Structural and functional characterization of HMGB1 protein in rat liver during experimentally-induced diabetes type 1

Оксидативни стрес и хронична инфламација сматрају се главним узроцима појаве дијабетичних компликација, међу којима су и оштећења јетре. Важну улогу медијатора ових процеса може имати ендогени протеин HMGB1, који у ванћелијску средину доспева из некротичних, оштећених и активираних ћелија. Како је у дијабетесу понашање HMGB1 протеина слабо изучавано, у овој докторској дисертацији испитиван је допринос HMGB1 оштећењима јетре пацова са стрептозотоцином-изазваним ДТ1. Показано је да ниво оштећења јетре током дијабетесa корелише са присуством ванћелијског HMGB1. Овај протеин, у дијабетичној јетри, бива структурно модификован ацетилацијом, фосфорилацијом и O-GlcNAc гликозилацијом што корелише са његовим изласком из једра ћелија у цитоплазму и повећањем његовог присуства у јетри и серуму. Резултати у вези са снижавањeм нивоа ванћелијског HMGB1 третманом дијабетичних пацова мелатонином или етил пируватом, указују да HMGB1 доприноси оштећењу јетре у дијабетесу одржавањем стања хроничне инфламације, стишавањем антиоксидативне одбране и стишавањем регенерације. Ванћелијски HMGB1 кроз интеракције са TLR4 рецептором активира MAPК/NF-κB p65 и ЈАК1/STAT3 сигналне путеве, доприносећи повећању продукције проинфламацијских цитокина TNF-α и IL-6 и акутно-фазног протеина хаптоглобина. Подстицањем NF-κB p65 инфламацијског пута, HMGB1 делује негативно на цитопротективни одговор у дијабетичној јетри тако што онемогућава активност Nrf2 протеина, одговорног за стишавање инфламације и продукцију антиоксидативних ензима. На стишавање регенеративног потенцијала јетре, активирана HMGB1/TLR4 оса утиче преко увећања присуства негативних регулатора ћелијског циклуса - протеина p53 и p21, и смањењем нивоа циклина D1. Добијени резултати указују на сложеност деловања HMGB1 протеина у дијабетесу и на значај спречавања ослобађања HMGB1 или блокаде HMGB1/TLR4 осе у циљу одлагања настанка оштећења јетре.Oxidative stress and chronic inflammation are considered to be the main causes of diabetic complications, one of which is liver damage. An important mediator of these processes may be the endogenous HMGB1 protein, when released into the extracellular environment from the necrotic, damaged or activated cells. As the HMGB1 role in diabetes was insufficiently studied, in this doctoral dissertation the contribution of HMGB1 to liver damage of streptozotocin-induced diabetic rats was investigated. It has been shown that the level of liver damage in diabetes correlates with the presence of extracellular HMGB1. In diabetic liver, this protein is structurally modified by acetylation, phosphorylation, and O-GlcNAc glycosylation, which correlates with its translocation from the nucleus to the cytoplasm and an increase in its presence in the liver and serum. Reduction of the level of extracellular HMGB1 by melatonin or ethyl pyruvate treatment of diabetic rats, shows that HMGB1 contributes to diabetic liver damage by maintaining a chronic inflammation, by lowering antioxidant defense and by reducing regeneration. Extracellular HMGB1 activates MAPK/NF-κB p65 and JAK1/STAT3 signaling pathways through interactions with the TLR4 receptor, thus contributing increased production of proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 and the acute-phase protein, haptoglobin. By stimulating the NF-κB p65 inflammatory pathway, HMGB1 acts negatively on the cytoprotective response of the diabetic liver, by disabling Nrf2 protein activity, which is responsible for reduction of inflammation and antioxidant enzymes production. Activated HMGB1/TLR4 axis reduces regenerative potential of the liver by increasing the presence of negative cell cycle regulators - proteins p53 and p21, and also by decreasing the level of cyclin D1. The obtained results indicate the complexity of HMGB1 protein action in diabetes and underlines the importance of preventing the release of HMGB1 or blockage of HMGB1/TLR4 axis in order to delay the occurrence of liver damage

Structural and functional characterization of HMGB1 protein in rat liver during experimentally-induced diabetes type 1

