Estudio de acuaporinas vegetales pertenecientes a la familia PIP : análisis de las relaciones estructura-función de homo-tetrámeros y tetrámeros mixtos PIP1-PIP2

In the present Thesis we evaluated the capacity of plant aquaporins belonging to the PIP subfamily to assembly as hetero-tetramers. With this aim, we investigated the functional properties of two aquaporins belonging to the PIP2 group regarding their interaction with PIP1. Our results show that it is not correct to generalize that all PIP2 are able to interact with all PIP1, as we proved that the interaction between PIP1 and PIP2 is dependent on specific pairs of PIP1 and PIP2 proteins. We identify the first extracellular loop of PIP2 as a key structural element in the interaction between monomers in the tetramer and also as a possible controller of the hetero-tetramerization phenomenon. We also probed that the hetero-tetramerization between PIP1-PIP2 do not have a stoichiometric constrain and depends on the relative quantities of PIP1 and PIP2 monomers which are co-expressed in the cell. Moreover, hetero-tetramers with all the possible stiochiometries present equal biological activity in terms of water transport and pH intracellular regulation, being these functional properties different from the ones observed for homo-tetramers. In summary, this work shed light on the hetero-tetramerization of PIP channels as a new relevant mechanism to adjust plasma membrane water transport of plant cells.Fil: Jozefkowicz, Cintia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; ArgentinaLa asociación específica de canales de membrana plasmática de las células vegetales para formar arreglos oligoméricos es un evento biológicamente relevante porque confiere ventajas funcionales a la fisiología celular vegetal. En el caso de las acuaporinas de plantas, se sabe que estas se encuentran como canales oligoméricos en distintas membranas de la célula vegetal y al momento de comenzar este trabajo doctoral se habían reportado evidencias que apoyaban que las acuaporinas vegetales de membrana plasmática (PIP) podrían interactuar para formar oligómeros mixtos mediante la combinación de monómeros del tipo PIP2 y PIP1. Sin embargo, restaba comprender el tipo de oligómero que forman los parálogos PIP1 y PIP2 y el tipo de estequiometría alcanzada al ensamblarse. Asimismo, si bien estaba ampliamente reportada la interacción funcional entre algunas PIP1 y algunas PIP2, no era claro si todas las PIP1 y todas las PIP2 son capaces de interaccionar, y se desconocían los determinantes estructurales que resultan claves para la interacción entre ambos subtipos de acuaporinas. Siendo este el estado de conocimiento sobre las relaciones estructura-función del grupo PIP de acuaporinas vegetales, el trabajo de tesis aquí presentado se centró en investigar la capacidad de las acuaporinas de este grupo para formar arreglos hetero-oligoméricos, determinando su actividad, regulación, localización, e indagando cuáles podrían ser los determinantes estructurales necesarios para que tenga lugar la interacción entre PIP1 y PIP2. Para lograr este objetivo, se examinaron las propiedades funcionales de 2 acuaporinas de Beta vulgaris tipo PIP2 en cuanto a su interacción con PIP1 y se evaluó la formación de distintas especies tetraméricas. Nuestros enfoques experimentales incluyen: i) la medición de la actividad biológica de los tetrámeros en cuanto a su capacidad de transportar agua; ii) el análisis de la localización de PIPs fusionadas a EYFP o ECFP por microscopía de fluorescencia confocal; iii) el diseño y la evaluación funcional de mutantes que permitan estudiar la interacción PIP1-PIP2; iv) la realización de construcciones homo y hetero-diméricas de PIP1 o PIP2; v) el estudio de la regulación de la actividad biológica de los diferentes arreglos tetraméricos por cambios en el pH citosólico; y vi) la realización de estudios bioinformáticos y estructurales de PIPs in silico.\nLos resultados obtenidos durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral muestran que no es posible generalizar que cualquier miembro del grupo PIP2 es capaz de interactuar con cualquier miembro del grupo PIP1, siendo el primer loop extracelular de PIP2 un elemento estructural clave en la interacción entre monómeros en el tetrámero y un posible controlador del fenómeno de hetero-tetramerización. A su vez, hemos podido demostrar que distintos tipos de hetero-tetrámeros PIP1-PIP2 con estequiometrías 2:2, 1:3 y 3:1 son capaces de formarse y alcanzar la membrana plasmática en el sistema de expresión heterólogo de oocitos de Xenopus; lasevidencias experimentales halladas muestran que el ensamblado de PIP1-PIP2 en hetero-tetrámeros ocurre con estequiometría flexible y dependiente de la expresión relativa de cada uno de los parálogos. Interesantemente, todas las especies hetero-tetraméricas presentan igual actividad biológica en términos de transporte de agua y respuesta cooperativa a la regulación por pHint. Sin embargo, las propiedades de los hetero-tetrámeros PIP1-PIP2 difieren de las propiedades halladas para los homo-tetrámeros. Dado que la presencia en membrana plasmática de hetero-tetrámeros vs homo-tetrámeros depende de cantidad de proteínas PIP2 disponibles en relación a la cantidad de proteínas PIP1, y considerando que estos ensambles poseen importantes diferencias funcionales, el manejo de la expresión relativa PIP1/PIP2 se torna un mecanismo de regulación del transporte de agua en la célula vegetal. Así, nuestros hallazgos arrojan luz no sólo la estequiometría de los hetero-tetrámeros formados por PIP1-PIP2 y su funcionalidad biológica, cuestiones que estaban pendientes de ser elucidadas en el campo biofísico de las acuaporinas vegetales, sino también sobre la hetero-tetramerización de las PIPs como un nuevo mecanismo de regulación relevante para ajustar el transporte de agua a través de la membrana plasmática de las células vegetales

