Étude métabolomique pour la découverte de nouveaux biomarqueurs pour la maladie de Gaucher de type 1 et méthode de dépistage urinaire populationnel de glycosaminoglycans

Première partie : La maladie de Gaucher est une maladie de surcharge lysosomale engendrée par une variation pathogénique au niveau du gène GBA, ce qui entraîne alors une dysfonction de l’enzyme glucocérébrosidase. Cette enzyme joue un rôle important au niveau du catabolisme du glucosylcéramide (Gb1). Ainsi, un défaut au niveau du fonctionnement de cette enzyme résulte généralement en une accumulation de glycolipides au niveau des lysosomes ce qui mène, dans certains cas, à d’importantes manifestations cliniques multisystémiques telles que des organomégalies, des cytopénies, différents types d’atteintes osseuses et, dans les cas les plus sévères de la maladie, soit les types 3 (forme intermédiaire) et type 2 (forme sévère), des atteintes neurologiques. Étant une maladie métabolique très hétérogène au niveau de la sévérité des atteintes, le génotype est souvent utilisé pour des fins de pronostic. Toutefois, il est fréquent que pour un même génotype, le phénotype puisse être très différent. Au niveau des biomarqueurs, le CCL18 ainsi que la chitotriosidase ont des limitations majeures en raison de polymorphisme populationnel, alors que le glucosylcéramide (Gb1) et le glucosylsphingosine (lyso-Gb1), bien qu’utiles pour le pronostic et le suivi des patients, offrent uniquement une image globale de la sévérité de la maladie, sans toutefois fournir d'informations sur les atteintes spécifiques et leur progression. L’hypothèse de départ est qu’il existe des biomarqueurs présents dans les liquides biologiques des patients atteints de la maladie de Gaucher de type 1 qui pourraient mieux corréler avec la sévérité et la progression de la maladie. Ainsi, dans le cadre de la présente étude, l’objectif principal consistait à réaliser une étude métabolomique par spectrométrie de masse à haute résolution dans le plasma et l’urine de patients Gaucher de type 1 afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs. Ces études ont permis de détecter 21 biomarqueurs potentiels soit 7 dans le plasma et 14 dans l’urine. Des méthodes de quantification fiables et robustes par spectrométrie de masse en tandem ont été développées, puis validées afin d’étudier la distribution des biomarqueurs chez les patients. De plus, ces études quantitatives ont révélé des corrélations significatives entre certains biomarqueurs potentiels présents dans le plasma et des atteintes viscérales et hématologiques. Pour ce qui est des biomarqueurs potentiels retrouvés dans l’urine, des résultats préliminaires semblent indiquer une corrélation entre la présence des différents marqueurs et la sévérité de la maladie. Toutefois, une cohorte de patients plus diversifiée et plus large sera requise afin de bien comprendre les liens entre ces métabolites urinaires et les manifestations cliniques observées chez les patients Gaucher de type 1. Deuxième partie : Les mucopolysaccharidoses sont une classe de maladies lysosomales causées par un défaut des enzymes impliquées dans la dégradation des glycosaminoglycans. Ces perturbations dans le processus catalytique de ces macromolécules sont à l’origine d’une accumulation de substrats au niveau des lysosomes. Celles-ci alors entraîneront d’importantes atteintes multisystémiques, qui, dans certains cas, sont irréversibles. Des traitements comme la thérapie enzymatique de remplacement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques sont disponibles pour les patients atteints de MPS. Bien que ces traitements soient efficaces pour altérer la progression naturelle de la maladie, ils ne parviennent pas à guérir le patient. De nombreuses études ont démontré les bienfaits d’une prise en charge rapide et d’un traitement précoce. Malheureusement, au Québec, les MPS ne sont pas dépistées de manière systématique chez les nouveau-nés. Toutefois, avec le transfert technologique potentiel de l’analyse des biomarqueurs par chromatographie sur couche mince vers la spectrométrie de masse du Programme québécois de dépistage néonatal urinaire, il y a lieu de s’intérroger sur la possibilité d’inclure le dépistage des MPS pour les nouveau-nés à 21 jours de vie. Cela permettrait donc d’identifier les cas rapidement et d’adapter la prise en charge du patient. Ainsi, ce projet de recherche évaluative consistait à développer et à valider une méthode d’analyse des glycosaminoglycans dans le cadre d’un dépistage populationnel chez les nouveau-nés par la spectrométrie de masse en tandem. Une méthode d’une durée d’une minute permettant la quantification absolue de l’héparan sulfate, du dermatan sulfate et de la créatinine a été développée puis validée. Cette méthode, compatible avec la collecte d’échantillons d’urine sur papier filtre utilisée actuellement au Programme québécois de dépistage néonatal urinaire permet de dépister 5 différents types de MPS, soit la MPS I, II, III, VI et VII. L’analyse de 500 échantillons d’urine de nouveau-nés a permis de fixer les valeurs moyennes à 34,6 +/-6,2 et 17,3 +/-3,9 mg/mmol de créatinine pour l’héparan sulfate et le dermatan sulfate, respectivement. De plus l’analyse d’échantillons de patients atteints de MPS de différents âges a démontré que la méthode pourrait également être utilisée dans le cadre d’un dépistage à haut-risque

