  strains. Two monoclonal antibodies to eliminate K99 fimbrial antigen were  obtained in order  to designed a number of systems for  diagnosing  different  fimbria  types expressed  through   ETEC.  The antigen   determinants   detected   by   the    two   monoclonal   antibodies   were characterized  by  immuno-enzimatic  tests  like  ELISA  using   related  antigens, epitope  competence  analysis,  referential  strains  agglutination  tests,  and   the Western Blot test.  The antigen determinant affinity constant was also found. The antibodies so obtained can  identify a comformable epitope in the original fimbria. Results proved  the antibodies usefulness in designing systems for the diagnosis and  control of K99 antigen production in vaccines.Las  fimbrias  K99  son   una   de   las  proteínas encargadas  de   la  adhesión  y colonización del intestino delgado del hospedero comúnmente expresadas  por cepas porcinas y bovinas de  Escherichia coli enterotoxigénica (ECET).  Con  el objetivo  de  diseñar  sistemas para   el  diagnóstico  de  los  diferentes  tipos  de fimbrias expresadas por las ECET,  se obtuvieron dos anticuerpos monoclonales contra  el  antígeno fimbrial  K99. Los determinantes  antigénicos  reconocidos por los dos anticuerpos fueron caracterizados por  ensayos inmunoenzimáticos tipo ELISA con antígenos relacionados, análisis de epítopes por competencia, experimentos  de  aglutinación  con  cepas referentes  y Western Blot;  también  se les  determinó  la  constante de  afinidad.  Los anticuerpos  obtenidos  reconocen a un   epítope  conformacional   presente  en   la   fimbria   nativa.   Los  resultados demuestran la utilidad de  estos anticuerpos para  el diseño de  sistemas para  el diagnóstico y el monitoreo de  la producción del antígeno K99 presente en  un preparado vacunal

Inmunodominancia del epítope “a”de las fimbrias K88

Escherichia coli strain showing K88 fimbria provoke the highest number of coli infections in newborn piglets around the world. Three serologically different K88 fimbria have been identified: K88ab, K88ac and K88 ad. Letter “a” refers to common epitopes carried by every serotype, while “b”, “c”, and “d” refer to epitopes having a specific serotype. Several monoclonal antibodies mostly joining to conformational epitopes present in region “a” from K88 fimbria were obtained. No matter the different conditions used for immunization, “a” continued being immunodomi- nant. Antibodies obtained from this region showed two different epitopes at least. The monoclonal antibodies could be used designing diagnosis systems.Las cepas de Escherichia coli enterotoxigénicas (ECET) que expresan la fimbria K88 son las que con mayor fre- cuencia mundial causan colibacilosis en cerdos neonatos. Se han identificado tres tipos de fimbrias K88 serológica- mente diferentes: K88ab, K88ac y K88ad. La designación “a” se refiere a epítopes comunes portados por todos los serotipos, mientras las denominaciones “b”, “c” y “d” se refieren a epítopes serotipo específicos. En este trabajo se expone la obtención de varios anticuerpos monoclonales que se unen mayoritariamente a epítopes conformacionales presentes en la región “a” de la fimbria K88. Esta región fue inmunodominante a pesar de las diferentes condiciones de inmunización usadas. Los anticuerpos obtenidos reconocen en la región ”a”, al menos dos epítopes diferentes. Los anticuerpos monoclonales generados pudieran ser empleados para el diseño de sistemas de diagnóstico

A general procedure for small-scale purification of fimbriae expressed by porcine enterotoxigenic escherichia coli strains

Fimbriae expression by enterotoxigenic Escherichia coli strains is a complex process which is controlled by global and local transcriptional regulators and post-transcriptional control. It is influenced by factors such as bacterial growth rate, culture medium composition, pH and temperature. Fimbrial expression could thus frequently become lost. Bacterial culture procedures favouring fimbrial expression are thus needed. The fimbriated bacterial population was therefore enriched by static culture in Mueller–Hinton broth. Fimbrial expression was then maintained by making it grow consecutively in agar CFA and Minca or minimal broth according to the fimbrial serotype. Maximum fimbrial expression was reached after 4h or 5h in culture. The fimbriae were extracted by heat -shock treatment and precipitated with 40% ammonium sulphate. Further purification was carried out by molecular exclusion and sodium deoxycholate treatment. This methodology integrates known procedures in a simple and reproducible process for obtaining F4, F5, F6 and F41 fimbriae in sufficient quantities for their subsequent use in producing antibodies, immunoassays and other studies (at laboratory level) requiring high-purity preparations (80%) to maintain their native structure. Key words: Enterotoxigenic Escherichia coli; fimbriae; Minca; minimal medium; CFA.La fimbriación en cepas de Escherichia coli enterotoxigénicas es un proceso complejo controlado por varios mecanismos: reguladores globales y locales de la transcripción y el control postranscripcional, e influenciado por factores como velocidad de crecimiento bacteriano, composición del medio de cultivo, temperatura y pH, entre otros. Estas características propician que la expresión fimbrial se pierda con alta frecuencia. De allí que se requieran procedimientos de cultivo que favorezcan el mantenimiento de dicha expresión. Con ese objetivo, en el trabajo la población bacteriana fimbriada se enriqueció mediante cultivo estático en caldo Mueller-Hinton. Luego, la expresión fimbrial se mantuvo mediante el crecimiento en forma consecutiva en agar CFA, y el caldo Minca o Mínimo, según el tipo fimbrial, en los que se alcanzó la máxima expresión a las 4-5h de cultivo. Las fimbrias se extrajeron mediante tratamiento térmico y se precipitaron con sulfato de amonio al 40%. La purificación se realizó mediante exclusión molecular y el tratamiento con deoxicolato de sodio. La metodología propuesta integra procedimientos conocidos en un proceso simple y reproducible para la obtención de las fimbrias F4, F5, F6 y F41 en cantidades suficientes para su posterior uso en la generación de anticuerpos, el desarrollo de inmunoensayos y otros estudios a escala de laboratorio, que necesiten de preparaciones con una pureza superior al 80%, que mantengan su estructura nativa. Palabras clave: Escherichia coli enterotoxigénica; fimbria; Minca; medio mínimo; CFA