Expanding the Benefits of Tnt1 for the Identification of Dominant Mutations in Polyploid Crops: A Single Allelic Mutation in the MsNAC39 Gene Produces Multifoliated Alfalfa

Most major crops are polyploid species and the production of genetically engineered cultivars normally requires the introgression of transgenic or gene-edited traits into elite germplasm. Thus, a main goal of plant research is the search of systems to identify dominant mutations. In this article, we show that the Tnt1 element can be used to identify dominant mutations in allogamous tetraploid cultivated alfalfa. Specifically, we show that a single allelic mutation in the MsNAC39 gene produces multifoliate leaves (mfl) alfalfa plants, a pivot trait of breeding programs of this forage species. Finally, we discuss the potential application of a combination of preliminary screening of beneficial dominant mutants using Tnt1 mutant libraries and genome editing via the CRISPR/Cas9 system to identify target genes and to rapidly improve both autogamous and allogamous polyploid crops.Fil: Jozefkowicz, Cintia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; ArgentinaFil: Gómez, Cristina. Agencia de Extension Rural Villa Maria (aer Villa Maria) ; Estacion Experimental Agropecuaria Manfredi ; Centro Regional Cordoba ; Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria;Fil: Odorizzi, Ariel Sebastian. Agencia de Extension Rural Villa Maria (aer Villa Maria) ; Estacion Experimental Agropecuaria Manfredi ; Centro Regional Cordoba ; Instituto Nacional de Tecnologia Agropecuaria;Fil: Iantcheva, Anelia. AgroBioInstitute Agricultural Academy; BulgariaFil: Ratet, Pascal. Université D'evry Val D'essonne; Francia. Centre National de la Recherche Scientifique; FranciaFil: Ayub, Nicolás. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires; ArgentinaFil: Soto, Gabriela Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentin

Loop A Is Critical for the Functional Interaction of Two Beta vulgaris PIP Aquaporins

