Caracterización de autoantígenos en la diabetes tipo 1. Papel de las galectinas en la etiopatogenia de la enfermedad

La diabetes tipo 1 es una enfermedad autoinmune en la que las células β de los islotes de Langerhans son selectivamente destruidas por linfocitos T autorreactivos específicos para antígenos propios de estas células (autoantígenos), disminuyéndose gravemente la cantidad de insulina secretada, lo que conduce a la patogenia de la enfermedad. Estos linfocitos T autorreactivos pueden haber sido generados por alteraciones en la tolerancia central y/o en la tolerancia periférica. Por todo ello en este trabajo de tesis nos hemos propuesto i) clonar, expresar y purificar autoantígenos importantes en la diabetes tipo 1 para desarrollar sistemas de detección de autoanticuerpos específicos contra ellos; ii) identificar los epitopos derivados del autoantígeno S100β procesados y presentados de manera natural a linfocitos T por moléculas de histocompatibilidad que confieren susceptibilidad a padecer la enfermedad (HLA-DRB1*04:01 y HLA-A*02:01); y iii) estudiar la síntesis de galectinas en sujetos sanos y pacientes con diabetes tipo 1, ya que estas proteínas desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la tolerancia central y periférica. En el presente trabajo se han clonado, expresado y purificado los autoantígenos IGRP (subunidad catalítica de la glucosa-6-fosfatasa específica de los islotes), GFAP (proteína ácida de la glía) y S100β, las dos últimas en cantidades y pureza suficientes como para llevar a cabo los experimentos subsiguientes. Se han desarrollado dos sistemas de ELISA para la detección de autoanticuerpos contra GFAP y S100β: en el caso de GFAP la sensibilidad del ensayo es de 24,6% con una especificidad del 98,9% y un valor predictivo del 94,7%, existiendo diferencias significativas en la frecuencia de individuos positivos en pacientes con diabetes tipo 1 respecto de controles sanos, además de poseer aquéllos títulos de anticuerpo superiores, que correlacionan con el tiempo transcurrido desde el diagnóstico y con el número de complicaciones diabéticas. En lo que respecta a S100β no existen diferencias ni en frecuencia de positividad ni en título de autoanticuerpos entre controles y pacientes. Sin embargo por western blot se ha detectado un tipo de autoanticuerpo presente exclusivamente en los pacientes diabéticos, que sugiere la presencia de una respuesta humoral diferente contra este autoantígeno en comparación con controles sanos. Se han identificado péptidos derivados del autoantígeno S100β procesados y presentados de manera natural (PPPMN) tanto por la molécula de histocompatibilidad HLA-DRB1*04:01 (DR4) como por la molécula HLA-A*02:01 (A2.1). En el caso de DR4 se ha diseñado un sistema de presentación de antígeno en células homocigotas para DR4 a las que se les suministró S100β, se han inmunopurificado las moléculas DR4, y los péptidos unidos a ellas han sido identificados por espectrometría de masas. Los 44 PPPMN identificados se solapan parcialmente, como era de esperar para una molécula de histocompatibilidad de clase II, constituyendo 3 regiones, de las que hemos diseñado 4 péptidos consenso: S100 6-25, S100 21-36, S100 25-46 y S100 68-92. En un ensayo de unión in vitro a DR4 se ha comprobado que S100 68-92 y, en menor medida, S100 6-25 se unen in vitro a DR4, siendo el complejo resultante estable, y se ha delimitado la posible secuencia de unión. A continuación se ha detectado la presencia de linfocitos T autorreactivos específicos para estos epitopos en controles sanos y pacientes diabéticos mediante ensayos de ELISPOT para las citocinas IFN-γ, IL-10 e IL-17. Los pacientes muestran un fenotipo claramente proinflamatorio, con linfocitos T autorreactivos específicos para los péptidos consenso de S100β secretando IFN-γ y, en menor medida, IL-17. Los controles muestran, sin embargo, un fenotipo inmunoregulador, secretando IL-10 en respuesta a estos péptidos, especialmente contra S100 68-92. En el caso de A2.1 se han generado células dobles transfectantes que expresan A2.1 y S100β, de las cuales se han extraído los péptidos presentados por dichas moléculas de histocompatibilidad y se han identificado 5 PPPMN por espectrometría de masas. Mediante un ensayo in vitro se ha comprobado que al menos dos de los 5 PPPMN (S100 10-18 y S100 20-28) pueden haber sido generados por digestión en el proteosoma, un complejo multicatalítico clave en la generación de péptidos para su unión a moléculas de histocompatibilidad de clase I. Finalmente, hemos ensayado la capacidad de unión in vitro de estos PPPMN a la molécula A2.1, resultando que el péptido S100 10-18 se une con baja afinidad a la molécula de histocompatibilidad, característica compartida por otros péptidos derivados de autoantígenos descritos en la literatura. Se han generado además hibridomas a partir de linfocitos T infiltrantes de islotes de Langerhans de ratones NOD (no obesos diabéticos), el modelo animal de la diabetes tipo 1. Hemos comprobado que al menos 2 de los siete hibridomas generados son específicos de S100β, ya que reconocen epitopos derivados de esta proteína presentados por moléculas de histocompatibilidad de clase II. Finalmente, y teniendo en cuenta el gran papel inmunoregulador que desempeñan las galectinas -1 y -3 al mantener la tolerancia central y periférica, en el presente trabajo se ha estudiado la síntesis de estas galectinas, en primer lugar, en diferentes subtipos de linfocitos T colaboradores (Th), y en segundo lugar en distintos tipos celulares de controles sanos y pacientes con diabetes tipo 1. En lo que respecta a los linfocitos Th, es el subtipo Th17 el que mayores niveles de galectina-1 y -3 produce, respecto de los linfocitos Th1 y Th2. En cuanto al estudio en controles sanos y pacientes con diabetes tipo 1, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes secretan menores cantidades de ambas galectinas respecto de controles sanos. La secreción reducida de galectina-1 es debida a células carentes del marcador CD4 (monocitos, linfocitos B y/o linfocitos T CD8+), reducción que supone un mayor resistencia de los linfocitos T autorreactivos a la muerte por apoptosis. Los linfocitos T CD4+ de diabéticos no presentan problemas de secreción de galectina-1, pero poseen niveles significativamente mayores de galectina-1 en superficie, que también conllevan una mayor resistencia a la muerte por apoptosis. Finalmente, los linfocitos T reguladores (Treg) de diabéticos poseen menores niveles de galectina-1 en superficie, probablemente reduciendo su poder supresor. Así pues en este trabajo de tesis se purifican autoantígenos importantes en la diabetes autoinmune, se desarrollan técnicas de ELISA para la detección de autoanticuerpos específicos contra ellos, se identifican PPPMN derivados de S100β y presentados por moléculas de histocompatibilidad que confieren susceptibilidad a padecer la enfermedad, se detectan linfocitos T autorreactivos específicos para péptidos derivados de S100β en pacientes diabéticos, se generan hibridomas de linfocitos T infiltrantes de ratón NOD que reconocen S100β y se describen varios fallos en la síntesis de galectinas por parte de células de pacientes con diabetes tipo 1 respecto de controles sanos

