In vitro kasvatusolosuhteiden vaikutus ihmisen monikykyisistä kantasoluista erilaistettuihin keskushermoston soluihin: Kudosteknologiset sovellukset selkäydinvaurion hoitoon
Ihmisen monikykyiset kantasolut ovat kykeneviä jakaantumaan loputtomasti sekä erilaistumalla tuottamaan mitä tahansa ihmiskehon solutyyppiä. Monikykyisiä kantasoluja ovat sekä alkion sisäsolumassasta eristetyt alkion kantasolut, että erilaistuneista soluista geneettisesti muokatut indusoidut monikykyiset kantasolut. Monikykyiset kantasolut voidaan laboratorio-olosuhteissa tehokkaasti ohjata erilaistumaan kaikiksi keskushermoston tärkeimmiksi solutyypeiksi; hermosoluiksi, astrosyyteiksi, ja oligodendrosyyteiksi. Monikykyisistä kantasoluista erilaistettuja keskushermoston soluja voidaan hyödyntää keskushermoston kehityksen ja häiriöiden in vitro mallinnuksessa. Lisäksi monikykyisistä kantasoluista voidaan tuottaa soluja korvaamaan vahingoittunutta kudosta keskushermoston vaurioiden ja sairauksien hoidossa. Keskushermostoon kuuluvan selkäytimen vaurioituminen johtaa tahdonalaisen lihastoiminnan, tuntoaistin, ja autonomisten toimintojen häiriöihin tai katoamiseen. Keskushermoston solujen rajallisen uusiutumiskyvyn vuoksi kantasolusiirteitä on tutkittu paljon yhtenä vaihtoehtona selkäydinvaurion hoitoon. Tällä hetkellä tehokasta hoitoa selkäydinvaurioon ei ole.
Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli tutkia eri tekijöiden, kuten solujen geneettisen taustan sekä kemiallisen ja mekaanisen induktion, vaikutusta monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen keskushermoston solujen erilaistumiseen ja käyttäytymiseen in vitro kasvatusolosuhteissa. Tuloksia voidaan hyödyntää kehitettäessä kudosteknologisia sovelluksia selkäydinvaurion hoitoon. Ensimmäisessä osatyössä tutkittiin useiden monikykyisien kantasolulinjojen hermosoluerilaistustehokkuutta, ja pyrittiin selvittämään systemaattisia eroja alkion kantasolujen ja indusoitujen monikykyisien kantasolujen välillä. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet että huolimatta näiden solutyyppien samankaltaisuudesta, niiden alkuperästä johtuvat geneettiset eroavaisuudet saattavat vaikuttaa solujen erilaistumistehokkuuteen. Tulokset osoittivat että solulinjojen välillä on selvästi linjakohtaisia eroja erilaistumistehokkuudessa. Vaihtelua on kuitenkin huomattavasti enemmän yksittäisten solulinjojen kuin eri lähteistä peräisin olevien monikykyisien kantasolutyyppien välillä.
Seuraavaksi monikykyisten kantasolujen erilaistusta pyrittiin ohjaamaan kemiallisella induktiolla tarkasti määritellyissä kasvatusolosuhteissa. Erilaisia kasvutekijöitä käytettiin tarkoin ajoitettuna suuntaamaan solujen erilaistumista ensin keskushermoston esiastesoluiksi ja myöhemmin oligodendrosyyttien esiastesoluiksi ja oligodendrosyyteiksi. Menetelmällä saavutettiin oligodendrosyyttien esiastesolujen tehokas erilaistuminen, mutta solujen kypsymistä oligodendrosyyteiksi pitäisi edelleen vakauttaa ja tehostaa. Solujen kohdennettu erilaistus tapahtui ilman eläinperäisiä tekijöitä sisältäviä yhdisteitä, mikä mahdollistaa tällä menetelmällä tuotettujen solujen käytön kliinisissä sovelluksissa. Erilaistusmenetelmästä muokattiin myös kustannustehokkaampi, tutkimustasoinen menetelmä.
Soluväliaineen molekyylien vaikutusta monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen hermosolujen ja astrosyyttien käyttäytymiseen ja kehitykseen in vitro tutkittiin useilla laminiini-molekyylin isoformeilla. Soluväliaine on solunulkoinen matriisi, joka tukee solujen erilaistumista, kasvua, ja kehitystä sekä rakenteellisesti että kemiallisesti. Tulokset osoittivat että sekä hermosolut että astrosyytit kiinnittyvät ja kasvavat parhaiten pinnoitteilla, jotka sisältävät laminiinin α5-ketjurakenteen. Nämä pinnoitteet myös tehostivat hermosolujen verkostotason toiminnallista kehitystä. Tässä työssä käytetyt pinnoitteet ovat myös kliiniseen käyttöön sopivia, ja niitä voidaan hyödyntää monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen keskushermoston solujen tuottoon kudosteknologisia sovelluksia varten.