Efectos sobre la fertilidad del cerdo de dos candidatos vacunales recombinantes basados en la GnRH

This paper describes for the first time the generation of the K88ab-GnRH hybrid fimbriae, the fusion of N. meningitidis P64k protein (P64k-GnRH), and its evaluation as vaccine candidates to control fertility in mammals. Twenty hybrid male pigs were randomly distributed in four groups: placebos and immunized with K88ab-GnRH, P64k-GnRH and a GnRH analogue (GnRHm1), linked to a tetanus toxoid (TT) T-helper epitope (positive control), respectively. The pigs were immunized at 9-10 weeks of age, using a two-dose scheme, and were sacrificed sixteen weeks later. K88ab-GnRH, P64k-GnRH, and GnRHm1-TT induced higher, similar, and lower testosterone levels in the serum, compared to the placebo, respectively. In the K88ab-GnRH group, the pigs underwent a reduction in testicle size and weight (P < 0.01), and the weight of epididymes compared to the placebo; none of them was able to ejaculate. In the P64k-GnRH group, the pigs had a reduction in testicle weight (P < 0.05), and only one of them was able to ejaculate. The testicles of the pigs immunized with K88ab-GnRH and P64k-GnRH showed structural and functional damage; spermatogenesis was also affected. The accessory sexual glands of the P64k-GnRH group were normal, in contrast to K88ab-GnRH, where interstitial fibrosis was observed. The damage caused by K88ab-GnRH and P64k-GnRH in the target organs evaluated were in all cases lower than the affectations caused by the GnRHm1-TT peptide.En este trabajo se describe, por primera vez, la obtención de la fimbria híbrida K88ab-GnRH, la fusión de la GnRH a la proteína P64k de N. meningitidis (P64k-GnRH) y su evaluación como candidatos vacunales para controlar la fertilidad en mamíferos. Veinte cerdos machos híbridos fueron asignados al azar a cuatro grupos: placebo e inmunizados con K88ab-GnRH, P64k-GnRH y con un péptido análogo de GnRH (GnRHm1), unido a un epítopo T cooperador del toxoide tetánico (TT) (control positivo), respectivamente. Los cerdos se inmunizaron con 9-10 semanas de edad, en un esquema de 2 dosis y se sacrificaron 16 semanas después. K88ab-GnRH, P64k-GnRH y GnRHm1-TT indujeron niveles de testosterona en suero, mayor, similar y menor, comparados con el placebo, respectivamente. En el grupo K88ab-GnRH los cerdos disminuyeron (P < 0,01) el largo y peso de los testículos y el peso de los epidídimos, comparado con el placebo y ninguno llegó a eyacular. En el grupo P64k-GnRH los cerdos disminuyeron el peso de los testículos (P < 0,05), y sólo uno llegó a eyacular. Los testículos de los cerdos inmunizados con K88ab-GnRH y P64k-GnRH mostraron daños estructurales, funcionales y afectación de la espermatogénesis. Las glándulas sexuales accesorias del grupo P64k-GnRH estaban normales a diferencia de K88ab-GnRH, en las que se observó fibrosis intersticial. Los daños provocados por K88ab-GnRH y P64k-GnRH en los órganos diana evaluados, resultaron inferiores en todos los casos, a las afectaciones que generó el péptido GnRHm1-TT

Gradual reduction of testosterone using a gonadotropin-releasing hormone vaccination delays castration resistance in a prostate cancer model

