11 research outputs found

    Effect of cell culture media on extracellular vesicle secretion from mesenchymal stromal cells and neurons

    Get PDF
    Publisher Copyright: © 2022Background: Extracellular vesicles (EVs) secreted by neuronal cells in vitro have promising therapeutic potential for brain diseases. Optimization of cell culture conditions and methodologies for high-yield isolation of EVs for preclinical and clinical applications, however, remains a challenge. Objective: To probe the cell culture conditions required for optimal EV secretion by human-derived neuronal cells. Methodology: First, we optimized the EV purification protocol using human mesenchymal stromal cell (MSC) cultures. Next, we compared the effects of different variables in human pluripotent stem cell (hPSC)-derived neuronal cultures on EV secretion. EVs were isolated from cell conditioned media (CCM) and control media with no cells (NCC) using ultrafiltration combined with size-exclusion chromatography (SEC). The hPSC neurons were cultured in 2 different media from which EVs were collected at 2 maturation time-points (days 46 and 60). Stimulation with 25 mM KCl was also evaluated as an activator of EV secretion by neurons. The collected SEC fractions were analyzed by nanoparticle tracking analysis (NTA), protein concentration assay, and blinded transmission electron microscopy (TEM). Results: A peak in cup-shaped particles was observed in SEC fractions 7–10 of MSC samples, but not corresponding media controls, indicating successful isolation of EVs. Culture medium had no significant effect on EV yield. The EV yield of the samples did not differ significantly according to the culture media used or the cell maturation time-points. Stimulation of neurons with KCl for 3 h reduced rather than increased the EV yield. Conclusions: We demonstrated successful EV isolation from MSC and neuronal cells using an ultrafiltration-SEC method. The EV yield from MSC and neuronal cultures exhibited a large batch effect, apparently related to the culture media used, highlighting the importance of including NCC as a negative control in all cell culture experiments.Peer reviewe

    Functional characterization of human pluripotent stem cell-derived cortical networks differentiated on laminin-521 substrate : comparison to rat cortical cultures

    Get PDF
    Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived neurons provide exciting opportunities for in vitro modeling of neurological diseases and for advancing drug development and neurotoxicological studies. However, generating electrophysiologically mature neuronal networks from hPSCs has been challenging. Here, we report the differentiation of functionally active hPSC-derived cortical networks on defined laminin-521 substrate. We apply microelectrode array (MEA) measurements to assess network events and compare the activity development of hPSC-derived networks to that of widely used rat embryonic cortical cultures. In both of these networks, activity developed through a similar sequence of stages and time frames; however, the hPSC-derived networks showed unique patterns of bursting activity. The hPSC-derived networks developed synchronous activity, which involved glutamatergic and GABAergic inputs, recapitulating the classical cortical activity also observed in rodent counterparts. Principal component analysis (PCA) based on spike rates, network synchronization and burst features revealed the segregation of hPSC-derived and rat network recordings into different clusters, reflecting the species-specific and maturation state differences between the two networks. Overall, hPSC-derived neural cultures produced with a defined protocol generate cortical type network activity, which validates their applicability as a human-specific model for pharmacological studies and modeling network dysfunctions.Peer reviewe

    In vitro kasvatusolosuhteiden vaikutus ihmisen monikykyisistä kantasoluista erilaistettuihin keskushermoston soluihin: Kudosteknologiset sovellukset selkäydinvaurion hoitoon

