Detection of protein interactions based on GFP fragment complementation by fluorescence microscopy and spectrofluorometry

[Abstract] We have developed a set of simple modifications of the green fluorescent protein (GFP)fragment reassembly assay in bacteria that permits: (i)fluorescent microscopy visualization of GFP reassembly only 1-2 h after induction of protein expression, thus approximating the detection of GFP reassembly to the real-time dynamics of protein complex formation in living cells; (ii) spectrofluorometric detection of reassembled GFP fluorescent signals directly in lysates from cell suspension thereby avoiding, in many cases, the need for tag-affinity isolation of protein complexes; and (iii) comparative quantification of signal intensity in numerous cell-sample lysates using a Bio-Rad IQ5 spectrofluorometric detection system (Bio-Rad Laboratories, Madrid, Spain). Collectively, the results demonstrate that the combination of microscopic and spectrofluorometric detection provides a time-saving and sensitive alternative to existing methods of fluorescence complementation analysis.Ministerio de Educación y Ciencia; SAF2004-01462Galicia. Consellería de Innovación, Industria e Comercio; PGIDIT04BTF161001P

Exon-skipping brain natriuretic peptide variant is overexpressed in failing myocardium and attenuates brain natriuretic peptide production in vitro

Original research[Abstract] Brain natriuretic peptide/natriuretic peptide precursor B (NPPB) is one of the most studied genes in relation to heart failure (HF) conditions. However, it is still unclear as to whether alternative splicing could create NPPB mRNA variants, which may be expressed in normal and diseased myocardium. We aimed to identify and characterize a novel alternatively spliced variant of porcine and human NPPB resulting from exon 2 skipping (designated as ΔE2-NPPB). A variety of conventional molecular, biochemical and immunochemical methods were used to examine the expression and functional consequences of ΔE2-NPPB in vitro and in vivo. The pig ΔE2-NPPB mRNA is effectively translated into stable protein in cell-based assays but, in contrast to normally spliced NPPB, the ΔE2-NPPB protein is not secreted into the media. Co-transfection assays demonstrate that ΔE2-NPPB attenuates production and secretion of normally spliced NPPB, suggesting a negative feedback loop of NPPB signaling through generation of ΔE2-NPPB. The inhibitory effects of ΔE2-NPPB on the expression of NPPB are associated with sequence elements residing in exon 3 of ΔE2-NPPB. In piglets, ΔE2-NPPB gene expression is downregulated in both ventricles after birth, but it is markedly re-activated in the postnatal myocardium in experimental diastolic heart failure. In addition, we demonstrate that the exon-skipped NPPB variants are expressed in the postnatal and adult human myocardium and upregulated at end-stage HF due to dilated cardiomyopathy. Our work uncovers an important role of alternative exon skipping in the regulation of NPPB gene expression, thereby pinpointing a putative new mechanism for post-transcriptional regulation of NPPB production and secretion.Ministerio de Ciencia e Innovación; SAF2008- 00337Ministerio de Ciencia e Innovación; SAF2004-0146

Identificación y caracterización de genes con expresión diferencial izquierda-derecha en el miocardio ventricular neonatal : implicaciones fisiopatológicas

