Evaluación de la resistencia al virus de PLRV mediante el mecanismo de ARN de Interferencia (ARNi) en líneas transgénicas

El virus del enrollamiento de la papa (PLRV) es responsable de pérdidas severas en el rendimiento y calidad del cultivo de la papa en todo el mundo. Existen papas nativas y especies silvestres que presentan altos niveles de resistencia a PLRV (Solanum brevidens, S. tuberosum, S. chacoencse y S. raphanifolium). El desarrollo de nuevas variedades utilizando estas fuentes de resistencia es uno de los retos actuales del mejoramiento genético, sin embargo la naturaleza genética del cultivo de la papa que se desea mejorar es en la mayoría de los casos incompatible entre cultivos, sumándose a ello que la obtención de estos cultivos mejorados es cerca de 20 años. Por lo tanto la inserción directa de un gen que confiere resistencia a una variedad de importancia comercial tiene una ventaja muy significativa. En la presente tesis se evaluaron diez eventos (variedad Desiree) transformados con un constructo tipo hairpin que contenía el sistema de ARN de interferencia (ARNi), el cual mantiene activo y constante la formación del ARNdc entre las secuencias homólogas del transgen y el virus de PLRV. Los eventos fueron caracterizados por PCR y Southern blot, evidenciándose que tenían en su genoma entre una a dos copias del transgen. Los ensayos serológicos de DASELISA seleccionaron cuatro eventos con alta resistencia (bajas o nulas concentraciones del virus PLRV) durante su infección primaria, secundaria y terciaria. Finalmente, se determinó por Northern Blot que la resistencia a PLRV está relacionada con la presencia de los fragmentos pequeños de ARN (ARNsi) formados a partir del mecanismo de ARNi. -- PALABRAS CLAVE: Papa, transformación, PLRV, ARNi, ARNsi.-- Potato Leafroll Virus (PLRV) is responsible for severe losses in yield and quality of potato worldwide. There are native and wild potatoes with high levels of resistance to PLRV (Solanum brevidens, S. etuberosum, and S. chacoencse raphanifolium).The development of new varieties using these sources of resistance is one of the current challenges of genetic improvement crop, however the genetic nature of the potato in most cases is incompatible between varieties, moreover to obtain the desired resistance takes over 20 years. Therefore the direct insertion of a gene that confers resistance to a variety of commercial importance have a significant advantage. The present thesis evaluated ten events (Desiree variety) transformed with a hairpin-type construct, containing the RNA interference system (RNAi), it will keep active and constant the formation of dsRNA between the homology sequence of transgene and PLRV. The events were characterized by PCR and Southern blot; they had in their genome from one to two copies of the transgene. Serological tests of DAS-ELISA selected four events with high resistance (low or zero concentrations of PLRV) during primary, secondary and tertiary infection. Finally, it was determined by Northern Blot that the resistance to PLRV is related to the presence of fragments of small interference RNA (siRNA) formed from the mechanism of RNAi. -- KEY WORDS: Potato, transformation, PLRV, RNAi, siRNA.Tesi

Transformación genética con el gen Rpi-blb2 y evaluación de la resistencia a Phytophthora infestans en Solanum tuberosum L. variedad Desiree

Publicación a texto completo no autorizada por el autorSeñala que el oomiceto Phytophthora infestans es un agente causal de la enfermedad denominada tizón tardío, es responsable del déficit en rendimiento y producción así como pérdidas económicas de aproximadamente $3,50 billones anuales en áreas de cultivo de papa a nivel mundial. Existen plantas silvestres del mismo género de la papa (Solanum demissum), que poseen genes mayores de resistencia (R) y confieren resistencia al tizón tardío. Sin embargo el desarrollo de variedades resistentes por introgresión de estos genes no ha logrado una resistencia duradera por ser un proceso lento. En la presente tesis se reporta la introducción por Agrobacterium tumefaciens del gen Rpi-blb2 de S. bulbocastanum a la especie susceptible Solanum tuberosum L. variedad Desiree, la caracterización molecular de 29 eventos trasformados e infección de planta completa con los aislados peruanos de P. infestans, POX067 y PSR19, y la expresión del gen Rpi-blb2 por RT-PCR. Los eventos Desiree [Rpi-blb2] 4 y Desiree [Rpi-blb2] 30, con dos copias del transgen presentaron severidad del ≥21-50% (resistencia intermedia), a las infecciones de P. infestans. Se comprobó la transferencia del gen Rpi-blb2 de una especie silvestre a una cultivada mediante transformación genética.Tesi

Molecular identification of Pichia guillermondii isolated from mine water acidic of Peru and its resistance to heavy metals

Las aguas ácidas de minas tienen una considerable diversidad de microorganismos eucariontes, entre ellos hongos y protistas; en particular, poco se conoce sobre la diversidad de levaduras en drenajes ácidos de minas peruanas. En el presente estudio se aisló y caracterizó la levadura 1MA9, mediante la amplificación y secuenciación del LSU D1/D2 del gen rRNA 26S. La cepa 1MA9 se identificó molecularmente como Pichia guillermondi, ésta presentó una resistencia alta a Mn2+ (>400 mM), intermedia a iones Zn2+ y Co2+ (400—600 mM), pero fue sensible a iones Cu2+. Este trabajo representa el primer reporte de levaduras en ambientes acuáticos ácidos proveniente de minas peruanas.Microbe eukaryotes like fungi and protista are common in the drainage of mines. Few information is known on microbial diversity of acid drainages of Peruvian mines. In this work we isolated and characterized the 1M9 yeast. We utilized LSU D1/D2 of the 26S rRNA gene sequence phylogenetic analyses to characterize the diversity the yeast 1MA9 isolated. The strain 1MA9 was closely related to the Pichia guilliermondii. The yeast showed high resistance to Mn2+ (>400 mM), intermediate to ions Zn2+ and Co2+ (400—600 mM), but sensible to ions Cu2+. This work provides the first data on yeasts from an aquatic acid environment of Peruvian mines

Identificación molecular de Pichia guillermondii aislada de aguas ácidas de minas en el Perú y su resistencia a metales pesados

Las aguas ácidas de minas tienen una considerable diversidad de microorganismos eucariontes, entre ellos hongos y protistas; en particular, poco se conoce sobre la diversidad de levaduras en drenajes ácidos de minas peruanas. En el presente estudio se aisló y caracterizó la levadura 1MA9, mediante la amplificación y secuenciación del LSU D1/D2 del gen rRNA 26S. La cepa 1MA9 se identificó molecularmente como Pichia guillermondi, ésta presentó una resistencia alta a Mn2+ (>400 mM), intermedia a iones Zn2+ y Co2+ (400—600 mM), pero fue sensible a iones Cu2+. Este trabajo representa el primer reporte de levaduras en ambientes acuáticos ácidos proveniente de minas peruanas

Identificación molecular de Pichia guillermondii aislada de aguas ácidas de minas en el Perú y su resistencia a metales pesados

Microbe eukaryotes like fungi and protista are common in the drainage of mines. Few information is known on microbial diversity of acid drainages of Peruvian mines. In this work we isolated and characterized the 1M9 yeast. We utilized LSU D1/D2 of the 26S rRNA gene sequence phylogenetic analyses to characterize the diversity the yeast 1MA9 isolated. The strain 1MA9 was closely related to the Pichia guilliermondii. The yeast showed high resistance to Mn2+ (>400 mM), intermediate to ions Zn2+ and Co2+ (400-600 mM), but sensible to ions Cu2+. This work provides the first data on yeasts from an aquatic acid environment of Peruvian mines.Las aguas ácidas de minas tienen una considerable diversidad de microorganismos eucariontes, entre ellos hongos y protistas; en particular, poco se conoce sobre la diversidad de levaduras en drenajes ácidos de minas peruanas. En el presente estudio se aisló y caracterizó la levadura 1MA9, mediante la amplificación y secuenciación del LSU D1/D2 del gen rRNA 26S. La cepa 1MA9 se identificó molecularmente como Pichia guillermondi, ésta presentó una resistencia alta a Mn2+ (>400 mM), intermedia a iones Zn2+ y Co2+ (400-600 mM), pero fue sensible a iones Cu2+. Este trabajo representa el primer reporte de levaduras en ambientes acuáticos ácidos proveniente de minas peruanas

Marker-free PLRV resistant potato mediated by Cre-loxP excision and RNAi

An inverted repeat construct corresponding to a segment of the potato leaf roll virus coat protein gene was created under control of a constitutive promoter and transferred into a transformation vector with a heat inducible Cre-loxP system to excise the nptII antibiotic resistance marker gene. Fifty-eight transgenic events were evaluated for resistance to PLRV by greenhouse inoculations, which lead to the identification of 7 highly resistant events, of which 4 were extremely resistant. This resistance was also highly effective against accumulation in subsequent tuber generations from inoculated plants, which has not been reported before. Northern blot analysis showed correlation of PLRV specific siRNA accumulation with the level of PLRV resistance. Heat mediated excision of the nptII antibiotic resistance gene in PLRV resistant events was highly efficient in one event with full excision in 71 % of treated explants. On the other hand 8 out of 10 analyzed events showed truncated T-DNA insertions lacking one of the two loxP sites as determined by PCR and confirmed by sequencing flanking regions in 2 events, suggesting cryptic LB sites in the non-coding region between the nptII gene and the flanking loxP site. Accordingly, it is proposed to modify the Cre-loxP vector by reducing the 1 kb size of the region between nptII, loxP, and the LB