Gene Activation by the Cytokine-Driven Transcription Factor STAT1

Signal transducers and activators of transcription (STATs) are a family of cytokine-regulated transcription factors, which serve the dual role of external signal transduction and transcriptional activation. The founding member of this family, STAT1, is involved in a plethora of cellular processes, including interferon-dependent upregulation of various effector mechanisms in immune and non-immune cells to control bacterial, fungal and parasitic infections. In this chapter, we discuss the principles of STAT1-driven gene expression and focus on the clinical phenotypes of various human STAT1 mutations. In particular, we highlight the significance of sequence-specific DNA binding and intact nucleocytoplasmic shuttling for full transcriptional activation of interferon-driven target genes

Molekulare Determinanten der Dephosphorylierung und Genaktivierung des Signaltransduktors und Aktivators der Transkription 1

Bei den STAT-Proteinen handelt es sich um eine evolutionär hochkonservierte Proteinfamilie, die aus sechs funktionellen Domänen aufgebaut ist. Obgleich die Linker-Domäne, die zwischen der aminoterminal davon gelegenen DNA-Binde- und der carboxyterminal positionierten SH2-Domäne lokalisiert ist, einen zentralen Bereich in der modularen Molekülorganisation beansprucht, ist über deren physiologische Bedeutung bislang vergleichsweise wenig bekannt. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Linker-Domäne von STAT1 einen Einfluss auf DNA-Bindung und transkriptionelle Aktivität besitzt; jedoch konnte der molekulare Mechanismus dafür nicht identifiziert werden. Um einen besseren Einblick in die Rolle der Linker-Domäne im Zusammenhang von DNA-Bindung und Zielgenerkennung zu gewinnen, wurden Punktmutanten einzelner konservierter Aminosäurereste des STAT1-Moleküls generiert und diese funktionell charakterisiert. Die Substitutionsmutation eines konservierten Glutamatrests in Position 500 führte zu einer verbesserten transkriptionellen Aktivität nach IFN-Stimulation, während sich Phosphorylierungs- und Kernakkumulationskinetik sowie DNA-Bindeaffinität nicht vom Wildtyp-Molekül unterschieden. Die IFN-abhängige Zielgenaktivierung war im Gegensatz zur IFN-vermittelten Signalantwort jedoch supprimiert. Dieses zeigt, dass die Linker-Domäne ursächlich an einer differentiellen, ligandenabhängigen Gen-aktivierung beteiligt ist. Des Weiteren konnte eine Beteiligung der Linker-Domäne an der Dephosphorylierung von STAT1 nachgewiesen werden. Die Mutation eines hochkonservierten Lysinrests in Position 525 führte zum Verlust einer für die Stabilisierung der parallelen Dimerkonformation essentiellen Salzbrücke mit einem kritischen Glutamatrest der SH2-Domäne des gleichen Monomers. Dieser Stabilitätsverlust scheint das Gleichgewicht der Konformere im STAT1-Dimer zugunsten der antiparallelen Dimerkonformation zu verschieben, wobei die anti-parallele Konformation von der STAT1-inaktivierenden Phosphatase bevorzugt wird. Durch Dephosphorylierungsassays konnte gezeigt werden, dass die K525A-Mutante gegenüber dem Wildtyp-Protein ein bevorzugtes Substrat der nukleären T-Zell-Phosphatase ist. Dies resultiert nach Stimulation mit IFN in einer erhöhten In-vivo- und In-vitro-Dephosphorylierungsrate, verminderten Tyrosin-Phosphorylierung, reduzierten Kernakkumulation und einer konsekutiv verminderten Genaktivierung in vivo. Um einen besseren Einblick in die DNA-Bindung von STAT1 zu gewinnen, wurde zusätzlich eine weitere Mutante der DNA-Bindedomäne charakterisiert, die im Gegensatz zu anderen DNA-Bindemutanten nicht in direktem Kontakt mit der DNA-Helix steht, aber in ihrer Affinität zur DNA inhibiert ist. Wie mit Hilfe dieser Struktur-mutante gezeigt werden konnte, haben nicht nur Aminosäuren, die in direktem Kontakt mit der DNA stehen einen Einfluss auf die DNA-Bindung, sondern auch solche, die an der Bildung der dreidimensionalen Domänenstruktur beteiligt sind