    No full text
    Ihmisen monikykyiset kantasolut ovat kykeneviä jakaantumaan loputtomasti sekä erilaistumalla tuottamaan mitä tahansa ihmiskehon solutyyppiä. Monikykyisiä kantasoluja ovat sekä alkion sisäsolumassasta eristetyt alkion kantasolut, että erilaistuneista soluista geneettisesti muokatut indusoidut monikykyiset kantasolut. Monikykyiset kantasolut voidaan laboratorio-olosuhteissa tehokkaasti ohjata erilaistumaan kaikiksi keskushermoston tärkeimmiksi solutyypeiksi; hermosoluiksi, astrosyyteiksi, ja oligodendrosyyteiksi. Monikykyisistä kantasoluista erilaistettuja keskushermoston soluja voidaan hyödyntää keskushermoston kehityksen ja häiriöiden in vitro mallinnuksessa. Lisäksi monikykyisistä kantasoluista voidaan tuottaa soluja korvaamaan vahingoittunutta kudosta keskushermoston vaurioiden ja sairauksien hoidossa. Keskushermostoon kuuluvan selkäytimen vaurioituminen johtaa tahdonalaisen lihastoiminnan, tuntoaistin, ja autonomisten toimintojen häiriöihin tai katoamiseen. Keskushermoston solujen rajallisen uusiutumiskyvyn vuoksi kantasolusiirteitä on tutkittu paljon yhtenä vaihtoehtona selkäydinvaurion hoitoon. Tällä hetkellä tehokasta hoitoa selkäydinvaurioon ei ole. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli tutkia eri tekijöiden, kuten solujen geneettisen taustan sekä kemiallisen ja mekaanisen induktion, vaikutusta monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen keskushermoston solujen erilaistumiseen ja käyttäytymiseen in vitro kasvatusolosuhteissa. Tuloksia voidaan hyödyntää kehitettäessä kudosteknologisia sovelluksia selkäydinvaurion hoitoon. Ensimmäisessä osatyössä tutkittiin useiden monikykyisien kantasolulinjojen hermosoluerilaistustehokkuutta, ja pyrittiin selvittämään systemaattisia eroja alkion kantasolujen ja indusoitujen monikykyisien kantasolujen välillä. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet että huolimatta näiden solutyyppien samankaltaisuudesta, niiden alkuperästä johtuvat geneettiset eroavaisuudet saattavat vaikuttaa solujen erilaistumistehokkuuteen. Tulokset osoittivat että solulinjojen välillä on selvästi linjakohtaisia eroja erilaistumistehokkuudessa. Vaihtelua on kuitenkin huomattavasti enemmän yksittäisten solulinjojen kuin eri lähteistä peräisin olevien monikykyisien kantasolutyyppien välillä. Seuraavaksi monikykyisten kantasolujen erilaistusta pyrittiin ohjaamaan kemiallisella induktiolla tarkasti määritellyissä kasvatusolosuhteissa. Erilaisia kasvutekijöitä käytettiin tarkoin ajoitettuna suuntaamaan solujen erilaistumista ensin keskushermoston esiastesoluiksi ja myöhemmin oligodendrosyyttien esiastesoluiksi ja oligodendrosyyteiksi. Menetelmällä saavutettiin oligodendrosyyttien esiastesolujen tehokas erilaistuminen, mutta solujen kypsymistä oligodendrosyyteiksi pitäisi edelleen vakauttaa ja tehostaa. Solujen kohdennettu erilaistus tapahtui ilman eläinperäisiä tekijöitä sisältäviä yhdisteitä, mikä mahdollistaa tällä menetelmällä tuotettujen solujen käytön kliinisissä sovelluksissa. Erilaistusmenetelmästä muokattiin myös kustannustehokkaampi, tutkimustasoinen menetelmä. Soluväliaineen molekyylien vaikutusta monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen hermosolujen ja astrosyyttien käyttäytymiseen ja kehitykseen in vitro tutkittiin useilla laminiini-molekyylin isoformeilla. Soluväliaine on solunulkoinen matriisi, joka tukee solujen erilaistumista, kasvua, ja kehitystä sekä rakenteellisesti että kemiallisesti. Tulokset osoittivat että sekä hermosolut että astrosyytit kiinnittyvät ja kasvavat parhaiten pinnoitteilla, jotka sisältävät laminiinin α5-ketjurakenteen. Nämä pinnoitteet myös tehostivat hermosolujen verkostotason toiminnallista kehitystä. Tässä työssä käytetyt pinnoitteet ovat myös kliiniseen käyttöön sopivia, ja niitä voidaan hyödyntää monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen keskushermoston solujen tuottoon kudosteknologisia sovelluksia varten. Lopuksi kasvatusolosuhteiden mekaanisen muokkauksen vaikutusta tutkittiin monikykyisistä kantasoluista erilaistetuilla hermosoluilla, astrosyyteillä, ja oligodendrosyyttien esiastesoluilla. Soluja kasvatettiin nanokuitupinnoilla, joiden topografia vastaa selkäytimen solujen suuntautumista in vivo. Nanokuitujen havaittiin vaikuttavan kaikkien solutyyppien kasvuun, ja solujen nähtiin suuntautuvan kasvatusalustan nanokuitujen mukaisesti. Pelkät nanokuidut eivät tukeneet hermosolujen ja astrosyyttien kasvua, mutta kun kuitujen pinta käsiteltiin aiemmin tutkituilla α5-ketjurakenteen sisältävillä laminiini-pinnoitteilla, molempien solutyyppien kasvua voitiin huomattavasti parantaa. Lisäksi osoitettiin, että monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen hermosolujen kasvua voidaan ohjata nanokuiduilla myös hydrogeelipohjaisessa 3D-ympäristössä, joka vastaa in vivo kasvuolosuhteita keskushermostossa paremmin kuin 2D pinta. Tämän väitöskirjan tulokset tuovat merkittävää lisätietoa ihmisen monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen keskushermoston solujen in vitro –kasvatuksesta. Tulokset