Research done in the last years strongly support the hypothesis that PIP aquaporin can form heterooligomeric assemblies, specially combining PIP2 monomers with PIP1 monomers. Nevertheless, the structural elements involved in the ruling of homo versus heterooligomeric organization are not completely elucidated. In this work we unveil some features of monomer-monomer interaction in Beta vulgaris PIP aquaporins. Our results show that while BvPIP2;2 is able to interact with BvPIP1;1, BvPIP2;1 shows no functional interaction. The lack of functional interaction between BvPIP2;1 and BvPIP1;1 was further corroborated by dose-response curves of water permeability due to aquaporin activity exposed to different acidic conditions. We also found that BvPIP2;1 is unable to translocate BvPIP1;1-ECFP from an intracellular position to the plasma membrane when co-expressed, as BvPIP2;2 does. Moreover we postulate that the first extracellular loop (loop A) of BvPIP2;1, could be relevant for the functional interaction with BvPIP1;1. Thus, we investigate BvPIP2;1 loop A at an atomic level by Molecular Dynamics Simulation (MDS) and by direct mutagenesis. We found that, within the tetramer, each loop A presents a dissimilar behavior. Besides, BvPIP2;1 loop A mutants restore functional interaction with BvPIP1;1. This work is a contribution to unravel how PIP2 and PIP1 interact to form functional heterooligomeric assemblies. We postulate that BvPIP2;1 loop A is relevant for the lack of functional interaction with BvPIP1;1 and that the monomer composition of PIP assemblies determines their functional properties.Fil: Jozefkowicz, Cintia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina;Fil: Rosi, Pablo Eduardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Química, Física de los Materiales, Medioambiente y Energía; Argentina;Fil: Sigaut, Lorena. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina;Fil: Soto, Gabriela Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias. Centro de Investigación de Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Genética; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina;Fil: Pietrasanta, Lia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Centro de Microscopías Avanzadas; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina;Fil: Amodeo, Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina;Fil: Alleva, Karina Edith. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental; Argentina; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

Synthetic multi-antibiotic resistant plasmids in plant-associated bacteria from agricultural soils

Objectives: Unlike higher organisms such as domestic animals and cultivated plants, which display a robust reproductive isolation and limited dispersal ability, microbes exhibit an extremely promiscuous gene flow and can rapidly disperse across the planet by multiple ways. Thus, microbial plasmids, including synthetic replicons, containing antibiotic resistance genes are a serious risk to public health. In this short communication, we explored the presence of synthetic elements in alfalfa symbionts (Ensifer meliloti strains) from agricultural soils. Methods: A total of 148 E. meliloti isolates from alfalfa plants growing under field conditions were collected from January 2015 to June 2019. Antimicrobial susceptibility testing was performed under laboratory conditions. We identified five kanamycin-resistant E. meliloti strains (named K1-K5). Whole genome sequencing analysis and conjugations were used to identify and study the plasmids of K strains. Results: We found that the genomes of K strains contain ampicillin, kanamycin and tetracycline resistance genes, the reporter gene lacZ from Escherichia coli and multiple cloning sites. These sequences were found within <58-kb plasmids related to the self-transmissible IncP plasmid RP4 from human pathogen Pseudomonas aeruginosa. Conjugation experiments confirmed the ability of K strains to transfer antibiotic resistance via conjugation to the Pseudomonas background. Conclusion: In addition to the traditional analysis of plant growth-promoting factors, the commercial deregulation of putative natural inoculants should also include genomic studies to ensure a reasonable balance between innovation and caution.Instituto de GenéticaFil: Brambilla, Silvina Maricel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Frare, Romina Alejandra. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Stritzler, Margarita. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Soto, Gabriela Cinthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Berini, Carolina Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y Sida; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Jozefkowicz, Cintia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Ayub, Nicolás Daniel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Two aquaporins, multiple ways of assembly

Protein oligomerization is a biological relevant event that may provide functional advantages to biological systems. The association of aquaporin (AQP) protomers to form hetero-oligomeric assemblies is a current challenging area of research. PIP1 and PIP2, members of the plant AQP subfamily named PIP (for plant plasma membrane intrinsic proteins), have been intensively studied in the recent years particularly due to their ability to hetero-oligomerize.Fil: Jozefkowicz, Cintia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Genética; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Scochera, Florencia Paola. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; ArgentinaFil: Alleva, Karina Edith. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas "Prof. Alejandro C. Paladini". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Química y Físico-Química Biológicas; Argentin

