Sublethal exposure of small few-layer graphene promotes metabolic alterations in human skin cells

Small few-layer graphene (sFLG), a novel small-sized graphene-related material (GRM), can be considered as an intermediate degradation product of graphene. GRMs have a promising present and future in the field of biomedicine. However, safety issues must be carefully addressed to facilitate their implementation. In the work described here, the effect of sub-lethal doses of sFLG on the biology of human HaCaT keratinocytes was examined. A one-week treatment of HaCaTs with sub-lethal doses of sFLG resulted in metabolome remodeling, dampening of the mitochondrial function and a shift in the redox state to pro-oxidant conditions. sFLG raises reactive oxygen species and calcium from 24 hours to one week after the treatment and this involves the activation of NADPH oxidase 1. Likewise, sFLG seems to induce a shift from oxidative phosphorylation to glycolysis and promotes the use of glutamine as an alternative source of energy. When sub-toxic sFLG exposure was sustained for 30 days, an increase in cell proliferation and mitochondrial damage were observed. Further research is required to unveil the safety of GRMs and degradation-derived products before their use in the workplace and in practical applications

The role of xanthine oxidase and NADH dehydrogenase.

The extraordinary physicochemical properties of graphene-based nanomaterials (GBNs) make them promising tools in nanotechnology and biomedicine. Considering the skin contact as one of the most feasible exposure routes to GBNs, the mechanism of toxicity of two GBNs (few-layer-graphene, FLG, and graphene oxide, GO) towards human HaCaT skin keratinocytes was investigated. Both materials induced a significant mitochondrial membrane depolarization: 72 h cell exposure to 100 µg mL-1 FLG or GO increased mitochondrial depolarization by 44% and 56%, respectively, while the positive control valinomycin (0.1 µg mL-1) increased mitochondrial depolarization by 48%. Since the effect was not prevented by cyclosporine-A, it appears to be unrelated to mitochondrial transition pore opening. By contrast, it seems to be mediated by reactive oxygen species (ROS) production: FLG and GO induced time- and concentration-dependent cellular ROS production, significant already at the concentration of 0.4 µg mL-1 after 24 h exposure. Among a panel of specific inhibitors of the major ROS-producing enzymes, diphenyliodonium, rotenone and allopurinol significantly reverted or even abolished FLG- or GO-induced ROS production. Intriguingly, the same inhibitors also significantly reduced FLG- or GO-induced mitochondrial depolarization and cytotoxicity. This study shows that FLG and GO induce a cytotoxic effect due to a sustained mitochondrial depolarization. This seems to be mediated by a significant cellular ROS production, caused by the activation of flavoprotein-based oxidative enzymes, such as NADH dehydrogenase and xanthine oxidase

Papel del estrés oxidativo y del coenzima q en la patología asociada a procesos neurodegenerativos y neurooncológicos