ovat hyödynnettävissä kudosteknologisissa sovelluksissa sillä yhdistämällä ihmisperäisiä keskushermoston tärkeimpiä solutyyppejä, kliiniseen käyttöön sopivia kasvatuspinnoitteita, hydrogeelistä koostuva 3D ympäristö ja nanokuitujen ohjaava vaikutus voidaan edistää toiminnallisen solusiirteen kehitystä selkäydinvaurion hoitoon.Human pluripotent stem cells (hPSCs) are capable of self-renewal and differentiation into any cell type found in the human body. hPSCs include embryonic stem cells (ECSs), which are derived from the embryonic inner cell mass, as well as induced pluripotent stem cells (IPSCs), derived from somatic cells with specific transcription factors to induce pluripotency. hPSCs can be efficiently directed to differentiate into the main cell types of the central nervous system (CNS), neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. hPSC-derived neural cells provide an excellent approach to model CNS development and deficits in vitro and furthermore treat injuries and degenerative conditions by replacing damaged tissues. Spinal cord injury (SCI) describes damage to the spinal cord that leads to the loss of muscle function, sensation, or autonomic functions to different extents. CNS cells have limited capacity for regeneration, and cell replacement therapies have been extensively studied for SCI repair, as no efficient treatment for SCI currently exists. This thesis focused on studying various aspects, including genetic background and chemical and mechanical inductions, of hPSC-derived neural cell differentiation and behavior in vitro. The results were aimed to be applicable for developing tissue engineering products for SCI repair. First, the neural differentiation potentials of several hPSC lines were compared in vitro in order to discover the presence of potential systematic differences between hESCs and hIPSCs. Previous studies have demonstrated that despite their considerable resemblance, the different genetic backgrounds of hESCs and hIPSCs may reflect to their differentiation potential. Our results revealed cell line-specific variations in neural differentiation efficiency. However, the variation between individual hESC and hIPSC lines was higher than the variation between cell lines of different origins, indicating the lack of systematic differences between the two hPSC types. Next, chemical induction was studied for the differentiation of hPSC-derived oligodendrocytes. A variety of growth factors and morphogens were used in a temporally defined manner to direct the differentiation through the neural precursor cell stage into oligodendrocyte precursor cells (OPCs), and finally to maturing oligodendrocytes. Although efficient differentiation of OPCs was achieved, the maturation of the cells into oligodendrocytes should be further stabilized and enhanced. The differentiation process was initially performed under xeno-free and defined culture conditions, enabling clinical applications of the produced cells. The protocol was also adapted into a more cost-effective research-grade method. Cellular responses to different extracellular matrix (ECM) molecules in vitro was studied with hPSC-derived neurons and astrocytes. ECM is found at the intercellular space in vivo and it provides both structural support and chemical cues for cell survival, differentiation, migration, and growth. Neurons and astrocytes were cultured on defined ECM substrates using different isoforms or fragments of laminin molecule. hPSC-derived neurons and astrocytes were shown to attach and grow most efficiently on substrates containing laminin α5-chain. These substrates also enhanced the functional development of neuronal networks. The studied substrates were both defined and xeno-free and thus can be used as platforms for the efficient production of clinical-grade neural cells from hPSCs. Finally, the effects of mechanical alterations in the culture conditions were studied with hPSC-derived neurons, astrocytes, and OPCs. The cells were cultured on aligned nanofiber platforms mimicking the aligned cellular orientation in the spinal cord. All cell types were found to orient according to the underlying fiber alignment. However, ECM protein-coating for the nanofibers was required for efficient growth of the neurons and astrocytes, and previously identified laminin α5-chain substrates were successfully applied here. As the 3D cultures resemble in vivo conditions more accurately than traditional 2D culturing surfaces, orientation guidance of hPSC-derived neurons was also demonstrated in 3D culture conditions consisting of nanofiber platform and hydrogel component. In conclusion, the results of this thesis provide new insights for the culturing of hPSC-derived neural cells in vitro. These results can be utilized for tissue engineering applications, as combination of hPSC-derived CNS cells, clinically relevant ECM substrates, 3D environment of the hydrogel and guiding features of the nanofibers would be beneficial for the development of functional cell grafts for SCI repair