[Resumen] El marco teórico conceptual consiste en la proposición de que la respuesta transcripcional del miocardio ventricular al estrés biomecánico se determina no solo por el tipo de sobrecarga hemodinámica (de presión o de volumen) sino también por una configuración molecular diferente en las distintas cámaras ventriculares. Formalmente visto, esta proposición está sustentada en datos que demuestran que en mamíferos, desde la etapa de iniciación del desarrollo cardíaco hasta la formación del corazón adulto, existen diferencias en la expresión génica entre los dos ventrículos, aunque el corazón está expuesto a distintas condiciones de la circulación fetal versus postnatal. En este trabajo, pretendemos poner a prueba esta sugerencia especulativa, tomando como punto de partida un modelo natural que es el corazón de neonatos porcinos. En este contexto, los dos objetivos principales de la tesis doctoral son los siguientes: 1.- El análisis transcripcional a gran escala, mediante la tecnología mRNA differential display, del VI en comparación con el VD de cerdos recién nacidos con el fin de identificar los genes cuya expresión está preferiblemente asociada con el VI o VD antes de las manifestaciones morfológicas del remodelado hipertrófico concéntrico (VI) y excéntrico (VD). 2.- Identificar y caracterizar los transcriptos todavía no anotados cuyos niveles demuestran las diferencias izquierda/derecha significativas en el miocardio de recién nacidos porcinos y evaluar los niveles de su expresión en el miocardio ventricular en el modelo porcino y en pacientes con la insuficiencia cardíaca severa. Las conclusiones principales del trabajo son las siguientes: 1.- El análisis transcripcional comparativo del miocardio ventricular izquierdo (VI) versus derecho (VD) en neonatos porcinos establece los patrones distintivos de la expresión génica entre dos ventrículos antes del remodelado hipertrófico postnatal concéntrico (VI) o excéntrico (VD). Las diferencias regionales más llamativas se restringen a la expresión diferencial de un grupo reducido de los genes que incluye reguladores de la proliferación celular y de la expresión génica. 2.- Dentro de los transcriptos diferencialmente enriquecidos en el VI de neonatos porcinos se detectan dos, como fragmentos todavía no anotados en bases de datos, los cuales mostraron una homología secuencial con distintas regiones de los transcriptos primarios del gen ankrd1 o del gen nppb (dos genes marcadores de la hipertrofia concéntrica y del daño cardíaco). 3.- La clonación de estos dos fragmentos y su análisis posterior molecular/funcional ha resultado en la identificación y caracterización de las nuevas variantes de transcriptos de ankrd1 y nppb generadas por distintos tipos del splicing alternativo (retención de intrones o skipping de exones, respectivamente). 4.- En el corazón porcino neonatal, el gen ankrd1 se expresa como cuatro variantes, tres de las cuales se caracterizan por la distinta combinación de los intrones retenidos. En el corazón humano (neonatal y adulto) se detectan dos ortólogos de las variantes del ankrd1 porcino con intrones retenidos. 5.- Los transcriptos de ankrd1 con intrones retenidos son funcionalmente intactos y capaces de sintetizar los productos proteicos relevantes en sistemas de expresión in vitro. En distintas condiciones in vivo, las variantes ankrd1: (a) se exportan al citoplasma de cardiomiocitos porcinos; (b) se co-expresan en el corazón neonatal porcino y humano con una prevalencia de su expresión en el miocardio izquierdo y (c) se up-regulan, conjuntamente con el transcripto ankrd1 regular (sin intrones retenidos), en el modelo porcino de la insuficiencia cardíaca. 6.- En experimentos modelo in vivo, la expresión forzada del vector de ankrd1 regular en el miocardio porcino resulta en una up-regulación de la expresión endógena de sus variantes con intrones retenidos (pero no del transcripto endógeno regular) que se acompaña por un incremento del producto proteico ANKRD1 en el miocardio transfectado. 7.- El miocardio normal porcino y humano manifiesta splicing alternativo del ARNm primario del gen nppb, basado en el skipping de exones. Las variantes de nppb correspondientes: (a) se expresan en sistemas celulares modelo in vitro, (b) se co-expresan en el corazón neonatal porcino y humano con una prevalencia de su expresión en el miocardio izquierdo y (c) se up-regulan, conjuntamente con el transcripto nppb regular (sin el skipping de exones), en el miocardio ventricular tanto en el modelo porcino como en pacientes con la insuficiencia cardíaca. 8.- En los ensayos de co-transfección celular in vitro, los niveles intracelulares y la secreción de la pre-proteína NPPB están negativamente regulados por la co-expresión proteica de su variante con el skipping del exón 2 (DE2-NPPB). La actividad inhibitoria de la isoforma DE2-NPPB sobre la expresión de la isoforma NPPB regular se determina por los residuos localizados dentro de la secuencia de DE2-NPPB codificada por el exón 3. 9.- Nuestros resultados de la identificación, el análisis de la expresión y la caracterización funcional de las nuevas variantes de ankrd1 y nppb, generadas por distintos tipos del splicing alternativo (retención de intrones o skipping de exones), puede considerarse como una premisa prometedora para estudios de la regulación post-transcripcional de la expresión de estos dos genes en varias patologías cardiovasculares

Ionicity and bonding in a-Si1-yNy

Research article[Abstract] Background. Myocardin (MYOCD), a potent transcriptional coactivator of smooth muscle (SM) and cardiac genes, is upregulated in failing myocardium in animal models and human end-stage heart failure (HF). However, the molecular and functional consequences of myocd upregulation in HF are still unclear. Methodology/Principal Findings. The goal of the present study was to investigate if targeted inhibition of upregulated expression of myocd could influence failing heart gene expression and function. To this end, we used the doxorubicin (Dox)-induced diastolic HF (DHF) model in neonatal piglets, in which, as we show, not only myocd but also myocd-dependent SM-marker genes are highly activated in failing left ventricular (LV) myocardium. In this model, intra-myocardial delivery of short-hairpin RNAs, designed to target myocd variants expressed in porcine heart, leads on day 2 post-delivery to: (1) a decrease in the activated expression of myocd and myocd-dependent SM-marker genes in failing myocardium to levels seen in healthy control animals, (2) amelioration of impaired diastolic dysfunction, and (3) higher survival rates of DHF piglets. The posterior restoration of elevated myocd expression (on day 7 post-delivery) led to overexpression of myocd-dependent SM-marker genes in failing LV-myocardium that was associated with a return to altered diastolic function. Conclusions/Significance. These data provide the first evidence that a moderate inhibition (e.g., normalization) of the activated MYOCD signaling in the diseased heart may be promising from a therapeutic point of view.Ministerio de Ciencia e Innovación; AF2008-00337Galicia. Consellería de Economía e Industria; 8CSA008161P