Modificações genéticas em leveduras para expressão de celulases

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2012.A produção de etanol lignocelulósico transformou-se em um grande desafio para a indústria de energia renovável. A celulose presente nos resíduos lignocelulósicos representa uma fonte abundante de açúcares, mas estes só se tornam disponíveis para fermentação após a etapa de hidrólise enzimática. As grandes quantidades de enzimas necessárias impactam severamente a relação custo-eficácia desta tecnologia. No sentido de buscar novas alternativas, conduzimos o trabalho com o intuito de construir linhagens das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris capazes de produzir celulases (endoglicanase, celobiohidrolase e β-glicosidase). A primeira etapa para a produção de uma linhagem de S. cerevisiae produtora de celulases, foi a expressão isolada de genes celulolíticos. A expressão da endoglicanase II (eglII) de Trichoderma reesei e da celobiohidrolase I.1 (cbhI.1) de Phanerochaete chrysosporium em S. cerevisiae linhagem MFL gerou clones produtores de enzimas funcionais no sobrenadante do cultivo. Em ambos os clones selecionados para cada enzima, foi detectada atividade enzimática a partir de 24 h de cultivo, atingindo maior atividade após 96 h. Várias estratégias para expressão de β-glicosidases em S. cerevisiae foram abordadas: i) a expressão da BGL1 de Sacharomycopsis fibuligera em sua forma nativa, ii) fusionada ao C-terminal da α-aglutinina e, iii) com o peptídeo sinal do fator α de S. cerevisiae. As duas últimas estratégias também foram realizadas com a BGL4 do fungo Humicola grisea var. thermoidea. Testou-se, ainda, a co-expressão da β-glicosidase intracelular GH1-1 e do transportador de celodextrinas CDT-1 de Neurospora crassa. Dentre todos os genes e estratégia utilizados, apenas o sistema envolvendo a co-expressão da GH1-1 e do CDT-1 apresentou resultado satisfatório. O sistema provou ser eficiente permitindo que a levedura crescesse na presença de celobiose em condições aeróbicas e anaeróbicas, com produção de etanol na segunda condição. A co-expressão dos genes eglII e cbhI.1 foi em seguida testada na forma de “fusões gênicas” utilizando dois sistemas de clivagem in vivo: a sequência autoclivante 2A do vírus FMDV, e o sítio para a endoprotease Kex2p. Os dois sistemas resultaram em enzimas funcionais, no entanto as atividades foram menores do que aquelas obtidas quando as enzimas foram expressas separadamente (possivelmente devido ao saturamento da via de secreção). Finalmente, no sentindo de obter uma linhagem de S. cerevisiae que expressasse as três cellulases, foi feita a co-expressão das fusões gênicas com o sistema β-glicosidase/transportador. O clone selecionado GH1-Fus2A apresentou atividade enzimática sobre os substratos CMC e pNPC, capacidade de crescimento em celobiose e seu consumo, e produção de etanol, indicando a produção das três enzimas celulolíticas funcionais na mesma levedura. Para a obtenção de uma linhagem de P. pastoris recombinante produtora de celulases, os genes dessas enzimas foram clonados sob o controle do forte promotor induzível AOX1, em vetores integrativos. Foram utilizados os genes eglII e cbhI.1 em fusão gênica com a sequencia 2A. As atividades sobre CMC, Sigmacel e papel de filtro foram detectadas no sobrenadantes da linhagem recombinante, nas primeiras horas de indução, sendo os maiores níveis encontrados após 72 h, confirmando a atividade das enzimas EGLII e CBHI.1. A atividade sobre CMC do clone recombinante de P. pastoris foi aproximadamente 8 vezes superior àquela obtida com o clone recombinante de S. cerevisiae expressando a mesma fusão gênica. A análise do sobrenadante do cultivo por SDS-PAGE mostrou a clivagem da proteína de fusão pelo peptídeo 2A gerando proteínas independentes. Por fim, demonstrou-se a construção de linhagens de S. cerevisiae e de P. pastoris produtora de celulases necessárias para a degradação da celulose. Essas leveduras são apontadas como uma interessante plataforma para a produção de proteínas heterólogas, e com isso diminuir a quantidade de enzimas comerciais necessárias para hidrolisar o substrato, contribuindo para a redução da dependência da importação das enzimas. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe production of lignocellulosic ethanol become a great challenge for the renewable energy industry. Cellulose present in the lignocellulosic residues represents an abundant source of sugars, but these are only available for the fermentation process after an enzymatic hydrolysis step. The large amount of enzymes required severely impacts the overall cost-efficacy relation of this technology. In an effort to pursue new alternatives, we performed this work aiming to construct strains of Saccharomyces cerevisae and Pichia pastoris able to produce cellulases (endoglucanase, celobiohydrolase and β-glucosidase). The first step for the production of the S. cerevisiae strain that produces cellulose was the isolated expression of cellulolitcs genes. The single expression of the endoglucanase II of Trichoderma reesei and of the cellobiohydrolase I.1 of Phanerochaete chrysosporium in S. cerevisiae MFL generated clones producing functional enzymes on the culture supernatant. In both selected clones for each enzyme, the enzymatic activity was detected after 24 h of cultivation, reaching the highest activity after 96 h. Many strategies for the expression of β-glucosidases in S. cerevisiae were performed: i) the expression of BGL1 de Sacharomycopsis fibuligera in its native form, ii) fused to C-terminal of α-aglutinin and, iii) with the signal peptide form the S. cerevisiae α-factor. The last two strategies were also performed with BGL4 from the fungus Humicola grisea var. thermoidea. It was also tested the co-expression of the intracellular β-glucosidase GH1-1 and the cellodextrins transporter CDT-1 of Neurospora crassa. Of all those strategies, only the system involving the co-expression of GH1-1 and CDT-1 showed satisfactory results. The system showed to be efficient allowing the growth of the yeast in the presence of cellobiose both in aerobic and anaerobic conditions, with ethanol production in the latter. Then, the co-expression of eglII and cbhI.1 genes was tested in the form of “gene fusions” using two in vivo cleavage systems: the auto-cleavage 2A sequence from the FMDV virus, and the cleavage site for the Kex2p protease. Both systems result in functional enzymes, however the activities were lower than those obtained when the enzymes were expressed separately, possibly due the saturation of the secretion pathway. Finally, in an effort to obtain a S. cerevisiae strain that expresses the three cellulases, it was made the co-expression of gene fusion with the β-glucosidase/transporter system. The selected clone GH1-Fus2A showed enzymatic activity with the substrates CMC and pNPC, capacity of growing in cellobiose and consumes it, and ethanol production, indicating the production of the three functional cellulolitic enzymes in the same yeast. To obtain a recombinant P. pastoris strain producing cellulases, the genes of these enzymes were cloned into an integrative vector under the control of the strong inducible promoter AOX1. It was used the eglII and cbhI.1 genes in a gene fusion with the autoclivable 2A sequence. Enzymatic activities with the substrates CMC, Sigmacel and filter paper were detected on the supernatant of the recombinant strain, confirming the enzymes activities of EGLII and CBH.1. The enzymatic activities were detected during the first hours of induction, where the highest levels occurred after 72h. The activity with CMC of the recombinant clone of P. pastoris was approximately 8-fold higher than that obtained with the recombinant clone in S. cerevisiae expressing the same gene fusion. Analysis of the culture supernatant through SDS-PAGE showed the protein fusion cleavage by the 2A peptide generating independent proteins. Finally, it was shown the construction of S. cerevisiae and P. pastoris strains producing cellulases necessary for the cellulose degradation. These yeasts are pointed out as an interesting platform for heterologous protein production and diminishing the amount of commercial enzymes needed to hydrolyze the substrate contribute to the decrease of the dependence of enzymes importation