Heteromerization of Plant Aquaporins

Aquaporins are channel proteins that facilitate the diffusion of water and small uncharged solutes across cellular membranes. Plant aquaporins form a large family of highly divergent proteins that are involved in many different physiological processes. This book will summarize the recent advances regarding plant aquaporins, their phylogeny, structure, substrate specificity, mechanisms of regulation and roles in various important physiological processes related to the control of water flow and small solute distribution at the cell, tissue and plant level in an ever-changing environment

Understanding the intracellular-to-extracellular localization switch of polyhydroxybutyrate polymerase in pseudomonas backgrounds as a microevolutionary process

After gene duplication, paralogous genes evolve independently, and consequently, the new proteins encoded by these duplicated genes are exposed to changes in their subcellular location. Although there are increasing evidence that phylogenetically related proteins play different functions in different subcellular compartments, the number of evolutionary steps required for the emergence of a novel protein with a novel subcellular localization remains unclear. Regarding this intriguing topic, here we examine in depth our previous reports describing both intracellular and extracellular polyhydroxybutyrate polymerases (PhaC) in the Pseudomonadales group. The recapitulation of the intracellular-to-extracellular localization switch of PhaC in these strains shows a gradual evolution from a simple cytosolic PhaC form to a complex extracellular PhaC form specifically secreted via the type 1 secretion system. This gradual evolution includes several adaptive and pre-adaptive changes at the genomic, genetic and enzymatic levels, which are intimately related to the lifestyle of organisms during the evolution of protein localization. We conclude that the protein localization switch can be an extremely complex process in nature.Instituto de GenéticaFil: Stritzler, Margarita. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Berini, Carolina Andrea. Instituto de Investigaciones Biomédicas en Retrovirus y SIDA; ArgentinaFil: Jozefkowicz, Cintia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Soto, Gabriela Cinthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Ayub, Nicolás Daniel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Intracellular pH sensing is altered by plasma membrane PIP aquaporin co-expression

The plant plasma membrane barrier can express aquaporins (PIP1 and PIP2) that show two intriguing aspects: (1) the potential of modulating whole membrane water permeability by co-expression of both types, which have recently been distinguished for showing a different capacity to reach the plasma membrane; and (2) the faculty to reduce water permeation through the pore after cytosolic acidification, as a consequence of a gating process. Our working hypothesis is that these two key features might enhance plasticity of the membrane water transport capacity if they jointly trigger any cooperative interaction. In previous work, we proved by biophysical approaches that the plasma membrane of the halophyte Beta vulgaris storage root presents highly permeable aquaporins that can be shut down by acidic pH. Root Beta vulgaris PIPs were therefore subcloned and expressed in Xenopus oocytes. Co-expression of BvPIP1;1 and BvPIP2;2 not only enhances oocyte plasma membrane water permeability synergistically but also reinforces pH inhibitory response from partial to complete shut down after cytosolic pH acidifi- cation. This pH dependent behavior shows that PIP1–PIP2 co-expression accounts for a different pH sensitivity in comparison with PIP2 expression. These results prove for the first time that PIP co-expression modulates the membrane water permeability through a pH regulatory response, enhancing in this way membrane versatility to adjust its water transfer capacity.Fil: Bellati, Jorge. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Laboratorio de Biomembranas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Alleva, Karina Edith. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Laboratorio de Biomembranas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Soto, Gabriela Cynthia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones En Ingeniería Genética y Biología Molecular "dr. Hector N Torres"; ArgentinaFil: Vitali, Victoria Andrea. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Laboratorio de Biomembranas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Jozefkowicz, Cintia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Laboratorio de Biomembranas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Amodeo, Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Departamento de Ciencias Fisiológicas. Laboratorio de Biomembranas; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin