The role of the calmodulin-binding and calmodulin-like domains of the epidermal growth factor receptor in tyrosine kinase activation

The epidermal growth factor receptor (EGFR) harbors a calmodulin (CaM)-binding domain (CaM-BD) and a CaM-like domain (CaM-LD) upstream and downstream, respectively, of the tyrosine kinase (TK) domain. We demonstrate in this paper that deletion of the positively charged CaM-BD (EGFR/CaM-BD∆) inactivated the TK activity of the receptor. Moreover, deletion of the negatively charged CaM-LD (EGFR/CaM-LD∆), leaving a single negative residue (glutamate), reduced the activity of the receptor. In contrast, substituting the CaM-LD with a histidine/valine-rich peptide (EGFR/InvCaM-LD) caused full inactivation. We also demonstrated using confocal microscopy and flow cytometry that the chimera EGFR-green fluorescent protein (GFP)/CaM-BD∆, the EGFR/CaM-LD∆, and EGFR/InvCaM-LD mutants all bind tetramethylrhodamine-labelled EGF. These EGFR mutants were localized at the plasma membrane as the wild-type receptor does. However, only the EGFR/CaM-LD∆ and EGFR/InvCaM-LD mutants appear to undergo ligand-dependent internalization, while the EGFR-GFP/CaM-BD∆ mutant seems to be deficient in this regard. The obtained results and in silico modelling studies of the asymmetric structure of the EGFR kinase dimer support a role of a CaM-BD/CaM-LD electrostatic interaction in the allosteric activation of the EGFR TK.Consejería de Educación, Juventud y Deportes–Comunidad de Madrid,Grant/Award Number: B2017/BMD‐36involving contributions from the EuropeanFunds for Regional Development (EFRD) andthe Social European Fund (SEF); ConsejoSuperior de Investigaciones Científicas, Grant/Award Number: COOPA20053;Secretaría de Estado de Investigación, Desarrollo e Innovación, Grant/Award Number: SAF2014‐52048‐R; Agencia Española de Cooperación Internacional para el Desarrollo, Grant/Award Numbers: A/019018/08,A/5444/06, A/8197/0

Molecular and functional characterization of polymorphisms in the secreted phospholipase A2 group X gene: relevance to coronary artery disease

Among secreted phospholipases A2 (sPLA2s), human group X sPLA2 (hGX sPLA2) is emerging as a novel attractive therapeutic target due to its implication in inflammatory diseases. To elucidate whether hGX sPLA2 plays a causative role in coronary artery disease (CAD), we screened the human PLA2G10 gene to identify polymorphisms and possible associations with CAD end-points in a prospective study, AtheroGene. We identified eight polymorphisms, among which, one non-synonymous polymorphism R38C in the propeptide region of the sPLA2. The T-512C polymorphism located in the 5′ untranslated region was associated with a decreased risk of recurrent cardiovascular events during follow-up. The functional analysis of the R38C polymorphism showed that it leads to a profound change in expression and activity of hGX sPLA2, although there was no detectable impact on CAD risk. Due to the potential role of hGX sPLA2 in inflammatory processes, these polymorphisms should be investigated in other inflammatory diseases

La phospholipase A2 sécrétée de groupe X : Maturation protéolytique et rôles fonctionnels