DA COLISÃO DE DIREITOS FUNDAMENTAIS: OBRIGAÇÃO DO TRABALHADOR PORTADOR DE TENDÊNCIA DE RESPEITAR ORDENS IDEOLÓGICAS X DOS LIMITES AO PODER DIRETIVO DO EMPREGADOR DE TENDÊNCIA

Este artigo tem por objetivo analisar a colisão entre os direitos fundamentais do trabalhador e do empregador no contexto das Organizações de Tendência e os limites balizadores desta colisão

DA ADMISSÃO, PROMOÇÃO E EXTINÇÃO CONTRATUAL EM ORGANIZAÇÕES DE TENDÊNCIA E SUA ANÁLISE JURISPRUDENCIAL

Este artigo tem por objetivo analisar as prerrogativas e os limites de atuação do empregador de tendência na admissão, promoção e extinção contratual em Organizações de Tendência

A RESSIGNIFICAÇÃO DO PODER DIRETIVO DO EMPREGADOR NO CONTEXTO DAS ORGANIZAÇÕES DE TENDÊNCIA

Este artigo tem por objetivo analisar a Ressignificação do Poder Diretivo do empregador no contexto das Organizações De Tendência

Direito, Moral e Democracia : reflexões sobre a concepção de Direito de Jürgen Habermas a partir de considerações críticas de Karl Otto-Apel