    In vitro kasvatusolosuhteiden vaikutus ihmisen monikykyisistä kantasoluista erilaistettuihin keskushermoston soluihin: Kudosteknologiset sovellukset selkäydinvaurion hoitoon

    No full text
    Ihmisen monikykyiset kantasolut ovat kykeneviä jakaantumaan loputtomasti sekä erilaistumalla tuottamaan mitä tahansa ihmiskehon solutyyppiä. Monikykyisiä kantasoluja ovat sekä alkion sisäsolumassasta eristetyt alkion kantasolut, että erilaistuneista soluista geneettisesti muokatut indusoidut monikykyiset kantasolut. Monikykyiset kantasolut voidaan laboratorio-olosuhteissa tehokkaasti ohjata erilaistumaan kaikiksi keskushermoston tärkeimmiksi solutyypeiksi; hermosoluiksi, astrosyyteiksi, ja oligodendrosyyteiksi. Monikykyisistä kantasoluista erilaistettuja keskushermoston soluja voidaan hyödyntää keskushermoston kehityksen ja häiriöiden in vitro mallinnuksessa. Lisäksi monikykyisistä kantasoluista voidaan tuottaa soluja korvaamaan vahingoittunutta kudosta keskushermoston vaurioiden ja sairauksien hoidossa. Keskushermostoon kuuluvan selkäytimen vaurioituminen johtaa tahdonalaisen lihastoiminnan, tuntoaistin, ja autonomisten toimintojen häiriöihin tai katoamiseen. Keskushermoston solujen rajallisen uusiutumiskyvyn vuoksi kantasolusiirteitä on tutkittu paljon yhtenä vaihtoehtona selkäydinvaurion hoitoon. Tällä hetkellä tehokasta hoitoa selkäydinvaurioon ei ole. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli tutkia eri tekijöiden, kuten solujen geneettisen taustan sekä kemiallisen ja mekaanisen induktion, vaikutusta monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen keskushermoston solujen erilaistumiseen ja käyttäytymiseen in vitro kasvatusolosuhteissa. Tuloksia voidaan hyödyntää kehitettäessä kudosteknologisia sovelluksia selkäydinvaurion hoitoon. Ensimmäisessä osatyössä tutkittiin useiden monikykyisien kantasolulinjojen hermosoluerilaistustehokkuutta, ja pyrittiin selvittämään systemaattisia eroja alkion kantasolujen ja indusoitujen monikykyisien kantasolujen välillä. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet että huolimatta näiden solutyyppien samankaltaisuudesta, niiden alkuperästä johtuvat geneettiset eroavaisuudet saattavat vaikuttaa solujen erilaistumistehokkuuteen. Tulokset osoittivat että solulinjojen välillä on selvästi linjakohtaisia eroja erilaistumistehokkuudessa. Vaihtelua on kuitenkin huomattavasti enemmän yksittäisten solulinjojen kuin eri lähteistä peräisin olevien monikykyisien kantasolutyyppien välillä. Seuraavaksi monikykyisten kantasolujen erilaistusta pyrittiin ohjaamaan kemiallisella induktiolla tarkasti määritellyissä kasvatusolosuhteissa. Erilaisia kasvutekijöitä käytettiin tarkoin ajoitettuna suuntaamaan solujen erilaistumista ensin keskushermoston esiastesoluiksi ja myöhemmin oligodendrosyyttien esiastesoluiksi ja oligodendrosyyteiksi. Menetelmällä saavutettiin oligodendrosyyttien esiastesolujen tehokas erilaistuminen, mutta solujen kypsymistä oligodendrosyyteiksi pitäisi edelleen vakauttaa ja tehostaa. Solujen kohdennettu erilaistus tapahtui ilman eläinperäisiä tekijöitä sisältäviä yhdisteitä, mikä mahdollistaa tällä menetelmällä tuotettujen solujen käytön kliinisissä sovelluksissa. Erilaistusmenetelmästä muokattiin myös kustannustehokkaampi, tutkimustasoinen menetelmä. Soluväliaineen molekyylien vaikutusta monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen hermosolujen ja astrosyyttien käyttäytymiseen ja kehitykseen in vitro tutkittiin useilla laminiini-molekyylin isoformeilla. Soluväliaine on solunulkoinen matriisi, joka tukee solujen erilaistumista, kasvua, ja kehitystä sekä rakenteellisesti että kemiallisesti. Tulokset osoittivat että sekä hermosolut että astrosyytit kiinnittyvät ja kasvavat parhaiten pinnoitteilla, jotka sisältävät laminiinin α5-ketjurakenteen. Nämä pinnoitteet myös tehostivat hermosolujen verkostotason toiminnallista kehitystä. Tässä työssä käytetyt pinnoitteet ovat myös kliiniseen käyttöön sopivia, ja niitä voidaan hyödyntää monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen keskushermoston solujen tuottoon kudosteknologisia sovelluksia varten. Lopuksi kasvatusolosuhteiden mekaanisen muokkauksen vaikutusta tutkittiin monikykyisistä kantasoluista erilaistetuilla hermosoluilla, astrosyyteillä, ja oligodendrosyyttien esiastesoluilla. Soluja kasvatettiin nanokuitupinnoilla, joiden topografia vastaa selkäytimen solujen suuntautumista in vivo. Nanokuitujen havaittiin vaikuttavan kaikkien solutyyppien kasvuun, ja solujen nähtiin suuntautuvan kasvatusalustan nanokuitujen mukaisesti. Pelkät nanokuidut eivät tukeneet hermosolujen ja astrosyyttien kasvua, mutta kun kuitujen pinta käsiteltiin aiemmin tutkituilla α5-ketjurakenteen sisältävillä laminiini-pinnoitteilla, molempien solutyyppien kasvua voitiin huomattavasti parantaa. Lisäksi osoitettiin, että monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen hermosolujen kasvua voidaan ohjata nanokuiduilla myös hydrogeelipohjaisessa 3D-ympäristössä, joka vastaa in vivo kasvuolosuhteita keskushermostossa paremmin kuin 2D pinta. Tämän väitöskirjan tulokset tuovat merkittävää lisätietoa ihmisen monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen keskushermoston solujen in vitro –kasvatuksesta. Tulokset ovat hyödynnettävissä kudosteknologisissa sovelluksissa sillä yhdistämällä ihmisperäisiä keskushermoston tärkeimpiä solutyyppejä, kliiniseen käyttöön sopivia kasvatuspinnoitteita, hydrogeelistä koostuva 3D ympäristö ja nanokuitujen ohjaava vaikutus voidaan edistää toiminnallisen solusiirteen kehitystä selkäydinvaurion hoitoon.Human pluripotent stem cells (hPSCs) are capable of self-renewal and differentiation into any cell type found in the human body. hPSCs include embryonic stem cells (ECSs), which are derived from the embryonic inner cell mass, as well as induced pluripotent stem cells (IPSCs), derived from somatic cells with specific transcription factors to induce pluripotency. hPSCs can be efficiently directed to differentiate into the main cell types of the central nervous system (CNS), neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. hPSC-derived neural cells provide an excellent approach to model CNS development and deficits in vitro and furthermore treat injuries and degenerative conditions by replacing damaged tissues. Spinal cord injury (SCI) describes damage to the spinal cord that leads to the loss of muscle function, sensation, or autonomic functions to different extents. CNS cells have limited capacity for regeneration, and cell replacement therapies have been extensively studied for SCI repair, as no efficient treatment for SCI currently exists. This thesis focused on studying various aspects, including genetic background and chemical and mechanical inductions, of hPSC-derived neural cell differentiation and behavior in vitro. The results were aimed to be applicable for developing tissue engineering products for SCI repair. First, the neural differentiation potentials of several hPSC lines were compared in vitro in order to discover the presence of potential systematic differences between hESCs and hIPSCs. Previous studies have demonstrated that despite their considerable resemblance, the different genetic backgrounds of hESCs and hIPSCs may reflect to their differentiation potential. Our results revealed cell line-specific variations in neural differentiation efficiency. However, the variation between individual hESC and hIPSC lines was higher than the variation between cell lines of different origins, indicating the lack of systematic differences between the two hPSC types. Next, chemical induction was studied for the differentiation of hPSC-derived oligodendrocytes. A variety of growth factors and morphogens were used in a temporally defined manner to direct the differentiation through the neural precursor cell stage into oligodendrocyte precursor cells (OPCs), and finally to maturing oligodendrocytes. Although efficient differentiation of OPCs was achieved, the maturation of the cells into oligodendrocytes should be further stabilized and enhanced. The differentiation process was initially performed under xeno-free and defined culture conditions, enabling clinical applications of the produced cells. The protocol was also adapted into a more cost-effective research-grade method. Cellular responses to different extracellular matrix (ECM) molecules in vitro was studied with hPSC-derived neurons and astrocytes. ECM is found at the intercellular space in vivo and it provides both structural support and chemical cues for cell survival, differentiation, migration, and growth. Neurons and astrocytes were cultured on defined ECM substrates using different isoforms or fragments of laminin molecule. hPSC-derived neurons and astrocytes were shown to attach and grow most efficiently on substrates containing laminin α5-chain. These substrates also enhanced the functional development of neuronal networks. The studied substrates were both defined and xeno-free and thus can be used as platforms for the efficient production of clinical-grade neural cells from hPSCs. Finally, the effects of mechanical alterations in the culture conditions were studied with hPSC-derived neurons, astrocytes, and OPCs. The cells were cultured on aligned nanofiber platforms mimicking the aligned cellular orientation in the spinal cord. All cell types were found to orient according to the underlying fiber alignment. However, ECM protein-coating for the nanofibers was required for efficient growth of the neurons and astrocytes, and previously identified laminin α5-chain substrates were successfully applied here. As the 3D cultures resemble in vivo conditions more accurately than traditional 2D culturing surfaces, orientation guidance of hPSC-derived neurons was also demonstrated in 3D culture conditions consisting of nanofiber platform and hydrogel component. In conclusion, the results of this thesis provide new insights for the culturing of hPSC-derived neural cells in vitro. These results can be utilized for tissue engineering applications, as combination of hPSC-derived CNS cells, clinically relevant ECM substrates, 3D environment of the hydrogel and guiding features of the nanofibers would be beneficial for the development of functional cell grafts for SCI repair

