Fibroblast Growth Factor Signalling in the Development of the Midbrain and Anterior Hindbrain

The embryonic midbrain and hindbrain give rise to brain stem structures and the cerebellum. The ventral midbrain and anterior hindbrain include highly important brain nuclei such as the dopaminergic substantia nigra and the ventral tegmental area, as well as serotonergic dorsal raphe neurons. These specific brain structures are affected in several disorders such as Parkinson s disease, depression, schizophrenia and drug addiction. Between the developing midbrain and hindbrain is a signalling centre called the Isthmic Organizer. This Isthmic Organizer secretes signalling molecules, such as Wnts and Fibroblast growth factors (Fgfs). Fgf8 is able to induce midbrain and anterior hindbrain characteristics in ectopic locations, and thus Fgf8 can act as an organizer molecule. Fgf signals are mediated by Fgf receptors (Fgfr). Of the four Fgfrs, Fgfr1-Fgfr3 are expressed in the nervous system. Fgfr1 is required to maintain coherence of a slowly dividing midbrain-hindbrain boundary cell population. However, the role of Fgfr2 and Fgfr3 in the development of midbrain and anterior hindbrain is poorly understood as well as cell adhesion molecules related to the maintenance of the coherent isthmic constriction. In this study, we elucidated the role of Fgfr2 and Fgfr3 during the development of the mid-brain and hindbrain. We showed that loss of either Fgfr2 or Fgfr3 alone or even both together did not result in any structural abnormalities. Thus, Fgfr1 is the major Fgf receptor in the midbrain and anterior hindbrain region. However, when Fgfr1 and Fgfr2, or all three Fgfr1, Fgfr2 and Fgfr3 were simultaneously inactivated, the defects in the midbrain-hindbrain development were much more severe than in the Fgfr1 mutants alone. Dorsal midbrain structures and the cerebellum were lost. Although some dopaminergic precursors appeared in the ventral midbrain, all dopaminergic neurons and several other ventral neuronal populations were lost by birth. We showed that Fgfr cooperatively regulate cell survival, antero-posterior patterning, and the maintenance of neural progenitor properties. Loss of Fgf signalling in the ventral midbrain resulted in a thinner ventricular zone and premature neurogenesis. This was not caused by shortened cell cycle length or abnormalities in cellular polarity, cellular architecture or the orientation of mitotic spindles. Instead, loss of Fgf signalling lead to a downregulation of neural stem cell transcription factors, which allowed upregulation of proneural genes. Thus, these gene expression changes drove neural progenitors to exit the cell cycle. In addition, we showed that Fgf8 is localized in the basal membrane. Thus, Fgf signalling may maintain proliferative identity of the midbrain neural progenitors, and the cells likely receive these guiding Fgf signals through their basal processes. Finally, we showed that an Fgf-regulated adhesion molecule Cadherin22 (Cdh22) is not essential for the maintenance of the coherent compartment boundary between the midbrain and the hindbrain. Possibly, Cdh22 acts redundantly with other type II cadherins. In addition, specific expression patterns in distinct brain nuclei suggest roles for Cdh22 in the segregation of neuronal populations cooperatively with other cadherins. In summary, these results demonstrate that Fgf signalling, and especially cooperation of the Fgf receptors, is required for proliferation, cell survival, and patterning of the neural progenitors in the midbrain and anterior hindbrain. A good understanding of developmental processes such as detailed mechanisms of signalling pathways and their regulation elucidates possibilities for therapeutic use.Alkionaikainen keski- ja taka-aivo muotoutuvat