Évaluation de la distribution de glycosaminoglycans par spectrométrie de masse en tandem dans les tissus de souris atteintes de mucopolysaccharidose de type II

Les mucopolysaccharidoses (MPSs) sont des maladies lysosomales causées par des mutations au niveau des gènes codant pour des enzymes impliquées au niveau du catabolisme des glycosaminoglycans (GAGs). Plus précisément, la MPS II est un syndrome multisystémique causée par une mutation du gène IDS, localisé sur le chromosome X, qui entraîne une déficience au niveau de l’enzyme iduronate-2-sulfatase. Ce défaut enzymatique perturbe le catabolisme de l’héparan sulfate (HS) et du dermatan sulfate (DS) entraînant leur accumulation dans différents tissus et liquides biologiques. Il existe deux formes de la MPS II, soit une forme non-neuronopathique (atténuée) et une forme neuronopathique (sévère), cette dernière entraînant une atteinte neurologique. Les autres manifestations progressives incluent généralement des complications au niveau de différents systèmes, tels le système respiratoire, cardiaque, squelettique et au niveau des tissus conjonctifs. La thérapie enzymatique de remplacement (TER) est l’un des traitements actuellement disponibles qui altère la progression de la maladie sans pour autant guérir le patient. Dans le cadre de la présente étude, l’objectif principal était d’étudier la distribution des biomarqueurs de la MPS II chez un modèle animal, soit la souris. Pour ce faire, les tissus de souris furent homogénéisés à l’aide d’un homogénéisateur à billes de céramique puis évaporés sous jet d’azote. Une réaction de méthanolyse utilisant le MeOH/HCl 3N a permis de générer des disaccharides à partir de GAGs. Finalement, les échantillons furent resuspendus dans une solution organique pour l’analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem. Cette méthodologie a été validée et elle a permis d’évaluer la distribution de l’HS et du DS au niveau du foie, du cerveau, du cœur, des reins, du petit intestin, de la rate, des poumons ainsi que de l’urine et du plasma chez des souris MPS II traitées par TER, non traitées, ainsi que des souris contrôles saines. Nos résultats montrent une grande variabilité au niveau de la distribution de HS et du DS dans les tissus et les liquides biologiques. La concentration la plus élevée de HS a été mesurée au niveau du foie, suivis des reins, de la rate, des poumons, du petit intestin du coeur, et du cerveau alors que pour le DS, la concentration la plus importante a été observée au niveau des poumons, suivis du foie, de la rate, du cœur, des reins, du petit intestin et du cerveau. La TER s’est avérée efficace pour réduire la concentration des deux biomarqueurs dans tous les tissus, sauf au niveau du cerveau. En conclusion, la méthode développée dans le cadre de cette étude est robuste et pourrait être un outil de choix pour l’analyse des tissus de différents organes de souris afin d’évaluer l’efficacité de traitements futurs

Neonatal Mass Urine Screening Approach for Early Detection of Mucopolysaccharidoses by UPLC-MS/MS

Mucopolysaccharidoses (MPSs) are lysosomal storage disorders caused by deficiencies of enzymes involved in the catabolism of glycosaminoglycans (GAGs). Various treatments such as enzyme replacement therapy and/or hematopoietic stem cell transplant are available for MPSs. Early initiation of treatment improves the outcome and delays the onset of symptoms, highlighting the need for newborn screening for MPSs. The main objective of this project was to devise and validate a multiplex urine filter paper method for GAG analysis using a tandem mass spectrometry (MS/MS) approach to screen newborns for MPSs. Eluted urine samples from 21-day-old newborns were evaporated and a methanolysis reaction was performed. Samples were resuspended and analyzed using a UPLC-MS/MS system. A one-minute chromatographic method allowed the absolute quantification of heparan sulfate (HS), dermatan sulfate (DS), and creatinine. Method validation revealed high precision (< 9% relative standard deviation) and accuracy (< 7% bias) for all analytes. The reference values normalized to creatinine obtained by the analysis of five hundred 21-day-old newborn urine samples were 34.6 +/-6.2 mg/mmol of creatinine and 17.3 +/-3.9 mg/mmol of creatinine for HS and DS, respectively. We present a rapid and efficient method for populational newborn urine screening using MS/MS, which could also be applied to high-risk screening