Оксидативни стрес и хронична инфламација сматрају се главним узроцима појаве дијабетичних компликација, међу којима су и оштећења јетре. Важну улогу медијатора ових процеса може имати ендогени протеин HMGB1, који у ванћелијску средину доспева из некротичних, оштећених и активираних ћелија. Како је у дијабетесу понашање HMGB1 протеина слабо изучавано, у овој докторској дисертацији испитиван је допринос HMGB1 оштећењима јетре пацова са стрептозотоцином-изазваним ДТ1. Показано је да ниво оштећења јетре током дијабетесa корелише са присуством ванћелијског HMGB1. Овај протеин, у дијабетичној јетри, бива структурно модификован ацетилацијом, фосфорилацијом и O-GlcNAc гликозилацијом што корелише са његовим изласком из једра ћелија у цитоплазму и повећањем његовог присуства у јетри и серуму. Резултати у вези са снижавањeм нивоа ванћелијског HMGB1 третманом дијабетичних пацова мелатонином или етил пируватом, указују да HMGB1 доприноси оштећењу јетре у дијабетесу одржавањем стања хроничне инфламације, стишавањем антиоксидативне одбране и стишавањем регенерације. Ванћелијски HMGB1 кроз интеракције са TLR4 рецептором активира MAPК/NF-κB p65 и ЈАК1/STAT3 сигналне путеве, доприносећи повећању продукције проинфламацијских цитокина TNF-α и IL-6 и акутно-фазног протеина хаптоглобина. Подстицањем NF-κB p65 инфламацијског пута, HMGB1 делује негативно на цитопротективни одговор у дијабетичној јетри тако што онемогућава активност Nrf2 протеина, одговорног за стишавање инфламације и продукцију антиоксидативних ензима. На стишавање регенеративног потенцијала јетре, активирана HMGB1/TLR4 оса утиче преко увећања присуства негативних регулатора ћелијског циклуса - протеина p53 и p21, и смањењем нивоа циклина D1. Добијени резултати указују на сложеност деловања HMGB1 протеина у дијабетесу и на значај спречавања ослобађања HMGB1 или блокаде HMGB1/TLR4 осе у циљу одлагања настанка оштећења јетре.Oxidative stress and chronic inflammation are considered to be the main causes of diabetic complications, one of which is liver damage. An important mediator of these processes may be the endogenous HMGB1 protein, when released into the extracellular environment from the necrotic, damaged or activated cells. As the HMGB1 role in diabetes was insufficiently studied, in this doctoral dissertation the contribution of HMGB1 to liver damage of streptozotocin-induced diabetic rats was investigated. It has been shown that the level of liver damage in diabetes correlates with the presence of extracellular HMGB1. In diabetic liver, this protein is structurally modified by acetylation, phosphorylation, and O-GlcNAc glycosylation, which correlates with its translocation from the nucleus to the cytoplasm and an increase in its presence in the liver and serum. Reduction of the level of extracellular HMGB1 by melatonin or ethyl pyruvate treatment of diabetic rats, shows that HMGB1 contributes to diabetic liver damage by maintaining a chronic inflammation, by lowering antioxidant defense and by reducing regeneration. Extracellular HMGB1 activates MAPK/NF-κB p65 and JAK1/STAT3 signaling pathways through interactions with the TLR4 receptor, thus contributing increased production of proinflammatory cytokines TNF-α and IL-6 and the acute-phase protein, haptoglobin. By stimulating the NF-κB p65 inflammatory pathway, HMGB1 acts negatively on the cytoprotective response of the diabetic liver, by disabling Nrf2 protein activity, which is responsible for reduction of inflammation and antioxidant enzymes production. Activated HMGB1/TLR4 axis reduces regenerative potential of the liver by increasing the presence of negative cell cycle regulators - proteins p53 and p21, and also by decreasing the level of cyclin D1. The obtained results indicate the complexity of HMGB1 protein action in diabetes and underlines the importance of preventing the release of HMGB1 or blockage of HMGB1/TLR4 axis in order to delay the occurrence of liver damage

C20-nor-Abietane and Three Abietane Diterpenoids from Plectranthus mutabilis Leaves as P-Glycoprotein Modulators

In this study, a bioguided fractionation of Plectranthus mutabilis extract was performed by chromatographic methods. It yielded one new nor-abietane diterpene, mutabilol (1), and three known abietanes, coleon-U-quinone (2), 8α,9α-epoxycoleon-U-quinone (3), and coleon U (4). The abietane diterpenoid 5 was also tentatively identified using HPLC-MS/MS. Moreover, the extract profile and quantification of each isolated compound were determined by HPLC-DAD. Compound 4 was the major compound in the extract. Compounds 2-4 were found to be selective toward cancer cell lines and were able to inhibit P-glycoprotein (P-gp) activity in NCI-H460/R cells at longer exposure of 72 h and consequently revert doxorubicin (DOX) resistance in subsequent combined treatment. None of the compounds influenced the P-gp expression in NCI-H460/R cells, while the extract significantly increased it.acceptedVersionPeer reviewe

Biotinylated selenocyanates: Potent and selective cytostatic agents

Most of the currently available cytotoxic agents for tackling cancer are devoid of selectivity, thus causing severe side-effects. This situation stimulated us to develop new antiproliferative agents with enhanced affinity towards tumour cells. We focused our attention on novel chalcogen-containing compounds (thiosemicarbazones, disulfides, selenoureas, thio- and selenocyanates), and particularly on selenium derivatives, as it has been documented that this kind of compounds might act as prodrugs releasing selenium-based reactive species on tumour cells. Particularly interesting in terms of potency and selectivity was a pharmacophore comprised by a selenocyanato-alkyl fragment connected to a p-phenylenediamine residue, where the nature of the second amino moiety (free, Boc-protected, enamine-protected) provided a wide variety of antiproliferative activities, ranging from the low micromolar to the nanomolar values. The optimized structure was in turn conjugated through a peptide linkage with biotin (vitamin B7), a cellular growth promoter, whose receptor is overexpressed in numerous cancer cells; the purpose was to develop a selective vector towards malignant cells. Such biotinylated derivative behaved as a very strong antiproliferative agent, achieving GI50 values in the low nM range for most of the tested cancer cells; moreover, it was featured with an outstanding selectivity, with GI50 > 100 µM against human fibroblasts. Mechanistic studies on the mode of inhibition of the biotinylated selenocyanate revealed (Annexin-V assay) a remarkable increase in the number of apoptotic cells compared to the control experiment; moreover, depolarization of the mitochondrial membrane was detected by flow cytometry analysis, and with fluorescent microscopy, what supports the apoptotic cell death. Prior to the apoptotic events, cytostatic effects were observed against SW1573 cells using label-free cell-living imaging; therefore, tumour cell division was prevented. Multidrug resistant cell lines exhibited a reduced sensitivity towards the biotinylated selenocyanate, probably due to its P-gp-mediated efflux. Remarkably, antiproliferative levels could be restored by co-administration with tariquidar, a P-gp inhibitor; this approach can, therefore, overcome multidrug resistance mediated by the P-gp efflux system