The superfamily of phospholipase A2 currently consists of at least eleven secreted phospholipases A2 (sPLA2s) and twelve intracellular phospholipases A2. These proteins catalyze the hydrolysis of phospholipids at the sn-2 position, releasing free fatty acids and lysophospholipids. Furthermore, phospholipase A2 controls the production of a variety of lipid mediators which are important for multiple cellular functions in various physiological or physiopathological contexts such as inflammatory diseases and cancer. Group X sPLA2 was cloned in 1997 and have peculiar molecular properties. sPLA2-X has the most potent hydrolyzing activity toward phosphatidylcholine and is involved in arachidonic acid (AA) release. sPLA2-X is produced as a proenzyme and has a propeptide of 11 amino acids ending with a dibasic motif. The cellular location and the protease(s) involved in proenzyme conversion have remained unclear. The work of this thesis has allowed to better define the way by which the maturation of group X sPLA2 can be made and how this sPLA2 functions at both physiological and physiopathological levels. Our in vitro studies with recombinant group X proenzymes and transfected cells (HEK293) have shown that a furin-like protease plays a major role in the activation of the enzyme during its secretion. Our work also suggests that the removal of the propeptide can also occur via other proteases and extracellularly as found when using the human colon cancer cell line LOVO as a cellular model. We also studied the maturation of sPLA2-X in mouse tissues in various physiological and physiopathological conditions. Of note, we found that sPLA2-X is stored in large amount and likely in an active form in the acrosome of mouse sperm cells. Finally we discovered a human polymorphism in the propeptide sequence mutating Arg-38 into cysteine and leading to the secretion of an inactive protein that is rapidly degraded after synthesis. In the second part of this thesis, we have shown that the active form of sPLA2-X, but not its proenzyme is able i) to stimulate the proliferation of various mouse colon cell lines, including Colon-26 cancer cells, ii) to protect human red blood cells from infection by P. falciparum, the parasite of malaria, and iii) to control the acrosomal reaction of mouse sperm during capacitation with an important impact on the outcome of in vitro fertilization.Les phospholipases A2 constituent une superfamille de protéines comprenant au moins onze phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) et douze phospholipases A2 intracellulaires. Ces protéines catalysent l'hydrolyse des phospholipides en position sn-2, libérant un acide gras et un lysophospholipide. Elles contrôlent ainsi la production d'une variété de médiateurs lipidiques qui sont importants pour de multiples fonctions cellulaires dans différents contextes physiologiques ou physiopathologiques (maladies inflammatoires et cancer). La sPLA2 de groupe X a été clonée au laboratoire en 1997 et possède des propriétés moléculaires uniques. Son ARN messager est présent dans différents tissus, mais semble peu régulé par des stimuli proinflammatoires. L'enzyme est unique dans sa capacité à libérer des médiateurs lipidiques à partir des phospholipides cellulaires ou des lipoprotéines et possède aussi des propriétés antimicrobiennes variées. Un élément clé de la régulation fonctionnelle de la sPLA2 de groupe X est vraisemblablement lié à la présence d'un propeptide dans sa partie N-terminale. Le lieu de la maturation protéolytique de la sPLA2 de groupe X (dans la cellule avant sécrétion ou à l'extérieur après sécrétion du proenzyme), les protéases impliquées et la régulation de cette maturation dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques sont inconnus. Le travail de cette thèse a permis de mieux comprendre comment peut s'effectuer la maturation de la sPLA2 de groupe X et quels sont ses rôles physiologiques et physiopathologiques. Concernant la maturation, nos études in vitro sur protéines purifiées et en cellules transfectées (HEK293) ont permis de montrer qu'une protéase de type furine contribue de façon majeure à l'activation de l'enzyme, vraisemblablement au cours de sa sécrétion. Nos travaux suggèrent aussi qu'une maturation est possible par d'autres protéases et dans le milieu extracellulaire comme par exemple dans les cellules LOVO. Nous avons aussi tenté de mettre en évidence cette maturation dans des tissus murins dans certaines conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous avons notamment trouvé que la sPLA2-X était la sPLA2 majeure présente dans l'acrosome des spermatozoïdes. Enfin nous avons observé un polymorphisme présent dans le propeptide de la sPLA2 humaine qui conduit à la formation d'une protéine inactive et rapidement dégradée. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons montré que la forme active de la sPLA2 de groupe X, mais pas son proenzyme était capable i) de stimuler la prolifération cellulaire dans un contexte de cancer colorectal, ii) d'exercer une action toxique contre le parasite de la malaria P.falciparum lors de l'infection de globules rouges humains, et iii) de contrôler la réaction acrosomique des spermatozoïdes de souris, avec un impact important sur le taux de fécondité dans des tests de fécondation in vitro

La phospholipase A2 sécrétée de groupe X (maturation protéolytique et rôles fonctionnels)