Identification of a Reliable Biomarker Profile for the Diagnosis of Gaucher Disease Type 1 Patients Using a Mass Spectrometry-Based Metabolomic Approach

Gaucher disease (GD) is a rare autosomal recessive multisystemic lysosomal storage disorder presenting a marked phenotypic and genotypic variability. GD is caused by a deficiency in the glucocerebrosidase enzyme. The diagnosis of GD remains challenging because of the large clinical spectrum associated with the disease. Moreover, GD biomarkers are often not sensitive enough and can be subject to polymorphic variations. The main objective of this study was to perform a metabolomic study using an ultra-performance liquid chromatography system coupled to a time-of-flight mass spectrometer to identify novel GD biomarkers. Following the analysis of plasma samples from patients with GD, and age- and gender-matched control samples, supervised statistical analyses were used to find the best molecules to differentiate the two groups. Targeted biomarkers were structurally elucidated using accurate mass measurements and tandem mass spectrometry. This metabolomic study was successful in highlighting seven biomarkers associated with GD. Fragmentation tests revealed that these latter biomarkers were lyso-Gb1 (glucosylsphingosine) and four related analogs (with the following modifications on the sphingosine moiety: -C2H4, -H2, -H2+O, and +H2O), sphingosylphosphorylcholine, and N-palmitoyl-O-phosphocholineserine. Based on the plasma biomarker distribution, we suggest the evaluation of this GD biomarker profile, which might facilitate early diagnosis, monitoring, and follow-up of patients

Critical sample collection delayed? Urine organic acid analysis can still save the day! A new case of HMG-CoA synthase deficiency

Mitochondrial 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) synthase (mHS) deficiency is an autosomal recessive disorder of ketone body synthesis caused by biallelic pathogenic variants in HMGCS2. Clinical symptoms are precipitated by prolonged fasting and/or intercurrent illness with onset before the first year of life. Clinically, patients may present with hypo−/ non-ketotic hypoglycemia, metabolic acidosis, hyperammonemia, lethargy, hepatomegaly, and encephalopathy. During periods of decompensation, elevations of 4-hydroxy-6-methyl-2-pyrone (4-HMP), several hydroxylated hexanoic and hexenoic acid species, and medium-chain dicarboxylic acids in the absence of significant ketonuria may be observed in the urine organic acid profile. Abnormalities may also be observed in plasma which includes elevated acetylcarnitine (C2) and 3-hydroxybutyryl/3-hydroxyisobutyryl (C4-OH) carnitine.We report a patient who presented to the ED at 13 months of age with an undetectable point-of-care blood glucose level. Continuous infusion of dextrose-containing intravenous (IV) fluids were required to correct the hypoglycemia and routine chemistries were notable for an anion gap metabolic acidosis, transaminasemia, and elevated creatine kinase and lactate dehydrogenase. Urine and blood ketones were undetectable. Qualitative assessment of urine organic acids collected ∼46 and ∼ 99 h post-admission were significant for mild elevations of 4-HMP and hydroxy-hexanoic and hydroxy-hexenoic acid species with a notable absence of ketones. Previously, biochemical abnormalities in urine have been shown to normalize in as few as 27 h after treatment giving providers a narrow window with which to obtain a critical sample. Direct communication of laboratory findings to the ordering provider guided the molecular testing and assisted in results interpretation to confirm the molecular diagnosis.Our case emphasizes the importance of collecting samples for biochemical analysis even if the critical period has been missed and acute metabolic decompensation seems to be resolved, as residual abnormalities observed in our patient greatly narrowed the differential diagnosis

Separation and Analysis of Lactosylceramide, Galabiosylceramide, and Globotriaosylceramide by LC-MS/MS in Urine of Fabry Disease Patients

