Charakterisierung von polyklonalen Antikörpern für die Optimierung eines Fluoroimmunossays

Drei polyklonale Antikörpern gegen Estron, Estradiol und Estrogene wurden auf die aktiven Konzentrationen und Affinitätskonstanten charakterisiert, um einen homogenen Immunoassay, basierend auf dem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer, zu optimieren. Ein Biacore 2000, das auf dem Prinzip der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) basiert, wurde als Hilfsmittel für alle Messungen der Charakterisierung benutzt. Jeder Antikörper bindet ein bestimmtes Analytderivat, darüber hinaus sind Kreuzreaktivitäten vorhanden. Diese wurden getestet. Die aktive Konzentration jedes Antikörpers wurde mit jedem reaktiven Derivat ermittelt. Assoziations- und Dissoziationsratenkonstante zwischen Antikörpern und dem auf der Oberfläche immobilisierten Derivat wurde bestimmt. Damit konnten die Affinitätskonstanten berechnet werden. Die Affinitätskonstanten jedes Antikörpers für die drei Analyte (Estron, Estradiol und Ethinylestradiol) wurden über Inhibitionskurven ermittelt. Diese drei Typen von Messungen (aktive Konzentrationen, kinetische Ratenkonstanten und Affinitätskonstanten) wurden bei unmarkierten und bei mit Fluorophoren markierten Antikörpern gemacht. Die Markierung kann einen Einfluss auf die Antikörperaktivität zeigen: sie kann z.B. sehr stark die aktive Konzentration reduzieren. Dieser Effekt wirkt sich auf den FRET Assay aus. Da der FRET Assay kompetitiv ist, wurden der Testmittelpunkt und der Arbeitsbereich vom Verhältnis der Affinitätskonstanten von IgG/Derivat und IgG/Analyte beeinflusst. Zusätzlich spielten die Absolutwerte der Affinitätskonstanten eine Rolle. Testmittelpunkt und Arbeitsbereich waren von den gefundenen Konstanten abhängig. Die FRET Ergebnisse werden mit Hilfe der SPR Messungen diskutiert. Eine Korrelation zwischen den aktiven Antikörper Konzentrationen und der Effektivität des FRET Assays wurde für die untersuchten Antigen/Antikörper Paare gefunden

Kinetische und thermodynamische Charakterisierung von einem monoklonalen Antikörper gegen Estradiol mit Oberflächenplasmonenresonanz

Der monoklonale anti-Estradiol Antikörper 15H11 wurde charakterisiert, um sein Bindungsverhalten zu Estradiol und verwandten Analyten aufzuklären. Das Biacore 2000, das auf dem Prinzip der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) basiert, wurde als Hilfsmittel für alle Messungen benutzt. Die Charakterisierung von Reaktivität und Kreuzreaktivität des Antikörpers sollte dazu verwendet werden, einen kompetitiven homogenen Fluoro-immunoassay zu optimieren. Zwei verschiedene Derivate wurden auf dem Transducer immobilisiert, um das 15H11 IgG spezifisch zu binden. Diese immobilisierten Verbindungen waren Derivate von Estradiol, die eine Säuregruppe in Position 6 und 7 enthielten. Das Derivat E2-7-CMO war das Immunogen, gegen das der Antikörper ursprünglich entwickelt wurde. Bei kinetisch kontrollierter Bindung der Antikörper auf der Oberfläche wurden die Assoziations- und Dissoziationsratenkonstanten für E2-6-CMO bzw. E2-7-CMO mit 15H11 bestimmt. Damit konnten die Affinitätskonstanten zwischen Derivat und Antikörper bestimmt werden. Die Messungen wurden bei Temperaturen zwischen 10 und 30 °C durchgeführt, um die thermodynamische Größen, Enthalpie und Entropie zu ermitteln, die anzeigen, welcher Typ von Kräften für die Wechselwirkungen zwischen Analyt und Antikörper entscheidend ist. Die Affinitätskonstante zwischen dem Immunogen E2-7-CMO und dem Antikörper war bei jeder Temperatur höher als die zwischen E2-6-CMO und dem Antikörper. Die Affinität war sehr stark Entropie kontrolliert, was typisch für hydrophobe Wechselwirkungen ist. Unter Massentransport-kontrollierten Bedingungen wurden die aktive Konzentration von 15H11 sowie die Inhibitionskurven mit verschiedenen Analyten bestimmt. Die aktive Konzentration wurde für verschiedene eingesetzte Konzentrationen ermittelt. Die Ergebnisse dieser Messungen zeigten, daß das IgG mit zunehmender Verdünnung weniger aktiv war

Angiotensin II type 1-receptor activating antibodies in renal-allograft rejection (authors reply inN Engl J Med. 2005 May 12;352(19):2027-8)

BACKGROUND: Antibodies against HLA antigens cause refractory allograft rejection with vasculopathy in some, but not all, patients. METHODS: We studied 33 kidney-transplant recipients who had refractory vascular rejection. Thirteen had donor-specific anti-HLA antibodies, whereas 20 did not Malignant hypertension was present in 16 of the patients without anti-HLA antibodies, 4 of whom had seizures. The remaining 17 patients had no malignant hypertension. We hypothesized that activating antibodies targeting the angiotensin II type 1 (AT1) receptor might be involved. RESULTS: Activating IgG antibodies targeting the AT1 receptor were detected in serum from all 16 patients with malignant hypertension and without anti-HLA antibodies, but in no other patients. These receptor-activating antibodies are subclass IgG1 and IgG3 antibodies that bind to two different epitopes on the second extracellular loop of the AT1 receptor. Tissue factor expression was increased in renal-biopsy specimens from patients with these antibodies. In vitro stimulation of vascular cells with an AT1-receptor-activating antibody induced phosphorylation of ERK 1/2 kinase and increased the DNA binding activity of the transcription factors activator protein 1 (AP-1) and nuclear factor-κB. The AT1 antagonist losartan blocked agonistic AT1-receptor antibody-mediated effects, and passive antibody transfer induced vasculopathy and hypertension in a rat kidney-transplantation model. CONCLUSIONS: A non-HLA, AT1-receptor-mediated pathway may contribute to refractory vascular rejection, and affected patients might benefit from removal of AT 1-receptor antibodies or from pharmacologic blockade of AT 1 receptors

Notch signaling during human T cell development

Notch signaling is critical during multiple stages of T cell development in both mouse and human. Evidence has emerged in recent years that this pathway might regulate T-lineage differentiation differently between both species. Here, we review our current understanding of how Notch signaling is activated and used during human T cell development. First, we set the stage by describing the developmental steps that make up human T cell development before describing the expression profiles of Notch receptors, ligands, and target genes during this process. To delineate stage-specific roles for Notch signaling during human T cell development, we subsequently try to interpret the functional Notch studies that have been performed in light of these expression profiles and compare this to its suggested role in the mouse

Changes in marine phytoplankton diversity: Assessment under the Marine Strategy Framework Directive

Publisher’s embargo period: Embargo set on 11.03.2019 by SR (TIS)