Avaliação da atividade anti-herpética de cardenolídeos e derivados

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2011Os cardenolídeos pertencem a um grupo de compostos naturais, que inibem a bomba de Na+/K+ (NKATPase). Tradicionalmente, eles têm sido utilizados para o tratamento da insuficiência cardíaca congestiva e de arritmias atriais, tais como a digoxina, a digitoxina e a ouabaína. Trabalhos recentes descreveram a potencial atividade anti-herpética de alguns cardenolídeos. Os Herpes Simplex Virus tipos 1 e 2 (HSV-1 e HSV-2) são responsáveis por infecções nas regiões oral, ocular e genital e, além disso, estes vírus podem estabelecer infecções persistentes (latência) no sistema nervoso. O tratamento é realizado com análogos de nucleosídeos, como o aciclovir, efetivo na maioria dos casos; entretanto, a resistência a esses fármacos tem aumentado devido ao seu uso prolongado, principalmente em pacientes imunocomprometidos. Inicialmente, a citotoxicidade (CC50) e a atividade anti-HSV foram avaliadas através do ensaio colorimétrico do MTT e do ensaio de inibição da formação das placas de lise (CI50), respectivamente. De acordo com os resultados obtidos através da triagem anti-HSV de 65 cardenolídeos e derivados, dois compostos (4 e 12) foram selecionados devido aos seus promissores índices de seletividade (IS=CC50/CI50) de 2.107 e 645 (HSV-1 cepa KOS); 4.566 e 792 (HSV-1 cepa 29-R) e 6.250 e 1.238 (HSV-2 cepa 333). O mecanismo de ação foi avaliado através de uma sequência de ensaios, que visaram avaliar a possível interferência destes compostos nas diversas etapas do ciclo de replicação viral. Na avaliação do efeito do tempo de adição e remoção, estes compostos inibiram significativamente a replicação viral, quando adicionados até 12 h pós-infecção, ou removidos após este período de tempo. Esses compostos não apresentaram atividade virucida, nem inibiram a entrada viral dos vírus nas células (adsorção e penetração). Entretanto, eles mantiveram sua atividade anti-HSV, mesmo no maior MOI testado (0,4), que foi 1000X maior que o MOI (0,0004) utilizado para a triagem antiviral. As amostras também inibiram a dispersão viral intercelular e interferiram na liberação viral, apresentando perfis concentração-dependentes. Os níveis de RNAm dos genes herpéticos não foram alterados pelo tratamento com os cardenolídeos nas condições experimentais testadas. Entretanto, a análise da expressão proteica viral mostrou que os compostos inibiram a expressão das proteínas ? (ICP27), ? (UL42) e ? (gB and gD), em diferentes intensidades. A avaliação da atividade anti-ATPásica demonstrou que esses cardenolídeos reduziram esta atividade enzimática, sugerindo que uma alteração do gradiente eletroquímico celular pode estar envolvida no mecanismo de inibição da replicação viral

Cytotoxic factor secreted by Escherichia coli associated with sepsis facilitates transcytosis through human umbilical vein endothelial cell monolayers

Culture supernatant of sepsis-associated Escherichia coli (SEPEC) isolated from patients with sepsis caused loss of intercellular junctions and elongation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). The cytotoxic factor was purified from culture supernatant of SEPEC 15 (serogroup O153) by liquid chromatography process. PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) showed that the purified SEPEC cytotoxic factor had a molecular mass of ∼150 kDa and consisted of at least two subunits. At the concentration of 1 CD50 (40 μg/mL) did facilitate transcytosis through the HUVEC cells monolayer of SEPEC 15 as much as E. coli K12 within 30 min without affecting cell viability. These results suggest that this cytotoxic factor, named as SPF (SEPEC's permeabilizing factor), may be an important SEPEC virulence factor that facilitates bacterial access to the bloodstream.203298302COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPESSem informaçã

Cytotoxic factor secreted by Escherichia coli associated with sepsis facilitates transcytosis through human umbilical vein endothelial cell monolayers

Culture supernatant of sepsis-associated Escherichia coli (SEPEC) isolated from patients with sepsis caused loss of intercellular junctions and elongation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). The cytotoxic factor was purified from culture supernatant of SEPEC 15 (serogroup O153) by liquid chromatography process. PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) showed that the purified SEPEC cytotoxic factor had a molecular mass of ∼150 kDa and consisted of at least two subunits. At the concentration of 1 CD50 (40 μg/mL) did facilitate transcytosis through the HUVEC cells monolayer of SEPEC 15 as much as E. coli K12 within 30 min without affecting cell viability. These results suggest that this cytotoxic factor, named as SPF (SEPEC's permeabilizing factor), may be an important SEPEC virulence factor that facilitates bacterial access to the bloodstream. Keywords: Cytotoxin (SPF), Sepsis, Transcytosis, Transendothelial electrical resistanc

Molecular Characterisation Of The Nsp4 Gene Of Group A Human Rotavirus G2p[4] Strains Circulating In São Paulo, Brazil, From 1994 And 2006 To 2010.

Group A human rotaviruses (HuRVA) are causative agents of acute gastroenteritis. Six viral structural proteins (VPs) and six nonstructural proteins (NSPs) are produced in RV-infected cells. NSP4 is a diarrhoea-inducing viral enterotoxin and NSP4 gene analysis revealed at least 15 (E1-E15) genotypes. This study analysed the NSP4 genetic diversity of HuRVA G2P[4] strains collected in the state of São Paulo (SP) from 1994 and 2006-2010 using reverse transcription-polymerase chain reaction, sequencing and phylogenetic analysis. Forty (97.6%) G2P[4] strains displayed genotype E2; one strain (2.4%) displayed genotype E1. These results are consistent with the proposed linkage between VP4/VP7 (G2P[4]) and the NSP4 (E2) genotype of HuRVA. NSP4 phylogenetic analysis showed distinct clusters, with grouping of most strains by their genotype and collection year, and most strains from SP were clustered together with strains from other Brazilian states. A deduced amino acid sequence alignment for E2 showed many variations in the C-terminal region, including the VP4-binding domain. Considering the ability of NSP4 to generate host immunity, monitoring NSP4 variations, along with those in the VP4 or VP7 protein, is important for evaluating the circulation and pathogenesis of RV. Finally, the presence of one G2P[4]E1 strain reinforces the idea that new genotype combinations emerge through reassortment and independent segregation.110786-79