In a previous study aimed to design a novel prostate cancer vaccine, the authors of the present study demonstrated the advantage of combining the adjuvants Montanide ISA 51 with very small size proteoliposomes (VSSP) to promote a significant humoral immune response to gonadotropin‑releasing hormone (GnRH) in healthy animals. The present study compared the efficacy of this vaccine formulation versus the standard treatment currently available in terms of preventing the development of tumors in DD/S mice injected with Shionogi carcinoma (SC) 115 cells. The results demonstrated that 5 non‑vaccinated control mice exhibited a fast tumor growth, and succumbed to the disease within 19‑31 days. Mice immunized with the GnRH/Montanide ISA 51/VSSP vaccine exhibited a moderate decline in testosterone levels that was associated with a decrease in anti‑GnRH antibody titers, which lead to a sustained tumor growth inhibition. In total, 2 mice in the immunized group exhibited complete remission of the tumor for the duration of the present study. In addition, castrated mice, which were used as a control for standard hormonal therapy, exhibited an accelerated decrease in tumor size. However, tumor relapse was observed between days 50 and 54, and between days 65 and 85, following the injection of SC 155 cells. Therefore, these mice were sacrificed at day 90. The present study concludes that the slow and moderate reduction of testosterone levels observed using the GnRH‑based vaccine may delay the appearance of castration resistance in a Shionogi prostate cancer model. These findings suggest that this vaccine may be used to delay castration resistance in patients with prostate cancer.The authors would like to thank the Union for International Cancer Control (Geneva, Switzerland; grant no., YY1/09/008/2009) for the fellowship received to support the present study. The authors would also like to thank the researchers at the Trev and Joyce Deeley Research Centre (Victoria, Canada), British Columbia Cancer Research Centre (Vancouver, Canada) and University of Victoria (Victoria, Canada), particularly Professor Brad Nelson, Dr Julian Lum and Dr John Webb, for purchasing the mice and providing the laboratory facilities required to conduct the present study.http://www.spandidos-publications.com/or/2017-02-27am2016Mammal Research Institut

Caracterización fenotípica de cepas autóctonas de Escherichia coli enterotoxigénicas 987P

The use of a gene fragment that codifies for 987P fimbrial subunit as a DNA probe for 987P+ native strains detection from 117 E. coli isolates, in swine farms in Camagüey, is herein reported. Out of 77 neonates tested, 4 (5,2 %) proved to be infected with E. coli strains carrying the 987P fimbrial gene by ELISA and Western-Blot. Keeping in mind the obtained results we propose to use the DNA-DNA hybridization in order to carry out a more extensive epizootiological study, with the objective of knowing the degree of incidence of the ETEC 987P on porcine diarrhea in Cuba.Se reporta el empleo de un fragmento del gen que codifica para la subunidad fímbrica 987P como sonda de ADN para detectar la presencia de cepas autóctonas 987P+ en 117 aislamientos de E. coli realizados en granjas porcinas de la provincia de Camagüey, Cuba. Del total de animales muestreados (77 cerdos neonatos), 4 (5,2 %) estaban infectados con cepas de E. coli portadoras del gen para la fimbria 987P, las que resultaron fenotípicamente 987P positivas por el sistema inmunoenzimático ELISA y Western-blot. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos proponemos emplear la hibridación ADN-ADN para realizar un estudio epizootiológico más extenso, con el objetivo de conocer el grado de incidencia de la ECET 987P en la diarrea porcina en Cuba

Implicaciones éticas de la transgénesis y la clonación Ethic implications of transgenesis and cloning

La biotecnología, aunque tan antigua como la invención del vino y la fermentación de la cerveza por el hombre, tiene en los años 60 del siglo XX, un importante despegue con las técnicas de biología molecular y clonaje de genes foráneos en organismos unicelulares, y el surgimiento de los primeros medicamentos recombinantes. En la década de 1980 y 1990, se obtiene sorprendentes resultados de transgénesis de animales y plantas y ya finalizando el siglo aparece la clonación ó generación de animales idénticos a partir de células somáticas. En este trabajo se valora críticamente las oportunidades y riesgos de la transgénesis y la clonación en el plano ético actual, teniendo en cuenta la amenaza de los seres clónicos, la responsabilidad social de los científicos, la polarización del sistema científico internacional y los códigos morales, además de la ética del profesional científico cubano que responde al principio de que el futuro de nuestra patria tiene que ser necesariamente un futuro de hombres de cienciaEven though Biotechnology is as old as the invention of wine and beer fermentation by men, it experiences an important take off in the 60s, with the development of molecular biology techniques and cloning of strange genes in unicellular organisms, and the emergence of the first recombinant medications. In the decade of 1980 and 1990, surprising results in transgenesis of animals and plants are obtained and by the end of the century cloning or generation of identical animals starting from somatic cells is carried out. In this work the opportunities and risks of transgenesis and cloning are analyzed critically taking into account the current ethical perspective, keeping in mind the threat of cloned beings, the social responsibility of scientists, the polarization of the international scientific system and moral codes, as well as the Cuban science professionals ' ethics that responds to the principle that the future of our homeland is necessarily a future of science me