Satellitengestützte Vermessung von städtischem Grün in deutschen Städten

Urbane Grünflächen besitzen vielfältige Funktionen und sind als Bereitsteller von Ökosystemleistungen von zentraler Bedeutung. Sie dienen als Naherholungsflächen für die Stadtbevölkerung, als Lebensraum für Flora und Fauna und verbessern die Luftqualität. Mit Daten des europäischen Erdbeobachtungsprogramms Copernicus werden Satellitendaten in einer hohen geometrischen Auflösung sowie mit einer hohen räumlichen und zeitlichen Abdeckung kostenlos zur Verfügung gestellt. Die Aufnahmen der Sentinel-2 Satelliten des Copernicus Programms werden in dieser Analyse verwendet, um urbane Grünflächen in deutschen Städten zu kartieren. Um phänologische Einflüsse abzubilden wird der Jahresgang der Vegetation anhand eines Medianmosaiks bzw. über Vegetationsindizes berücksichtigt. Darauf aufbauend wurde eine Methodik zur Landnutzungs-/Landbedeckungsklassifikation auf Basis von LUCAS Referenzpunkten entwickelt und getestet. Die hohe Gesamtgenauigkeit von 92,3 % zeigt, dass innerstädtische Grünflächen mithilfe flächendeckender Satellitendaten in hohem Detailgrad erfasst werden können

Lack of STAT1 co-operative DNA binding protects against adverse cardiac remodelling in acute myocardial infarction

In this study, we addressed the functional significance of co-operative DNA binding of the cytokine-driven transcription factor STAT1 (signal transducer and activator of transcription 1) in an experimental murine model of acute myocardial infarction (MI). STAT1 knock-in mice expressing a phenylalanine-to-alanine substitution at position 77 in the STAT1 amino-terminal domain were examined for the early clinical effects produced by ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD), an established model for MI. The F77A mutation has been previously reported to disrupt amino-terminal interactions between adjacent STAT1 dimers resulting in impaired tetramerization and defective co-operative binding on DNA, while leaving other protein functions unaffected. Our results demonstrate that a loss of STAT1 tetramer stabilization improves survival of adult male mice and ameliorates left ventricular dysfunction in female mice, as determined echocardiographically by an increased ejection fraction and a reduced left intra-ventricular diameter. We found that the ratio of STAT3 to STAT1 protein level was higher in the infarcted tissue in knock-in mice as compared to wild-type (WT) mice, which was accompanied by an enhanced infiltration of immune cells in the infarcted area, as determined by histology. Additionally, RNA sequencing of the infarcted tissue 24 h after LAD ligation revealed an upregulation of inflammatory genes in the knock-in mice, as compared to their WT littermates. Concomitantly, genes involved in oxidative phosphorylation and other metabolic pathways showed a significantly more pronounced downregulation in the infarcted tissue from STAT1F77A/F77A mice than in WT animals. Based on these results, we propose that dysfunctional STAT1 signalling owing to a lack of oligomerisation results in a compensatory increase in STAT3 expression and promotes early infiltration of immune cells in the infarcted area, which has beneficial effects on left ventricular remodelling in early MI following LAD ligation

Climate affects neighbour‐induced changes in leaf chemical defences and tree diversity‐herbivory relationships

1. Associational resistance theory predicts that insect herbivory decreases with increasing tree diversity in forest ecosystems. However, the generality of this effect and its underlying mechanisms are still debated, particularly since evidence has accumulated that climate may influence the direction and strength of the relationship between diversity and herbivory. 2. We quantified insect leaf herbivory and leaf chemical defences (phenolic compounds) of silver birch Betula pendula in pure and mixed plots with different tree species composition across 12 tree diversity experiments in different climates. We investigated whether the effects of neighbouring tree species diversity on insect herbivory in birch, that is, associational effects, were dependent on the climatic context, and whether neighbour-induced changes in birch chemical defences were involved in associational resistance to insect herbivory. 3. We showed that herbivory on birch decreased with tree species richness (i.e. associational resistance) in colder environments but that this relationship faded as mean annual temperature increased. 4. Birch leaf chemical defences increased with tree species richness but decreased with the phylogenetic distinctiveness of birch from its neighbours, particularly in warmer and more humid environments

Different localization of P2X4 and P2X7 receptors in native mouse lung - lack of evidence for a direct P2X4-P2X7 receptor interaction