toimiviksi aivorungon rakenteiksi ja pikkuaivoiksi sikiön kehityksen aikana. Aivorungossa prosessoidaan mm. kuulo- ja näköimpulsseja, ja pikkuaivot toimivat kehon liikkeiden koordinoijana ja tasapainon säätelijöinä. Aivorungossa sijaitsee myös tärkeitä hermosolutumakkeita, joiden toiminnalliset häiriöt aiheuttavat mm. Parkinsonin tautia, masennusta, skitsofreniaa sekä huumausaineriippuvuutta. Näin ollen keski- ja taka-aivon kehityksen tutkimuksella saavutetaan tärkeää tietoa hermoston perustoiminnasta ja mahdollisista kehityksen aikana muodostuneista häiriöistä. Lisäksi hermosolujen kehityksen tuntemus voi mahdollistaa myös hermosolujen tuhoutumiseen johtavien tapahtumien ymmärtämistä. Aivot muodostuvat hermosoluista ja niiden toimintaa tukevista gliasoluista. Näiden erityyppisten hermo- ja gliasolujen on muodostuttava oikeissa paikoissa oikeaan aikaan ja sen lisäksi niiden pitää kytkeytyä toisiin hermosoluihin toimivan hermoverkoston saavuttamiseksi. Alkionaikaista tapahtumaa, joka määrittää, mitkä solut mihinkin aivojen osaan milloinkin muodostuu, kutsutaan kaavoittumiseksi. Tätä kaavoittumista ohjataan signaalikeskusten kautta, jotka yleensä muodostuvat eri aivoalueiden rajapinnalle. Kehittyvien keski- ja taka-aivon rajapinnalle muodostuu yksi näistä signaalikeskuksista, Istmuksen säätelykeskus. Tämä signaalikeskus ilmentää erilaisia signaalimolekyylejä, kuten Wnt -signaaleja ja Fibroblastikasvutekijöitä (Fgf). Signaalimolekyylit taas ohjaavat erilaisten transkriptiotekijöiden aktivoitumista tietyissä paikoissa kehittyvää aivokudosta. Erilaisten traskriptiotekijöiden ilmentyminen määrää, minkä tyyppisiä hermosoluja syntyy millekin aivoalueelle. Tässä väitöskirjatutkimuksessa keskityin tarkastelemaan Fgf signalointia keski- ja taka-aivojen alueella. Tutkimuksessa käytimme muutogeenisiä hiiriä, joilta tarkasteltavien geenien toiminta oli poistettu kyseiseltä aivoalueelta. Tutkimuksemme osoitti, että keski- ja taka-aivojen kehityksessä Fgf signaalit välittyvät solun sisään kaikkien kolmen alueella ilmentyvän Fgf reseptorimolekyylin kautta. Osoitimme, että näiden reseptorien yhteistyö ja sitä kautta tapahtuva Fgf signalointi säätelee kaavoittumista ja solujen hengissä pysymistä, sekä ylläpitää hermoston esiastesolujen jakautumista keski- ja taka-aivojen alueella. Fgf signaloinnin puuttuminen alueelta johti ennenaikaiseen hermosolujen muodostumiseen ja täten vähentyneeseen hermosolujen määrään alueella. Vähentynyt Fgf signalointi johti solun jakautumista ylläpitävien transkriptiotekijöiden vähenemiseen ja tätä kautta erilaistumista edistävien geenien toiminnan lisääntymiseen sekä hermosolujen ennenaikaiseen erilaistumiseen. Oikean kaavoittumisen lisäksi hermoston kehitykselle on tärkeää tiettyjen tumakkeiden muotoutuminen ja pysyminen tiiviinä hermosolupopulaationa, sekä hermosolujen kytkeytyminen toisiin soluihin oikealla tavalla. Solujen välisten kontaktien muodostumisesta vastaavat soluadheesiomolekyylit. Samanlaiset hermosolut ja usein myös hermoverkostot ilmentävät samaa soluadheesiomolekyyliä. Tässä tutkimuksessa selvitimme erityisesti keski- ja taka-aivojen rajapinnalla esiintyvän soluadheesiomolekyylin toimintaa. Havaitsimme, ettei tätä soluadheesiomolekyyliä yksinään tarvita pitämään keski- ja taka-aivojen rajapinnan soluja tiiviinä populaationa. Todennäköisesti useamman soluadhesiomolekyylin yhteistoimintaa tarvitaan tähän prosessiin. Tämä tutkimus osoittaa, että keski- ja taka-aivojen alueella Fgf signalointia tarvitaan hermoston esiastesolujen jakautumiseen, hengissä pysymiseen ja oikeaan kaavoittumiseen. Kyseisen aivoalueen kehityksen parempi tuntemus, erilaisten signaalireittien toiminnan valottaminen sekä yhteisvaikutusten selvittäminen avaa mahdollisuuksia hoitomuotojen kehittämiselle esimerkiksi neurologisissa häiriöissä ja syövissä