Les phospholipases A2 constituent une superfamille de protéines comprenant au moins onze phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) et douze phospholipases A2 intracellulaires. Ces protéines catalysent l hydrolyse des phospholipides en position sn-2, libérant un acide gras et un lysophospholipide. Elles contrôlent ainsi la production d une variété de médiateurs lipidiques qui sont importants pour de multiples fonctions cellulaires dans différents contextes physiologiques ou physiopathologiques (maladies inflammatoires et cancer). La sPLA2 de groupe X a été clonée au laboratoire en 1997 et possède des propriétés moléculaires uniques. Son ARN messager est présent dans différents tissus, mais semble peu régulé par des stimuli proinflammatoires. L enzyme est unique dans sa capacité à libérer des médiateurs lipidiques à partir des phopholipides cellulaires ou des lipoprotéines et possède aussi des propriétés antimicrobiennes variées. Un élément clé de la régulation fonctionnelle de la sPLA2 de groupe X est vraisemblablement lié à la présence d un propeptide dans sa partie N-terminale. Le lieu de la maturation protéolytique de sPLA2 de groupe X (dans la cellule avant sécrétion ou à l extérieur après sécrétion du proenzyme), les protéases impliquées et la régulation de cette maturation dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques sont inconnus. Le travail de cette thèse a permis de mieux comprendre comment peut s effectuer la maturation de la sPLA2 de groupe X et quels sont ses rôles physiologiques et physiopathologiques. Concernant la maturation, nos études in vitro sur protéines purifiées et en cellules transfectées (HEK293) ont permis de montrer qu une protéase de type furine contribue de façon majeure à l activation de l enzyme, vraisemblablement au cours de sa sécrétion. Nos travaux suggèrent aussi qu une maturation est possible par d autres protéases et dans le milieu extracellulaire comme par exemple dans les cellules LOVO. Nous avons aussi tenté de mettre en évidence cette maturation dans des tissus murins dans certaines conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous avons notamment trouvé que la sPLA2-X était la sPLA2 majeure présente dans l acrosome des spermatozoïdes. Enfin nous avons observé un polymorphisme présent dans le propeptide de la sPLA2 humaine qui conduit à la formation d une protéine inactive et rapidement dégradée. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons montré que la forme active de la sPLA2 de groupe X, mais pas son proenzyme était capable i) de stimuler la prolifération cellulaire dans un contexte de cancer colorectal, ii) d exercer une action toxique contre le parasite de la malaria P. falciparum lors de l infection de globules rouges humains, et iii) de contrôler la réaction acrosomique des spermatozoïdes de souris, avec un impact important sur le taux de fécondité dans des tests de fécondation in vitro.NICE-BU Sciences (060882101) / SudocSudocFranceF

Effects of the propeptide of group X secreted phospholipase A2 on substrate specificity and interfacial activity on phospholipid monolayers

International audienc

Group X Phospholipase A2 Stimulates the Proliferation of Colon Cancer Cells by Producing Various Lipid Mediators

Among mammalian secreted phospholipases A2 (sPLA2s), the group X enzyme has the most potent hydrolyzing capacity toward phosphatidylcholine, the major phospholipid of cell membrane and lipoproteins. This enzyme has recently been implicated in chronic inflammatory diseases such as atherosclerosis and asthma and may also play a role in colon tumorigenesis. We show here that group X sPLA2 [mouse (m)GX] is one of the most highly expressed PLA2 in the mouse colon and that recombinant mouse and human enzymes stimulate proliferation and mitogen-activated protein kinase activation of various colon cell lines, including Colon-26 cancer cells. Among various recombinant sPLA2s, mGX is the most potent enzyme to stimulate cell proliferation. Based on the use of sPLA2 inhibitors, catalytic site mutants, and small interfering RNA silencing of cytosolic PLA2α and M-type sPLA2 receptor, we demonstrate that mGX promotes cell proliferation independently of the receptor and via its intrinsic catalytic activity and production of free arachidonic acid and lysophospholipids, which are mitogenic by themselves. mGX can also elicit the production of large amounts of prostaglandin E2 and other eicosanoids from Colon-26 cells, but these lipid mediators do not play a role in mGX-induced cell proliferation because inhibitors of cyclooxygenases and lipoxygenases do not prevent sPLA2 mitogenic effects. Together, our results indicate that group X sPLA2 may play an important role in colon tumorigenesis by promoting cancer cell proliferation and releasing various lipid mediators involved in other key events in cancer progression

Group X phospholipase A2 is released during sperm acrosome reaction and controls fertility outcome in mice.

International audienceEjaculated mammalian sperm must undergo a maturation process called capacitation before they are able to fertilize an egg. Several studies have suggested a role for members of the secreted phospholipase A2 (sPLA2) family in capacitation, acrosome reaction (AR), and fertilization, but the molecular nature of these enzymes and their specific roles have remained elusive. Here, we have demonstrated that mouse group X sPLA2 (mGX) is the major enzyme present in the acrosome of spermatozoa and that it is released in an active form during capacitation through spontaneous AR. mGX-deficient male mice produced smaller litters than wild-type male siblings when crossed with mGX-deficient females. Further analysis revealed that spermatozoa from mGX-deficient mice exhibited lower rates of spontaneous AR and that this was associated with decreased in vitro fertilization (IVF) efficiency due to a drop in the fertilization potential of the sperm and an increased rate of aborted embryos. Treatment of sperm with sPLA2 inhibitors and antibodies specific for mGX blocked spontaneous AR of wild-type sperm and reduced IVF success. Addition of lysophosphatidylcholine, a catalytic product of mGX, overcame these deficiencies. Finally, recombinant mGX triggered AR and improved IVF outcome. Taken together, our results highlight a paracrine role for mGX during capacitation in which the enzyme primes sperm for efficient fertilization and boosts premature AR of a likely phospholipid-damaged sperm subpopulation to eliminate suboptimal sperm from the pool available for fertilization