    Laminin α5 substrates promote survival, network formation and functional development of human pluripotent stem cell-derived neurons in vi

    Get PDF
    Laminins are one of the major protein groups in the extracellular matrix (ECM) and specific laminin isoforms are crucial for neuronal functions in the central nervous system in vivo. In the present study, we compared recombinant human laminin isoforms (LN211, LN332, LN411, LN511, and LN521) and laminin isoform fragment (LN511-E8) in in vitro cultures of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived neurons. We showed that laminin substrates containing the α5-chain are important for neuronal attachment, viability and network formation, as detected by phase contrast imaging, viability staining, and immunocytochemistry. Gene expression analysis showed that the molecular mechanisms involved in the preference of hPSC-derived neurons for specific laminin isoforms could be related to ECM remodeling and cell adhesion. Importantly, the microelectrode array analysis revealed the widest distribution of electrophysiologically active neurons on laminin α5 substrates, indicating most efficient development of neuronal network functionality. This study shows that specific laminin α5 substrates provide a controlled in vitro culture environment for hPSC-derived neurons. These substrates can be utilized not only to enhance the production of functional hPSC-derived neurons for in vitro applications like disease modeling, toxicological studies, and drug discovery, but also for the production of clinical grade hPSC-derived cells for regenerative medicine applications