Lopuksi kasvatusolosuhteiden mekaanisen muokkauksen vaikutusta tutkittiin monikykyisistä kantasoluista erilaistetuilla hermosoluilla, astrosyyteillä, ja oligodendrosyyttien esiastesoluilla. Soluja kasvatettiin nanokuitupinnoilla, joiden topografia vastaa selkäytimen solujen suuntautumista in vivo. Nanokuitujen havaittiin vaikuttavan kaikkien solutyyppien kasvuun, ja solujen nähtiin suuntautuvan kasvatusalustan nanokuitujen mukaisesti. Pelkät nanokuidut eivät tukeneet hermosolujen ja astrosyyttien kasvua, mutta kun kuitujen pinta käsiteltiin aiemmin tutkituilla α5-ketjurakenteen sisältävillä laminiini-pinnoitteilla, molempien solutyyppien kasvua voitiin huomattavasti parantaa. Lisäksi osoitettiin, että monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen hermosolujen kasvua voidaan ohjata nanokuiduilla myös hydrogeelipohjaisessa 3D-ympäristössä, joka vastaa in vivo kasvuolosuhteita keskushermostossa paremmin kuin 2D pinta.
Tämän väitöskirjan tulokset tuovat merkittävää lisätietoa ihmisen monikykyisistä kantasoluista erilaistettujen keskushermoston solujen in vitro –kasvatuksesta. Tulokset ovat hyödynnettävissä kudosteknologisissa sovelluksissa sillä yhdistämällä ihmisperäisiä keskushermoston tärkeimpiä solutyyppejä, kliiniseen käyttöön sopivia kasvatuspinnoitteita, hydrogeelistä koostuva 3D ympäristö ja nanokuitujen ohjaava vaikutus voidaan edistää toiminnallisen solusiirteen kehitystä selkäydinvaurion hoitoon.Human pluripotent stem cells (hPSCs) are capable of self-renewal and differentiation into any cell type found in the human body. hPSCs include embryonic stem cells (ECSs), which are derived from the embryonic inner cell mass, as well as induced pluripotent stem cells (IPSCs), derived from somatic cells with specific transcription factors to induce pluripotency. hPSCs can be efficiently directed to differentiate into the main cell types of the central nervous system (CNS), neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. hPSC-derived neural cells provide an excellent approach to model CNS development and deficits in vitro and furthermore treat injuries and degenerative conditions by replacing damaged tissues. Spinal cord injury (SCI) describes damage to the spinal cord that leads to the loss of muscle function, sensation, or autonomic functions to different extents. CNS cells have limited capacity for regeneration, and cell replacement therapies have been extensively studied for SCI repair, as no efficient treatment for SCI currently exists.
This thesis focused on studying various aspects, including genetic background and chemical and mechanical inductions, of hPSC-derived neural cell differentiation and behavior in vitro. The results were aimed to be applicable for developing tissue engineering products for SCI repair. First, the neural differentiation potentials of several hPSC lines were compared in vitro in order to discover the presence of potential systematic differences between hESCs and hIPSCs. Previous studies have demonstrated that despite their considerable resemblance, the different genetic backgrounds of hESCs and hIPSCs may reflect to their differentiation potential. Our results revealed cell line-specific variations in neural differentiation efficiency. However, the variation between individual hESC and hIPSC lines was higher than the variation between cell lines of different origins, indicating the lack of systematic differences between the two hPSC types.
Next, chemical induction was studied for the differentiation of hPSC-derived oligodendrocytes. A variety of growth factors and morphogens were used in a temporally defined manner to direct the differentiation through the neural precursor cell stage into oligodendrocyte precursor cells (OPCs), and finally to maturing oligodendrocytes. Although efficient differentiation of OPCs was achieved, the maturation of the cells into oligodendrocytes should be further stabilized and enhanced. The differentiation process was initially performed under xeno-free and defined culture conditions, enabling clinical applications of the produced cells. The protocol was also adapted into a more cost-effective research-grade method.
Cellular responses to different extracellular matrix (ECM) molecules in vitro was studied with hPSC-derived neurons and astrocytes. ECM is found at the intercellular space in vivo and it provides both structural support and chemical cues for cell survival, differentiation, migration, and growth. Neurons and astrocytes were cultured on defined ECM substrates using different isoforms or fragments of laminin molecule. hPSC-derived neurons and astrocytes were shown to attach and grow most efficiently on substrates containing laminin α5-chain. These substrates also enhanced the functional development of neuronal networks. The studied substrates were both defined and xeno-free and thus can be used as platforms for the efficient production of clinical-grade neural cells from hPSCs.
Finally, the effects of mechanical alterations in the culture conditions were studied with hPSC-derived neurons, astrocytes, and OPCs. The cells were cultured on aligned nanofiber platforms mimicking the aligned cellular orientation in the spinal cord. All cell types were found to orient according to the underlying fiber alignment. However, ECM protein-coating for the nanofibers was required for efficient growth of the neurons and astrocytes, and previously identified laminin α5-chain substrates were successfully applied here. As the 3D cultures resemble in vivo conditions more accurately than traditional 2D culturing surfaces, orientation guidance of hPSC-derived neurons was also demonstrated in 3D culture conditions consisting of nanofiber platform and hydrogel component.
In conclusion, the results of this thesis provide new insights for the culturing of hPSC-derived neural cells in vitro. These results can be utilized for tissue engineering applications, as combination of hPSC-derived CNS cells, clinically relevant ECM substrates, 3D environment of the hydrogel and guiding features of the nanofibers would be beneficial for the development of functional cell grafts for SCI repair
