Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence

RNA silencing is a homology-dependent gene inactivation mechanism that regulates a wide range of biological processes including antiviral defense. To deal with host antiviral responses viruses evolved mechanisms to avoid or counteract this, most notably through expression of viral suppressors of RNA silencing. Besides working as silencing suppressors, these proteins may also fulfill other functions during infection. In many cases the interplay between the suppressor function and other “unrelated” functions remains elusive. We will present host factors implicated in antiviral pathways and summarize the current status of knowledge about the diverse viral suppressors’ strategies acting at various steps of antiviral silencing in plants. Besides, we will consider the multi-functionality of these versatile proteins and related biochemical processes in which they may be involved in fine-tuning the plant-virus interaction. Finally, we will present the current applications and discuss perspectives of the use of these proteins in molecular biology and biotechnology

Poszt-transzkripcionális géncsendesítés és szupresszió molekuláris mechanizmusának feltárása növényekben = Unraveling the mechanism of Post-transcriptional gene silencing and suppression in plants

Az RNS silencing, egy géninaktivációs mechanizmus, amely szinte az összes eukarióta szervezetben működik, és magába foglalja az állati RNS interferencia és a növényi poszt-ranszkripcionális géncsendesítés (PTGS) jelenségét. A növényekben a PTGS mint antivirális mechanizmus is működik. Kutatásaink folyamán feltártuk, hogy a vírus RNS erős másodlagos szerkezettel bíró részei aktiválják a PTGS alapú antivirális mechanizmust oly módon, hogy a DICER nevezetű RNAse III típusú enzim kis 21-26 nukleotid hosszú RNS molekulákká, ún. siRNS-ekké darabolják a másodlagos szerkezettel bíró vírus RNS szakaszokat. A vírus fertőzte növényekben felhalmozódó siRNS-ek beépülnek a PTGS másik effector komplexebe a RISC-be amely vírus specfikus siRNS-ek miatt specifikusan gátolja a vírus RNS kifejeződését. Igazoltuk, hogy ez a gátlás a vírus genom specifikus vágásával megy végbe. A vírusok az evolúció során silencing szupresszor fehérjék termelésével válaszoltak a növények antivirális reakciójára. Laboratóriumunkban a világon először sikerült feltárnunk egy ilyen silencing szupresszor fehérje (Cymbidium ringspot vírus kódolta p19 fehérje) kristályszerkezetét és molekuláris működését. Megállapítottuk, hogy a p19 szupresszor fehérje a siRNS-ek megkötésével gátolja az antivirális RISC felépülését, így a PTGS alapú antivirális választ. Igazoltuk továbbá, hogy ez a molekuláris mechanizmus altalánosan elterjedt a növényi vírus kódolta silencing szupresszor fehérjék működésében. | RNA silencing is conserved in a broad range of eukaryotes and includes the phenomena of RNA interference in animals and posttranscriptional gene silencing (PTGS) in plants. In higher plants, PTGS acts as an antiviral system, and we have explored that antiviral PTGS is induced by viral dsRNAs or structured single-stranded RNAs (ssRNAs) that are processed into small interfering RNAs (siRNAs) by RNase III-like enzymes such as DICER. These virus specific siRNAs than guide the sequences pecific degradation of target viral RNAs by the RNA-induced silencing complex (RISC). We also showed that antiviral RISC, which programmed by the virus specific siRNAs mediates the cleavage of a target viral RNA when there is perfect or nearly perfect base pairing between the target. To counteract an antiviral RNA silencing response, plant viruses evolved and express silencing suppressor proteins. At the first time we explored the structure and molecular bases of a silencing suppressor protein. We have shown that the 19 kDa protein (p19) of Cymbidium ringspot virus is a systemic silencing suppressor that prevents the assembly of antiviral RISC complexis by binding and sequestering of siRNAs, thus inhibiting the PTGS based antiviral response. Moreover we also confirmed that sequestering of siRNA is a common strategy of silencing suppressor proteins, encoded by plant viruses

Növényvírusok replikációjában, a tünet kialakulásában és a növény védekezési rendszerében szerepet játszó gazdagének azonosítása és vizsgálata = Identification and analyses of altered patterns of gene expression in compatible host elicited by plant virus infection