El estrés oxidativo subyace a una gran variedad de enfermedades, entre las que destacan las enfermedades neurodegenerativas y el cáncer. En la enfermedad de Alzheimer (EA), el estrés oxidativo aparece en etapas muy iniciales de la enfermedad y está asociado con alteraciones clave como la patología vascular. El p-amiloide (FA), proteína patológica de la EA, es un fuerte inductor de estrés oxidativo y de la patología vascular. El glioblastoma multiforme, es el principal tipo tumora I del sistema nervioso central. Es un tumor muy agresivo, altamente infiltrativo y resistente a terapias. Subyaciendo a estas características aparece el estrés oxidativo y la alteración de la maquinaria antioxidante. La hipótesis de la presente Tesis Doctoral, propone el uso del coenzima Cho, un antioxidante lipofílico, para reducir el incremento de estrés oxidativo (EO) detectado en etapas iniciales de ambas patologías. En la enfermedad de Alzheimer, se observó como en el modelo animal 3xTg-AD existe una alteración en la expresión de enzimas antioxidantes en etapas muy iniciales de la enfermedad, tanto en hipocampo como en corteza cerebral, lo que sugiere un sistema de defensa frente al daño oxidativo temprano que con el avance de la enfermedad se vuelve ineficaz. Este daño oxidativo, actúa también sobre el endotelio cerebral, produciendo la patología vascular que acompaña a la EA. Por ello, se estudió el uso de CoQio para reducir el daño oxidativo inducido por el p-amiloide en células endoteliales de vasculatura humana, in vitro. Se observó como el pre-trata miento con CoQio, protege frente al daño inducido por el pA, disminuyendo su capacidad de incorporarse a mitocondrias, a través de una modulación de los niveles de ROS y de la homeostasis de Ca='. El siguiente paso fue estudiar el efecto del CoQio sobre la vasculatura y el daño inducido por el pA en el modelo 3xTg-AD. Se observó como el tratamiento con CoQio desde los primeros meses, redujo marcadores de estrés oxidativo en plasma, se vio un menor engrosamiento de la lámina basa I en vasculatura cerebral, un descenso en el depósito de placas de pA y de hipoxia, y un descenso en los niveles de BACE-i, enzima clave en la producción de [3A. En el glioblastoma multiforme (GBM), el CoQio moduló la resistencia a terapias y redujo el crecimiento, y la capacidad invasiva y migratoria de las células in vivo e in vitro. En primer lugar, el pre-tratamiento de células de GBM humano con CoQio reguló la cantidad de anión superóxido mitocondrial, reduciéndose lo enzimas antioxidantes como la catalasa y superóxido dismutasa 2 o d como el lactato. Este descenso de las enzimas antioxidantes poten• citotóxico inducido por la radiación ionizante. También se estudi quimiosensibilizador del CoQio junto a temozolomida in vitro e in vivo. Se vio que el tratamiento combinado de ambos incrementó la apoptosis y también procesos de senescencia y de autofagia. En el modelo de xenoimplamente los tumores de ratones tratados con CoQio y TMZ apenas mostraron un incremento en el tamaño. Además, se produjo un incremento en la muerte celular en el co-tratamiento con radioterapia y el citotóxico temozolomida. El CoQio redujo la respuesta hipóxica disminuyendo el nivel de HIF-acc, un factor de transcripción que afecta a procesos clave para el crecimiento del GBM. También se redujeron los niveles de metabolitos esenciales como aminoácidos o ATP y de la fosforilación de las quinasas Akt, AMPK y Erk. El tratamiento redujo la motilidad celular e invasión in vitro disminuyendo la secreción de factores pro-angiogénicos y pro-inflamatorios. Se desarrolló un modelo de xenoimplante y uno ortotópico en ratones inmunodeficientes, el tratamiento con CoQio redujo el crecimiento tumoral y se produjo una disminución en la migración e infiltración de estas células tumorales, y descenso de la inflamación y reclutamiento de nuevos vasos. En definitiva, el CoQio podría ser una molécula clave en la modulación de la homeostasis que subyace en diferentes enfermedades. En la presenta Tesis Doctoral, hemos demostrado como su uso tanto in vitro como in vivo reduce procesos clave en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer y del glioblastoma multiforme

Assessment of genotoxicity induced by subchronic exposure to graphene in HaCaT human skin cell line

The applications of graphene-based materials (GBMs) and their processing involve prolonged contact with cellular barriers such as human skin. Even though the potential cytotoxicity of graphene has been studied in recent years, the impact of long-term graphene exposure has rarely been explored. We tested in the HaCaT epithelial cells, in vitro, the effect of subchronic treatments with sublethal doses of four different, well-characterized GBMs, two commercial graphene oxides (GO) and two few-layer graphenes (FLG). Cells were exposed weekly to low doses of the GBMs for 14 days, 30 days, 3 months, and 6 months. GBMs-cells uptake was assessed by confocal microscopy. Cell death and cell cycle were determined by fluorescence microscopy and cytometry. DNA damage was measured by comet assay and γ-H2AX staining, followed by the determination of p-p53 and p-ATR by immunolabeling. Subchronic exposure to different GBMs at noncytotoxic doses has potential genotoxic effects on HaCaT epithelial cells that can be recovered depending on the GBM and exposure time. Specifically, GO-induced genotoxicity can be detected after 14 and 30 days from treatment. At this time, FLG appears less genotoxic than GO, and cells can recover more quickly when genotoxic pressure disappears after some days of removal of the GBM. Long-term exposure, 3 and 6 months, to different GBMs induces permanent, nonreversible, genotoxic damage comparable to the exerted by arsenite. This should be considered for the production and future applications of GBMs in scenarios where low concentrations of the material interact chronically with epithelial barriers.</p