IntroductionP2X receptors are a family of homo- and heterotrimeric cation channels gated by extracellular ATP. The P2X4 and P2X7 subunits show overlapping expression patterns and have been involved in similar physiological processes, such as pain and inflammation as well as various immune cell functions. While formation of P2X2/P2X3 heterotrimers produces a distinct pharmacological phenotype and has been well established, functional identification of a P2X4/P2X7 heteromer has been difficult and evidence for and against a physical association has been found. Most of this evidence stems, however, from in vitro model systems.MethodsHere, we used a P2X7-EGFP BAC transgenic mouse model as well as P2X4 and P2X7 knock-out mice to re-investigate a P2X4-P2X7 interaction in mouse lung by biochemical and immunohistochemical experiments as well as quantitative expression analysis.ResultsNo detectable amounts of P2X4 could be co-purified from mouse lung via P2X7-EGFP. In agreement with these findings, immuno-histochemical analysis using a P2X7-specific nanobody revealed only limited overlap in the cellular and subcellular localizations of P2X4 and P2X7 in both the native lung tissue and primary cells. Comparison of P2X4 and P2X7 transcript and protein levels in the respective gene-deficient and wild type mice showed no mutual interrelation between their expression levels in whole lungs. However, a significantly reduced P2rx7 expression was found in alveolar macrophages of P2rx4-/- mice.DiscussionIn summary, our detailed analysis of the cellular and subcellular P2X4 and P2X7 localization and expression does not support a physiologically relevant direct association of P2X4 and P2X7 subunits or receptors in vivo

31st Annual Meeting and Associated Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC 2016) : part two

Background The immunological escape of tumors represents one of the main ob- stacles to the treatment of malignancies. The blockade of PD-1 or CTLA-4 receptors represented a milestone in the history of immunotherapy. However, immune checkpoint inhibitors seem to be effective in specific cohorts of patients. It has been proposed that their efficacy relies on the presence of an immunological response. Thus, we hypothesized that disruption of the PD-L1/PD-1 axis would synergize with our oncolytic vaccine platform PeptiCRAd. Methods We used murine B16OVA in vivo tumor models and flow cytometry analysis to investigate the immunological background. Results First, we found that high-burden B16OVA tumors were refractory to combination immunotherapy. However, with a more aggressive schedule, tumors with a lower burden were more susceptible to the combination of PeptiCRAd and PD-L1 blockade. The therapy signifi- cantly increased the median survival of mice (Fig. 7). Interestingly, the reduced growth of contralaterally injected B16F10 cells sug- gested the presence of a long lasting immunological memory also against non-targeted antigens. Concerning the functional state of tumor infiltrating lymphocytes (TILs), we found that all the immune therapies would enhance the percentage of activated (PD-1pos TIM- 3neg) T lymphocytes and reduce the amount of exhausted (PD-1pos TIM-3pos) cells compared to placebo. As expected, we found that PeptiCRAd monotherapy could increase the number of antigen spe- cific CD8+ T cells compared to other treatments. However, only the combination with PD-L1 blockade could significantly increase the ra- tio between activated and exhausted pentamer positive cells (p= 0.0058), suggesting that by disrupting the PD-1/PD-L1 axis we could decrease the amount of dysfunctional antigen specific T cells. We ob- served that the anatomical location deeply influenced the state of CD4+ and CD8+ T lymphocytes. In fact, TIM-3 expression was in- creased by 2 fold on TILs compared to splenic and lymphoid T cells. In the CD8+ compartment, the expression of PD-1 on the surface seemed to be restricted to the tumor micro-environment, while CD4 + T cells had a high expression of PD-1 also in lymphoid organs. Interestingly, we found that the levels of PD-1 were significantly higher on CD8+ T cells than on CD4+ T cells into the tumor micro- environment (p < 0.0001). Conclusions In conclusion, we demonstrated that the efficacy of immune check- point inhibitors might be strongly enhanced by their combination with cancer vaccines. PeptiCRAd was able to increase the number of antigen-specific T cells and PD-L1 blockade prevented their exhaus- tion, resulting in long-lasting immunological memory and increased median survival

Molekulare Determinanten der Dephosphorylierung und Genaktivierung des Signaltransduktors und Aktivators der Transkription 1