Az poszt-transzkripcionális gén csendesítés (PTGS) egy hatékony antivirális védekezési rendszer növényekben. Adataink azt mutatták, hogy amíg a vad típusú vírus (CymRSV) az egész növényt megfertőzi addig a p19 (a vírus PTGS szuppresszor fehérjéje) deficiens vírus felhalmozódása csak az erekre és azok környékére korlátozódik. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a p19 képes megakadályozni a PTGS mobil szignál által kiváltott aktiválódását a fertőzési front előtt, előidézve a növény általános fertőzöttségét. Továbbiakban, azonosítottuk a PTGS alapvető szerepét a DI RNS mediálta tünet csökkentésben. Adataink megmutatták a PTGS asszociált 21nt siRNS-sek szerepét a szisztemikus szignalizációs eseményekben. Azonosítottuk a DI RNS-ek 5' végi szakaszát mint a tünet módosításban szerepet játszó legfontosabb régiót. Létrehoztunk egy Arabidopsis protoplaszton alapuló szinkronizált infekciós rendszert és azonosítottunk egy endogén gént, amely teljes "shut off"-t mutat vírus fertőzött növényben. Módisított LNA oligonukleotidok felhasználásával létrehoztunk egy olyan érzékeny kis RNS detektálási rendszert, amely lehetővé teszi a vírus ertőzésben szerepet játszó miRNS-ek kimutatását mind northern blot analízissel mind in situ hibridizációval. | In plants post-transcriptional gene silencing (PTGS) is an ancient and effective defense mechanism against virus infection. We showed that in contrast to the uniform accumulation of CymRSV throughout systemically infected leaves, the presence of p19 (PTGS suppressor of the virus) deficient virus was confined to and around the vascular bundles. These results suggest that the role of p19 is to prevent the onset of mobile signal induced systemic PTGS ahead the virus infection front leading to generalized infection. We also showed that the activation of PTGS plays a pivotal role in DI RNA-mediated interference. Our data identified the pivotal role of 21 nt siRNAs in PTGS signaling. In addition we identified a 5' proximal sequence element of DI RNAs as the most important symptom determinant region. We established a Arabidopsis protoplast based synchronized infection system and identified an endogenous gene showing complete shut off in virus infected plants. Moreover, we enhanced the sensitivity of detecting mature microRNAs by LNA modified oligonucleotides probes, which may open the way of northern blot and in situ detection of miRNAs playing important in symptom development

Az RNS silencing mechanizmusának vizsgálata állati és növényi modelleken = Mechanism of RNS silencing in animal and plant model organism

A Cymbidium ringspot vírussal fertőzött növényekből származó kis RNS-ek analízise során azt találtuk, hogy a virális kis RNS-ek a genom kitüntetett helyeiről keletkeznek és a a virális kis RNS-ek 80%-a a pozitív, 20%-a a negatív szálról képződik. Ez az arány megegyezik a genomi RNS-ek szálarányával. Eredményeinkből az következik, hogy a virális kis RNS-ek nem a virus ds replikatív intermedierjéről, hanem az egyszálú genomi RNS-ek másodlagos szerkezettel rendelkező régióiról keletkeznek. Az RNS silencing szupresszorokkal végzett munkánk alapján megállapítottuk, hogy a vizsgált virális szupresszorok mind a növényi, mind az állati rendszerekben a kis RNS-ek megkötésével gátolják a RISC komplexek, ezáltal a si- és miRNS indukálta RNS silencing kialakulását. Mivel az általunk vizsgált vírusok taxonómiailag különböző családokba sorolhatók, ezért azt a következtetés is levonhatjuk, hogy a siRNS kötésen alapuló RNS silencing gátlás egy széleskörűen elterjedt RNS silencing szupressziós stratégia. Jól jellemzett kis RNS kötő RNS silencing szupresszorral rendelkező vírusok hatását vizsgáltuk a a kis RNS-ek 3 vessző vég metilációjára. Eredményeink azt mutatják, hogy a TEV HCPro hatékonyan, míg a CIRV p19 kevéssé gátolja meg a virális siRNS-ek és bizonyos endogén miRNS-ek 3 vessző végének metilációját. Sejtfrakcionálásos eredményeink alapján feltételezhetjük, hogy a kis RNS-ek metilációja nemcsak a sejtmagban, hanem a citoplazmában is bekövetkezhet. | A survey of virus-specific siRNAs characterized by a sequence analysis of siRNAs from plants infected with Cymbidium ringspot virus showed that viral siRNA sequences have a nonrandom distribution along the length of the viral genome, suggesting that viral siRNAs derived from highly structured regions of the single stranded viral genome, rather than the ds replicative intermedier. Analyzing several silencing suppressors representing different families of viruses showed that each inhibit the intermediate step of RNA silencing via binding to siRNAs, although the molecular features required for duplex siRNA binding differ among these proteins. None of the suppressors affected the activity of preassembled RISC complexes. In contrast, each suppressor uniformly inhibited the siRNA-initiated RISC assembly pathway by preventing RNA silencing initiator complex formation. We investigated the 3' modification of silencing-related small RNAs in plants infected with viruses expressing small RNA silencing suppressors. We found that CIRV had only a slight effect on viral siRNA 3' modification, but TEV significantly inhibited the 3' modification of si/miRNAs. This suggests that the 3' modification of viral siRNAs occurs in the cytoplasm, though miRNA 3' modification likely takes place in the nucleus as well

Az RNS silencing szerepe, mechanizmusa a vírus gazda kölcsönhatásban = The role and the mechanism of RNA silencing in the plant virus interplay