Fabry disease is an X-linked lysosomal storage disorder caused by α-galactosidase A (α-GAL A) deficiency. This enzyme contributes to the cellular recycling of glycosphingolipids such as galabiosylceramide (Ga₂), globotriaosylceramide (Gb₃), and globotriaosylsphingosine (lyso-Gb₃) by hydrolyzing the terminal α-galactosyl moiety. Urine and plasma α-GAL A substrates are currently analyzed as biomarkers for the detection, monitoring, and follow-up of Fabry disease patients. The sensitivity of the analysis of Ga₂ is decreased by the co-analysis of its structural isomer, lactosylceramide (LacCer), which is not an α-GAL A substrate. A normal-phase ultraperformance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) methodology, allowing the baseline separation of 12 Ga₂ isoforms/analogues from their lactosylceramide counterparts, was developed and validated in urine. The method was multiplexed with the analysis of 12 Gb₃ isoforms/analogues having the same fatty acid moieties as those of Ga₂ for comparison, and with creatinine for sample normalization. Urine samples were studied from 34 untreated and 33 Fabry males treated by enzyme replacement therapy (ERT) and 54 untreated and 19 ERT-treated Fabry females, along with 34 male and 25 female healthy controls. The chromatographic separation of Ga₂ from LacCer increased the sensitivity of analysis, especially in women. One untreated Fabry female and two treated Fabry females presented abnormal levels of Ga₂ but normal levels of Gb₃, supporting the importance of analyzing Ga_2, in addition to Gb₃. Our results show that urine LacCer levels from females were significantly higher than those from males. Moreover, LacCer levels were not affected by Fabry disease for both males and females

Separation and Analysis of Lactosylceramide, Galabiosylceramide, and Globotriaosylceramide by LC-MS/MS in Urine of Fabry Disease Patients

Fabry disease is an X-linked lysosomal storage disorder caused by α-galactosidase A (α-GAL A) deficiency. This enzyme contributes to the cellular recycling of glycosphingolipids such as galabiosylceramide (Ga₂), globotriaosylceramide (Gb₃), and globotriaosylsphingosine (lyso-Gb₃) by hydrolyzing the terminal α-galactosyl moiety. Urine and plasma α-GAL A substrates are currently analyzed as biomarkers for the detection, monitoring, and follow-up of Fabry disease patients. The sensitivity of the analysis of Ga₂ is decreased by the co-analysis of its structural isomer, lactosylceramide (LacCer), which is not an α-GAL A substrate. A normal-phase ultraperformance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) methodology, allowing the baseline separation of 12 Ga₂ isoforms/analogues from their lactosylceramide counterparts, was developed and validated in urine. The method was multiplexed with the analysis of 12 Gb₃ isoforms/analogues having the same fatty acid moieties as those of Ga₂ for comparison, and with creatinine for sample normalization. Urine samples were studied from 34 untreated and 33 Fabry males treated by enzyme replacement therapy (ERT) and 54 untreated and 19 ERT-treated Fabry females, along with 34 male and 25 female healthy controls. The chromatographic separation of Ga₂ from LacCer increased the sensitivity of analysis, especially in women. One untreated Fabry female and two treated Fabry females presented abnormal levels of Ga₂ but normal levels of Gb₃, supporting the importance of analyzing Ga_2, in addition to Gb₃. Our results show that urine LacCer levels from females were significantly higher than those from males. Moreover, LacCer levels were not affected by Fabry disease for both males and females

Diurnal Variation of Urinary Fabry Disease Biomarkers during Enzyme Replacement Therapy Cycles

Fabry disease is an X-linked lysosomal storage disorder caused by mutations in the GLA gene encoding the α-galactosidase A enzyme. This enzyme cleaves the last sugar unit of glycosphingolipids, including globotriaosylceramide (Gb3), globotriaosylsphingosine (lyso-Gb3), and galabiosylceramide (Ga2). Enzyme impairment leads to substrate accumulation in different organs, vascular endothelia, and biological fluids. Enzyme replacement therapy (ERT) is a commonly used treatment. Urinary analysis of Gb3 isoforms (different fatty acid moieties), as well as lyso-Gb3 and its analogues, is a reliable way to monitor treatment. These analogues correspond to lyso-Gb3 with chemical modifications on the sphingosine moiety (−C2H4, −C2H4+O, −H2, −H2+O, +O, +H2O2, and +H2O3). The effects of sample collection time on urinary biomarker levels between ERT cycles were not previously documented. The main objective of this project was to analyze the aforementioned biomarkers in urine samples from seven Fabry disease patients (three treated males, three treated females, and one ERT-naïve male) collected twice a day (morning and evening) for 42 days (three ERT cycles). Except for one participant, our results show that the biomarker levels were generally more elevated in the evening. However, there was less variability in samples collected in the morning. No cyclic variations in biomarker levels were observed between ERT infusions