Bei den STAT-Proteinen handelt es sich um eine evolutionär hochkonservierte Proteinfamilie, die aus sechs funktionellen Domänen aufgebaut ist. Obgleich die Linker-Domäne, die zwischen der aminoterminal davon gelegenen DNA-Binde- und der carboxyterminal positionierten SH2-Domäne lokalisiert ist, einen zentralen Bereich in der modularen Molekülorganisation beansprucht, ist über deren physiologische Bedeutung bislang vergleichsweise wenig bekannt. In früheren Arbeiten konnte gezeigt werden, dass die Linker-Domäne von STAT1 einen Einfluss auf DNA-Bindung und transkriptionelle Aktivität besitzt; jedoch konnte der molekulare Mechanismus dafür nicht identifiziert werden. Um einen besseren Einblick in die Rolle der Linker-Domäne im Zusammenhang von DNA-Bindung und Zielgenerkennung zu gewinnen, wurden Punktmutanten einzelner konservierter Aminosäurereste des STAT1-Moleküls generiert und diese funktionell charakterisiert. Die Substitutionsmutation eines konservierten Glutamatrests in Position 500 führte zu einer verbesserten transkriptionellen Aktivität nach IFN-Stimulation, während sich Phosphorylierungs- und Kernakkumulationskinetik sowie DNA-Bindeaffinität nicht vom Wildtyp-Molekül unterschieden. Die IFN-abhängige Zielgenaktivierung war im Gegensatz zur IFN-vermittelten Signalantwort jedoch supprimiert. Dieses zeigt, dass die Linker-Domäne ursächlich an einer differentiellen, ligandenabhängigen Gen-aktivierung beteiligt ist. Des Weiteren konnte eine Beteiligung der Linker-Domäne an der Dephosphorylierung von STAT1 nachgewiesen werden. Die Mutation eines hochkonservierten Lysinrests in Position 525 führte zum Verlust einer für die Stabilisierung der parallelen Dimerkonformation essentiellen Salzbrücke mit einem kritischen Glutamatrest der SH2-Domäne des gleichen Monomers. Dieser Stabilitätsverlust scheint das Gleichgewicht der Konformere im STAT1-Dimer zugunsten der antiparallelen Dimerkonformation zu verschieben, wobei die anti-parallele Konformation von der STAT1-inaktivierenden Phosphatase bevorzugt wird. Durch Dephosphorylierungsassays konnte gezeigt werden, dass die K525A-Mutante gegenüber dem Wildtyp-Protein ein bevorzugtes Substrat der nukleären T-Zell-Phosphatase ist. Dies resultiert nach Stimulation mit IFN in einer erhöhten In-vivo- und In-vitro-Dephosphorylierungsrate, verminderten Tyrosin-Phosphorylierung, reduzierten Kernakkumulation und einer konsekutiv verminderten Genaktivierung in vivo. Um einen besseren Einblick in die DNA-Bindung von STAT1 zu gewinnen, wurde zusätzlich eine weitere Mutante der DNA-Bindedomäne charakterisiert, die im Gegensatz zu anderen DNA-Bindemutanten nicht in direktem Kontakt mit der DNA-Helix steht, aber in ihrer Affinität zur DNA inhibiert ist. Wie mit Hilfe dieser Struktur-mutante gezeigt werden konnte, haben nicht nur Aminosäuren, die in direktem Kontakt mit der DNA stehen einen Einfluss auf die DNA-Bindung, sondern auch solche, die an der Bildung der dreidimensionalen Domänenstruktur beteiligt sind

Two glutamic acid residues in the DNA-binding domain are engaged in the release of STAT1 dimers from DNA

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>In interferon-γ-stimulated cells, the dimeric transcription factor STAT1 (<it>s</it>ignal <it>t</it>ransducer and <it>a</it>ctivator of <it>t</it>ranscription 1) recognizes semi-palindromic motifs in the promoter regions of cytokine-driven target genes termed GAS (<it>g</it>amma-<it>a</it>ctivated <it>s</it>ites). However, the molecular steps that facilitate GAS binding and the subsequent liberation of STAT1 homodimers from these promoter elements are not well understood.</p> <p>Results</p> <p>Using a mutational approach, we identified two critical glutamyl residues within the DNA-binding domain adjacent to the phosphodiester backbone of DNA which efficiently release phospho-STAT1 from DNA. The release of STAT1 dimers from DNA enhances transcriptional activity on both interferon-driven reporter and endogenous target genes. A substitution of either of the two glutamic acid residues broadens the repertoire of putative binding sites on DNA and enhances binding affinity to GAS sites. However, despite elevated levels of tyrosine phosphorylation and a prolonged nuclear accumulation period, the STAT1 DNA-binding mutants show a significantly reduced transcriptional activity upon stimulation of cells with interferon-γ. This reduced transcriptional response may be explained by the deposition of oligomerized STAT1 molecules outside GAS sites.</p> <p>Conclusions</p> <p>Thus, two negatively charged amino acid residues in the DNA-binding domain are engaged in the liberation of STAT1 from DNA, resulting in a high dissociation rate from non-GAS sites as a key feature of STAT1 signal transduction, which positively regulates cytokine-dependent gene expression probably by preventing retention at transcriptionally inert sites.</p