Naturally presented HLA class I–restricted epitopes from the neurotrophic factor S100-β are targets of the autoimmune response in type 1 diabetes

Type 1 diabetes (T1D) results from the destruction of pancreatic β-cells by the immune system, and CD8+ T lymphocytes are critical actors in this autoimmune response. Pancreatic islets are surrounded by a mesh of nervous cells, the peri-insular Schwann cells, which are also targeted by autoreactive T lymphocytes and express specific antigens, such as the neurotrophic factor S100-β. Previous work has shown increased proliferative responses to whole S100-β in both human T1D patients and the nonobese diabetic (NOD) mouse model. We describe for the first time naturally processed and presented epitopes (NPPEs) presented by class I human leukocyte antigen–A*02:01 (A2.1) molecules derived from S100-β. These NPPEs triggered IFN-γ responses more frequently in both newly diagnosed and long-term T1D patients compared with healthy donors. Furthermore, the same NPPEs are recognized during the autoimmune response leading to diabetes in A2.1-transgenic NOD mice as early as 4 wk of age. Interestingly, when these NPPEs are used to prevent diabetes in this animal model, an acceleration of the disease is observed together with an exacerbation in insulitis and an increase in S100-β–specific cytotoxicity in vaccinated animals. Whether these can be used in diabetes prevention needs to be carefully evaluated in animal models before use in future clinical assays.—Calviño-Sampedro, C., Gomez-Tourino, I., Cordero, O. J., Reche, P. A., Gómez-Perosanz, M., Sánchez-Trincado, J. L., Rodríguez, M. Á., Sueiro, A. M., Viñuela, J. E., Calviño, R. V. Naturally presented HLA class I–restricted epitopes from the neurotrophic factor S100-β are targets of the autoimmune response in type 1 diabetesThe authors thank Dr. Sefina Arif (King’s College London, London, United Kingdom) for critically reviewing the manuscript. This work was funded by the Ministerio de Economía y Competitividad (Grant BIO2014-53091-C3-3-R to R.V.C.). During this work, I.G.-T. was supported by a Maria Barbeito predoctoral fellowship (Xunta de Galicia, La Coruña, Spain). During this work, C.C.-S. was supported by a Deputación da Coruña grant (2012–2013 and 2016–2017)S