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Direito, 2008.O presente trabalho dedica-se à explicitação da concepção de Direito na ótica de Habermas, em especial sua relação com a Moral e a Democracia. Para Habermas, o Direito ocupa posição de destaque na teoria crítica na medida em que desempenha, com primazia, a função integradora social nas sociedades complexas atuais. Especificamente, busca-se esclarecer o conceito de Direito para o autor, considerando-se a redefinição empreendida, por ele, entre sua Teoria da Ação Comunicativa e sua Teoria Discursiva do Direito, segundo a qual o Direito passou de meio ou instituição a mediador entre facticidade e validade, compreendidas enquanto sua tensão estrutural. Objetiva-se esclarecer as relações do Direito com a Moral e a Democracia, no que concerne às convergências e distinções, a partir do princípio do discurso. Faz-se referência a um possível diálogo crítico entre Habermas e Apel acerca da concepção discursiva de Direito. Isso se dá a partir do confronto da teoria habermasiana com a ética do discurso de Apel, em especial a partir de duas críticas à arquitetônica da diferenciação do discurso elaborada por Habermas na obra Direito e Democracia: entre facticidade e validade , consistentes nas problemáticas: (i) da neutralidade do princípio do discurso; e (ii) da identidade entre os princípios do direito e da democracia. A partir desse diálogo, são apresentadas algumas considerações críticas, à guisa de conclusão, sobre o conceito habermasiano de Direito, destacando-se alguns pontos entendidos como fragilidades, tais como o consensualismo exacerbado e o confronto ínsito ao Direito entre consenso e coerção. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTThis paper is dedicated to the explanation of the concept of Law from the perspective of Habermas, particularly its relationship with Moral and Democracy. For Habermas, the Law holds a prominent position in critical theory as it plays, with primacy, the role of social integrative function in complex societies today. Specifically, it seeks to clarify the concept of Law to the author, considering the redefinition undertaken by him between his Theory of Communicative Action and its discourse of Law, in which Law is defined as institution and, after, intermediary structure between facticity and validity, understood as a structural tension. The purpose of the research is, moreover, to clarify the relations among Law, Moral and Democracy, in terms of convergence and distinctions from the perspective of the principle of discourse. Reference is made to a possible critical dialogue between Habermas and Apel about the discursive conception of Law. This happens from the confrontation of the Habermasian theory with two critical observations made by Apel regarding his conception of the architectural differentiation of discourse elaborated in "Law and Democracy: between facticity and validity", namely the issues of; (i) the principle of neutrality, and (ii) the principle of discourse and identity, proposed by Habermas. From this dialog, there are some critical considerations on the Habermasian concept of law, including some points perceived as weaknesses, such as consensualism exacerbated and the confrontation between consensus and coercion that is characteristic of Law

A RESSIGNIFICAÇÃO DO PODER DIRETIVO DO EMPREGADOR NO CONTEXTO DAS ORGANIZAÇÕES DE TENDÊNCIA

Este artigo tem por objetivo analisar a Ressignificação do Poder Diretivo do empregador no contexto das Organizações De Tendência

Optimization of cutting parameters for finish end milling CFRP under vortex-cooled compressed air

Carbon fiber reinforced plastics (CFRP) offer several advantages in the aeronautical and automotive industry due to their combination of lightweight, high strength, and corrosion resistance. CFRP parts are usually produced in near-net-shape; however, additional machining processes are often required for achieving desired dimensional accuracy and surface finish. Thus, this work evaluates the influence of the cutting parameters in CFRP end milling to generate a better surface finish. The experiment was designed using a three-factor, three-level Box-Behnken considering feed rate (f), axial depth of cut (ap ), and cooling conditions (cc) as controllable factors, and roughness parameters (Ra , Rq , Rz , Rt ) as response variables (the occurrence of defects was evaluated qualitatively). Results indicated a strong influence of the quadratic effect of axial depth of cut and its interactions with feed rate and cooling condition on the roughness values and a milder but significant influence of the feed rate and cooling conditions. Multivariate analysis returned the optimum level of input parameters (f = 0.21 mm/rev and ap = 0.8 mm with cooled compressed air), resulting in Ra = 1.58 µm, Rq = 1.98 µm, Rz = 9.39 µm, Rt = 13.63 µm. Also, no defects were observed after machining under the optimum conditions

Descoloration of industrial dyes and simulated textile effluents dyes by turnip peroxidase

The removal of important textile dyes by turnip peroxidase (TNP) was evaluated. The textile effluents besides the residual dyes contain also chemical auxiliaries such as salts, dispersing and wetting agents. The effect of these was evaluated in the removal of the dyes reactive blue 21 and reactive blue 19 by TNP in synthetic effluents. A decrease of the efficency decolorization was observed. The action of the enzyme on colour removal of dye mixture was equivalent to the dyes alone. The chemical demand of oxygen in the effluent after enzymatic treatment had a significant increase in relation to the untreated effluent

Esse Corpo Não É Meu! Uma Análise sobre o “Corpo-Consumo” e a Lógica do Mercado em Mano de Obra e Impuesto a La Carne, de Diamela Eltit

In market logic, the bodies are the necessary element in the frantic search for satisfaction, the real exchange currency. From the dichotomous relationship the Diamela Eltit establisches language and narrative games that take the reader to deep reflections on the consequences derived from a globalized world and excluding. In this context, two books stand out revealing the degradation derived from the perverse capitalism seduction. In Mano de obra, men and women occupants of a degrading globalized place; whereas in Impuesto a la carne, female spectra wander and try to survive the harsh space of a hospital. Na lógica de mercado, os corpos são o elemento necessário na busca alucinada pela satisfação, a verdadeira moeda de troca. E é dentro dessa dicotômica relação que Diamela Eltit estabelece jogos linguísticos e narrativos que levam o leitor a profundas reflexões sobre as consequências de um mundo globalizado e excludente. Nesse contexto, duas obras se destacam por desvelarem essa degradação por trás da sedução perversa do capitalismo. Em Mano de obra, homens e mulheres são ocupantes de um espaço globalizado e degradante; já em Impuesto a la carne, os espectros femininos são seres errantes, e tentam sobreviver no espaço inóspito de um hospital