Az RNS silencing, egy géninaktivációs mechanizmus, amely szinte az összes eukarióta szervezetben működik. Kutatásaink során feltártuk a Cymbidium ringspot vírus genomról kéződő small interferáló (si) RNS eredetét nagy hatékonyságú 454 (Life Science) és Soplexa (illumina) szekvenaló rendszerek alkalmazásával. A vírus genomról származó kis RNS-eket rátérképeztük a vírus genomjára, amely alapján "forró pontokat" tudtunk azonosítani. Igazoltuk,hogy virus siRNS-ek túlnyomó töbsége a virus pozitív száláról származik, és 21-22 nukleotid (nt) hosszú. Megállapítottuk, hogy vírus siRNS-ekkel töltött RISC (RNA Induced Silencing Complex) komplexek szekvenciaspecifikusan hasítják a vírus genomot. Számos silencing szupresszor fehérje (p19, HC-Pro, és p122) részletes analízisével igazoltuk, hogy a növény antivirális válaszát, a vírus kódolta silencing szupresszorok hatékonyan gátolják. Bizonyítottuk, hogy a siRNS-ek specifikus kötése és inaktiválása a legelterjedtebb stratégia a silencing szupresszor fehérjék között. Feltártuk, hogy a silencing szuppresszor fehérjék egy jelentős csoportja gátolja növények endogén siRNS és miRNS biogenezisét. A silencing szupressor feherjék interakciója az endogen silencing útvonalakkal feltehetően a magyarázata a vírus okozta tünetek kialakulásának, hiszen a szupresszor fehérjék súlyosan zavarja növény egyedfejlődését. | RNA silencing is a gene inactivation mechanism, which is conserved in a broad range of eukaryotes. The central players in RNA-mediated gene silencing are the small 21-24 nucleotide long RNA molecules engaged in sequence-specific interactions to inhibit gene expression. RNA silencing fulfils fundamental regulatory roles, as well as antiviral functions. We profiled viral siRNAs using two different high-throughput sequencing platforms. Both deep sequencing techniques revealed a strong bias in viral siRNAs for the positive strand of the virus and identified regions on the viral genome that produced viral siRNA in much higher abundance than other regions. We also analysed the viral RNA targeting by virus induced gene silencing in tombusvirus infected plants, and we show evidence that antiviral response is based on viral RNA cleavage by RNA-induced silencing effector complex (RISC) programmed by virus-specific siRNAs.. To counteract RNA silencing, viruses express silencing suppressors that interfere with both siRNA- and microRNA-guided silencing pathways. We used comparative approaches to analyse the molecular mechanism of suppression by three well-studied silencing suppressors. We found that silencing suppressors p19, p21 and HC-Pro each inhibit the RISC assembly. We demonstrated that these suppressors are able to interact with the endogenous silencing pathways suggesting that these interactions have an important role in the development of virus-induced symptoms

The nonstop decay and the RNA silencing systems operate cooperatively in plants

Translation-dependent mRNA quality control systems protect the protein homeostasis of eukaryotic cells by eliminating aberrant transcripts and stimulating the decay of their protein products. Although these systems are intensively studied in animals, little is known about the translation-dependent quality control systems in plants. Here, we characterize the mechanism of nonstop decay (NSD) system in Nicotiana benthamiana model plant. We show that plant NSD efficiently degrades nonstop mRNAs, which can be generated by premature polyadenylation, and stop codon-less transcripts, which are produced by endonucleolytic cleavage. We demonstrate that in plants, like in animals, Pelota, Hbs1 and SKI2 proteins are required for NSD, supporting that NSD is an ancient and conserved eukaryotic quality control system. Relevantly, we found that NSD and RNA silencing systems cooperate in plants. Plant silencing predominantly represses target mRNAs through endonucleolytic cleavage in the coding region. Here we show that NSD is required for the elimination of 5' cleavage product of mi- or siRNA-guided silencing complex when the cleavage occurs in the coding region. We also show that NSD and nonsense-mediated decay (NMD) quality control systems operate independently in plants

Distinct Effects of p19 RNA Silencing Suppressor on Small RNA Mediated Pathways in Plants

RNA silencing is one of the main defense mechanisms employed by plants to fight viruses. In change, viruses have evolved silencing suppressor proteins to neutralize antiviral silencing. Since the endogenous and antiviral functions of RNA silencing pathway rely on common components, it was suggested that viral suppressors interfere with endogenous silencing pathway contributing to viral symptom development. In this work, we aimed to understand the effects of the tombusviral p19 suppressor on endogenous and antiviral silencing during genuine virus infection. We showed that ectopically expressed p19 sequesters endogenous small RNAs (sRNAs) in the absence, but not in the presence of virus infection. Our presented data question the generalized model in which the sequestration of endogenous sRNAs by the viral suppressor contributes to the viral symptom development. We further showed that p19 preferentially binds the perfectly paired ds-viral small interfering RNAs (vsiRNAs) but does not select based on their sequence or the type of the 5’ nucleotide. Finally, co-immunoprecipitation of sRNAs with AGO1 or AGO2 from virus-infected plants revealed that p19 specifically impairs vsiRNA loading into AGO1 but not AGO2. Our findings, coupled with the fact that p19-expressing wild type Cymbidium ringspot virus (CymRSV) overcomes the Nicotiana benthamiana silencing based defense killing the host, suggest that AGO1 is the main effector of antiviral silencing in this host-virus combination