Beta-Catenin Regulates Intercellular Signalling Networks and Cell-Type Specific Transcription in the Developing Mouse Midbrain-Rhombomere 1 Region

Peer reviewe

Characterization of neural crest-derived stem cells isolated from human bone marrow for improvement of transplanted islet function

Background: Murine boundary cap-derived neural crest stem cells (NCSCs) are capable of enhancing islet function by stimulating beta cell proliferation as well as increasing the neural and vascular density in the islets both in vitro and in vivo. This study aimed to isolate NCSC-like cells from human bone marrow. Methods: CD271 magnetic cell separation and culture techniques were used to purify a NCSC-enriched population of human bone marrow. Analyses of the CD271+ and CD271- fractions in terms of protein expression were performed, and the capacity of the CD271+ bone marrow cells to form 3-dimensional spheres when grown under non-adherent conditions was also investigated. Moreover, the NCSC characteristics of the CD271+ cells were evaluated by their ability to migrate toward human islets as well as human islet-like cell clusters (ICC) derived from pluripotent stem cells. Results: The CD271+ bone marrow population fulfilled the criterion of being multipotent stem cells, having the potential to differentiate into glial cells, neurons as well as myofibroblasts in vitro. They had the capacity to form 3-dimensional spheres as well as an ability to migrate toward human islets, further supporting their NCSC identity. Additionally, we demonstrated similar migration features toward stem cell-derived ICC. Conclusion: The results support the NCSC identity of the CD271-enriched human bone marrow population. It remains to investigate whether the human bone marrow-derived NCSCs have the ability to improve transplantation efficacy of not only human islets but stem cell-derived ICC as well.Peer reviewe

Differentiating functional human islet-like aggregates from pluripotent stem cells

Publisher Copyright: © 2022 The Author(s)We present here a robust and reliable protocol by which to differentiate pancreatic islet-like aggregates (SC-islets) from human pluripotent stem cells. The 7-stage protocol mimics developmental patterning factors that induce endocrine lineage formation and spans monolayer, microwell, and aggregate suspension culture. The SC-islets demonstrate dynamic glucose-sensitive insulin secretion and an endocrine cell composition similar to those of primary human islets. SC-islets generated using this optimized protocol are suitable for in vitro modeling of islet cell pathophysiology and therapeutic applications. For complete details on the use and execution of this protocol, please refer to Balboa et al. (2022).Peer reviewe

The type 1 diabetes gene TYK2 regulates beta-cell development and its responses to interferon-alpha

The TYK2 gene is associated with development of type 1 diabetes. Here the authors show that TYK2 regulates beta-cell development, but at the same time TYK2 inhibition in the islets prevents IFN alpha responses and enhances their survival against CD8(+) T-cell cytotoxicity; representing a potent therapeutic target to halt T1D progression. Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease that results in the destruction of insulin producing pancreatic beta-cells. One of the genes associated with T1D is TYK2, which encodes a Janus kinase with critical roles in type-Iota interferon (IFN-Iota) mediated intracellular signalling. To study the role of TYK2 in beta-cell development and response to IFN alpha, we generated TYK2 knockout human iPSCs and directed them into the pancreatic endocrine lineage. Here we show that loss of TYK2 compromises the emergence of endocrine precursors by regulating KRAS expression, while mature stem cell-islets (SC-islets) function is not affected. In the SC-islets, the loss or inhibition of TYK2 prevents IFN alpha-induced antigen processing and presentation, including MHC Class Iota and Class Iota Iota expression, enhancing their survival against CD8(+) T-cell cytotoxicity. These results identify an unsuspected role for TYK2 in beta-cell development and support TYK2 inhibition in adult beta-cells as a potent therapeutic target to halt T1D progression.Peer reviewe

Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells

Transplantation of pancreatic islet cells derived from human pluripotent stem cells is a promising treatment for diabetes. Despite progress in the generation of stem-cell-derived islets (SC-islets), no detailed characterization of their functional properties has been conducted. Here, we generated functionally mature SC-islets using an optimized protocol and benchmarked them comprehensively against primary adult islets. Biphasic glucose-stimulated insulin secretion developed during in vitro maturation, associated with cytoarchitectural reorganization and the increasing presence of alpha cells. Electrophysiology, signaling and exocytosis of SC-islets were similar to those of adult islets. Glucose-responsive insulin secretion was achieved despite differences in glycolytic and mitochondrial glucose metabolism. Single-cell transcriptomics of SC-islets in vitro and throughout 6 months of engraftment in mice revealed a continuous maturation trajectory culminating in a transcriptional landscape closely resembling that of primary islets. Our thorough evaluation of SC-islet maturation highlights their advanced degree of functionality and supports their use in further efforts to understand and combat diabetes. Pancreatic islets derived from stem cells are benchmarked against primary cells.Peer reviewe