Hydrophobic CDR3 residues promote the development of self-reactive T cells

Studies of individual T cell antigen receptors (TCRs) have shed some light on structural features that underlie self-reactivity. However, the general rules that can be used to predict whether TCRs are self-reactive have not been fully elucidated. Here we found that the interfacial hydrophobicity of amino acids at positions 6 and 7 of the complementarity-determining region CDR3β robustly promoted the development of self-reactive TCRs. This property was found irrespective of the member of the β-chain variable region (V[subscript β]) family present in the TCR or the length of the CDR3β. An index based on these findings distinguished V[subscript β]2[superscript +], V[subscript β]6[superscript +] and V[subscript β]8.2[superscript +] regulatory T cells from conventional T cells and also distinguished CD4[superscript +] T cells selected by the major histocompatibility complex (MHC) class II molecule I-A[superscript g7] (associated with the development of type 1 diabetes in NOD mice) from those selected by a non–autoimmunity-promoting MHC class II molecule I-Ab. Our results provide a means for distinguishing normal T cell repertoires versus autoimmunity-prone T cell repertoires

Hydrophobic CDR3 residues promote the development of self-reactive T cells

Studies of individual T cell antigen receptors (TCRs) have shed some light on structural features that underlie self-reactivity. However, the general rules that can be used to predict whether TCRs are self-reactive have not been fully elucidated. Here we found that the interfacial hydrophobicity of amino acids at positions 6 and 7 of the complementarity-determining region CDR3β robustly promoted the development of self-reactive TCRs. This property was found irrespective of the member of the β-chain variable region (Vβ) family present in the TCR or the length of the CDR3β. An index based on these findings distinguished Vβ2(+), Vβ6(+) and Vβ8.2(+) regulatory T cells from conventional T cells and also distinguished CD4(+) T cells selected by the major histocompatibility complex (MHC) class II molecule I-A(g7) (associated with the development of type 1 diabetes in NOD mice) from those selected by a non-autoimmunity-promoting MHC class II molecule I-A(b). Our results provide a means for distinguishing normal T cell repertoires versus autoimmunity-prone T cell repertoires

Hydrophobic CDR3 residues promote the development of self-reactive T cells.

Studies of individual T cell antigen receptors (TCRs) have shed some light on structural features that underlie self-reactivity. However, the general rules that can be used to predict whether TCRs are self-reactive have not been fully elucidated. Here we found that the interfacial hydrophobicity of amino acids at positions 6 and 7 of the complementarity-determining region CDR3β robustly promoted the development of self-reactive TCRs. This property was found irrespective of the member of the β-chain variable region (Vβ) family present in the TCR or the length of the CDR3β. An index based on these findings distinguished Vβ2(+), Vβ6(+) and Vβ8.2(+) regulatory T cells from conventional T cells and also distinguished CD4(+) T cells selected by the major histocompatibility complex (MHC) class II molecule I-A(g7) (associated with the development of type 1 diabetes in NOD mice) from those selected by a non-autoimmunity-promoting MHC class II molecule I-A(b). Our results provide a means for distinguishing normal T cell repertoires versus autoimmunity-prone T cell repertoires

Discovery of a selective islet peptidome presented by the highest-risk HLA-DQ8trans molecule

Transplantation and autoimmunit

Study of plasma anti-CD26 autoantibody levels in a cohort of treatment-naïve early arthritis patients

In rheumatoid arthritis (RA), the identifcation of biomarkers to adjust treatment intensity and to correctly diagnose the disease in early stages still constitutes a challenge and, as such, novel biomarkers are needed. We proposed that autoantibodies (aAbs) against CD26 (DPP4) might have both etiological importance and clinical value. Here, we perform a prospective study of the potential diagnostic power of Anti-CD26 aAbs through their quantifcation in plasmas from 106 treatment-naïve early and undiferentiated AR. Clinical antibodies, Anti-CD26 aAbs, and other disease-related biomarkers were measured in plasmas obtained in the frst visit from patients, which were later classifed as RA and non-RA according to the American College of Rheumatology criteria. Two diferent isotype signatures were found among ten groups of patients, one for AntiCD26 IgA and other for Anti-CD26 IgG and IgM isotypes, both converging in patients with arthritis (RA and Unresolved Undiferentiated Arthritis: UUA), who present elevated levels of all three isotypes. The four UUA patients, unresolved after two years, were ACPA and rheumatic factor (RF) negatives. In the whole cohort, 51.3% of ACPA/RF seronegatives were Anti-CD26 positives, and a similar frequency was observed in the seropositive RA patients. Only weak associations of the three isotypes with ESR, CRP and disease activity parameters were observed. Anti-CD26 aAbs are present in treatmentnaïve early arthritis patients, including ACPA and RF seronegative individuals, suggestive of a potential pathogenic and/or biomarker role of Anti-CD26 aAbs in the development of rheumatic diseasesOpen Access funding provided thanks to the CRUE-CSIC agreement with Springer Nature. This work was supported by the European Union (Interreg V-A Spain-Portugal Cooperative Program (POCTEP), the Health Research Institute Carlos III (ISCIII/PI21/00370/Cofinanciado por la Unión Europea/FEDER), and 0227_CodigoMais_1_E, USC-SERGAS Cooperation 2018–2019S