    Effect of cell culture media on extracellular vesicle secretion from mesenchymal stromal cells and neurons

    Get PDF
    Publisher Copyright: © 2022Background: Extracellular vesicles (EVs) secreted by neuronal cells in vitro have promising therapeutic potential for brain diseases. Optimization of cell culture conditions and methodologies for high-yield isolation of EVs for preclinical and clinical applications, however, remains a challenge. Objective: To probe the cell culture conditions required for optimal EV secretion by human-derived neuronal cells. Methodology: First, we optimized the EV purification protocol using human mesenchymal stromal cell (MSC) cultures. Next, we compared the effects of different variables in human pluripotent stem cell (hPSC)-derived neuronal cultures on EV secretion. EVs were isolated from cell conditioned media (CCM) and control media with no cells (NCC) using ultrafiltration combined with size-exclusion chromatography (SEC). The hPSC neurons were cultured in 2 different media from which EVs were collected at 2 maturation time-points (days 46 and 60). Stimulation with 25 mM KCl was also evaluated as an activator of EV secretion by neurons. The collected SEC fractions were analyzed by nanoparticle tracking analysis (NTA), protein concentration assay, and blinded transmission electron microscopy (TEM). Results: A peak in cup-shaped particles was observed in SEC fractions 7–10 of MSC samples, but not corresponding media controls, indicating successful isolation of EVs. Culture medium had no significant effect on EV yield. The EV yield of the samples did not differ significantly according to the culture media used or the cell maturation time-points. Stimulation of neurons with KCl for 3 h reduced rather than increased the EV yield. Conclusions: We demonstrated successful EV isolation from MSC and neuronal cells using an ultrafiltration-SEC method. The EV yield from MSC and neuronal cultures exhibited a large batch effect, apparently related to the culture media used, highlighting the importance of including NCC as a negative control in all cell culture experiments.Peer reviewe

    Survival and Motor Phenotypes in FVB C9-500 ALS/FTD BAC Transgenic Mice Reproduced by Multiple Labs.

    No full text
    Mordes et al. (2020) did not detect the survival or motor phenotypes in C9orf72 BAC transgenic mice originally described by Liu et al. (2016). We discuss methodological differences between the Mordes and Liu studies, several additional studies in which survival and motor phenotypes were found, and possible environmental and genetic effects. First, Nguyen et al. (2020) showed robust ALS/FTD phenotypes in C9-BAC versus non-transgenic (NT) mice and that α-GA1 treatment improved survival, behavior, and neurodegeneration. The groups of Gelbard and Saxena also show decreased survival of C9-BAC versus NT mice and neuropathological and behavioral deficits similar to those shown by Liu et al. (2016). Although FVB/N mice can have seizures, increases in seizure severity and death of C9 and NT animals, which may mask C9 disease phenotypes, have been observed in recent C9-500 FVB/NJ-bred cohorts. In summary, we provide an update on phenotypes seen in FVB C9-BAC mice and additional details to successfully use this model. This Matters Arising Response paper addresses the Mordes et al. (2020) Matters Arising paper, published concurrently in Neuron
    corecore