Transposition-based method for the rapid generation of gene-targeting vectors to produce Cre/Flp-modifiable conditional knock-out mice

Peer reviewe

Modeling congenital hyperinsulinism with patient stem cell derived beta cells

Synnynnäisen hyperinsulinismin tautimallinnus kantasoluperäisten beetasolujen avulla TAUSTA: Synnynnäinen hyperinsulinismi on haiman saarekkeiden insuliinia tuottavien beetasolujen perinnöllinen sairaus. Beetasolun tehtävä kehossa on aistia verensokeritasoa ja erittää verensokeria laskevaa insuliinia. Yleisimmin se johtuu beetasolun KATP-kanavan mutaatiosta (KATP-HI) mikä johtaa beetasolun kykenemättömyyteen aistia verensokeritasoa ja jatkuvaan insuliinineritykseen. KATP-HI ilmenee vastasyntyneellä hyvin matalana verensokerina, mikä vaarantaa aivojen kehityksen ja voi uhata henkeä. Suuri osa KATP-HI -potilaista ei reagoi nykykäytössä oleville lääkkeille. Olisi tarve kehittää parempia hoitoja tähän vakavaan sairauteen, mutta se on vaikeaa sillä ainoa lähde tutkimuksessa tarvittavaan beetasolumateriaaliin on aivokuolleet luovuttajat. Tämän tutkimuksen tavoitteena on kehittää uusi tautimalli KATP-HI:n tutkimukseen, mikä mahdollistaisi laajamittaiset lääkekokeet. MENETELMÄT: KATP-HI potilaalta eristettiin ihosoluja jotka ohjelmoitiin monikykyisiksi kantasoluiksi. Nämä kantasolut vastaavat alkionkehityksessä ensimmäisiä hedelmöittyneestä munasolusta jakautuvia soluja ja voivat siten erilaistua miksi tahansa elimistön kudokseksi. Kantasoluja erilaistettiin beetasoluiksi maljalla antamalla niille sikiönaikaista kehitystä jäljitteleviä kasvutekijöitä. Näitä beetasoluja verrattiin samaan tapaan terveistä soluista tuotettuihin beetasoluihin. TULOKSET: Sairaat beetasolut tuottivat enemmän insuliinia matalassa sokerissa eivätkä reagoineet KATP-HIssa käytettäviin lääkkeisiin. Näitä beetasoluja siirrettiin myös immuunipuutteisiin hiiriin. Sairaan siirteen saaneille hiirille kehittyi matalampi verensokeri ja niiden verenkierrossa havaittiin korkeammat pitoisuudet ihmisperäistä insuliinia myös paaston ja niille aiheutetun matalan verensokeriin aikana. YHTEENVETO: Olemme luoneet tautimallin joka jäljittelee KATP-HI sairauden piirteet maljalla sekä elävässä eläimessä, mikä mahdollistaa mm. uusien hoitomuotojen etsimisen KATP-HI -potilaiden auttamiseksi.Modeling congenital hyperinsulinism with patient stem cell derived β cells Congenital hyperinsulinism (CHI), caused by mutations in the KATP -channel encoding genes (KATPHI), is a potentially life-threatening disorder of the beta cells. We aimed to create a model of KATPHI based on patient iPSC derived beta-like cells (BLCs) to allow future studies for improved management of KATPHI. Cells were derived from a patient with a homozygous ABCC8V187D -mutation, leading to loss of KATP -channel membrane expression due to loss of the SUR1 subunit, causing diazoxide unresponsive diffuse CHI. The mutation was corrected with CRISPR/Cas9 to enable controlled studies with isogenic cells. Quantification of the in vitro differentiated endocrine populations showed increased differentiation to beta- and delta cells in the SUR1-mutants. The proliferation of insulin positive cells was also increased in the SUR1-mutants. The SUR1-mutant BLCs secreted more insulin and did not respond to KATP -channel acting drugs in vitro. Mice carrying implants of SUR1-mutant islet-like clusters developed hyperinsulinemic hypoglycemia and their grafts failed to shut down insulin secretion during hypoglycemia. In conclusion, we have created a model of KATPHI in vitro and in humanized mice allowing study of pathophysiology and management of KATPHI