ABC transzporterek vizsgálata emberi őssejtekben és a sejt-differenciálódás során = Expression and function of ABC transporters in human stem cells and during cell differentiation

A projektben az ABC (ATP-Binding Cassette) transzporterek kifejeződését és funkcióját vizsgáltuk emberi őssejtekben, valamint követtük a normális és daganatos sejtdifferenciálódás során bekövetkező molekuláris szintű változásokat. Elsősorban a gyógyszerek hatásában, anyagcseréjében, az ellenük kifejeződő rezisztenciában szereplő transzportereket, valamint a sejtmembrán lipid-anyagcseréjében szerepet játszó ABC transzportereket vizsgáltuk. A projekt fontos része volt az emberi embrionális őssejtek speciális tenyésztési és differenciálási módszereinek adaptálása, továbbfejlesztése. Az ABC transzporterek vizsgálata során igazoltuk, hogy a humán embrionális őssejtekben az ABCG2 a legjelentősebb xenobiotikum transzporter, a korai sejtdifferenciálódás során az ABCG2 kifejeződése először emelkedik, majd jelentősen csökken. Megállapítottuk, hogy az ABCG2 mRNS használata különbözik a tumorsejtekben, a differenciálódott szöveti sejtekben, illetve a nem-differenciálódott őssejtekben. Új, transzpozon-alapú módszereket dolgoztunk ki az őssejtek stabil genetikai módosítására, fluoreszcens riporter fehérjék bevitelére. Az ABCG2 és az ABCA1 fehérjék címkézett változatainak kifejezése lehetővé tette a transzporterek sejten belüli lokalizációjának követését. Részletesen elemeztük az ABCG2 multidrog transzporter szerkezet-funkció összefüggéseit, szubsztrátokkal jelentkező kölcsönhatásait, alkalmazásokat fejlesztettünk ki a gyógyszerhatások vizsgálatára. | In this project we have studied the expression and function of ABC (ATP-Binding Cassette) transporters in human embryonic and tumor stem cells and followed the changes during normal and tumor cell differentiation at a molecular level. We have focused on the investigation of ABC transporters involved in drug metabolism, cancer multidrug resistance and cellular lipid metabolism. An important part of the project was to establish and further develop proper laboratory conditions and methodologies for culturing and differentiating human pluripotent stem cells. When studying human ABC transporters in human embryonic stem cells we demonstrated the major role of the ABCG2 protein. We found that the expression of this transporter first increases, then greatly decreases during early stem cell differentiation. The use of mRNA was found to be different in the tumor cells, differentiated cells, and pluripotent stem cells, respectively. We have developed new, transposon-based methods for the stable genetic modification of pluripotent stem cells and for the expression of fluorescent reporter proteins. By using tagged versions of the ABCG2 and ABCA1 proteins we could follow the intracellular localization of these transporters. We have studied in detail the structure-function relationships and substrate interactions of the ABCG2 transporter and developed new assays for studying drug interactions

A new fluorescent dye accumulation assay for parallel measurements of the ABCG2, ABCB1 and ABCC1 multidrug transporter functions

ABC multidrug transporters are key players in cancer multidrug resistance and in general xenobiotic elimination, thus their functional assays provide important tools for research and diagnostic applications. In this study we have examined the potential interactions of three key human ABC multidrug transporters with PhenGreen diacetate (PGD), a cell permeable fluorescent metal ion indicator. The non-fluorescent, hydrophobic PGD rapidly enters the cells and, after cleavage by cellular esterases, in the absence of quenching metal ions, PhenGreen (PG) becomes highly fluorescent. We found that in cells expressing functional ABCG2, ABCB1, or ABCC1 transporters, cellular PG fluorescence is strongly reduced. This fluorescence signal in the presence of specific transporter inhibitors is increased to the fluorescence levels in the control cells. Thus the PG accumulation assay is a new, unique tool for the parallel determination of the function of the ABCG2, ABCB1, and ABCC1 multidrug transporters. Since PG has very low cellular toxicity, the PG accumulation assay also allows the selection, separation and culturing of selected cell populations expressing either of these transporters

A humán ABCG2 multidrog transzporter működésének vizsgálata = Investigation of the mechanism of action of the human ABCG2 multidrug transporter

A humán ABCG2 egy plazma membrán glikoprotein, amely a szervezet méregtelenítésében játszik szerepet, ezen kívül ellenállóvá teheti a rákos sejteket bizonyos gyógyszerekkel szemben. Az ABCG2 az őssejtek egyik jellegzetes fehérjéje. Jelen kutatás során a következő főbb eredményeket értük el: 1. Változatos szubsztrát specificitással és transzport aktivitással bíró mutáns változatokat hoztunk létre a vad-típustól mindössze a 482-es aminosav pozícióban eltérő ABCG2 mutánsok előállításával, amelyek hasznosíthatók lehetnek például terápiás sejtek védelmében. 2. Igazoltuk, hogy az ABCG2-Q141K polimorfizmus csökkent aktivitással bír, ezért az ezt a változatot hordozó egyedek bizonyos gyógyszerekkel szemben érzékenyebbek lehetnek. 3. Kimutattuk, hogy az ABCG2 kölcsönhatásba lép egyes, a klinikumban használt tirozin kináz gátló gyógyszerekkel, tehát befolyásolhatja ezek hatékonyságát a kemoterápia során. 4. Elvégeztük egy ABCG2-specifikus antitest jellemzését, amely hasznosítható lehet tumoros mintákban lévő ABCG2 kimutatására, vagy akár őssejtek kiválogatására. 5. Kimutattuk, hogy a membrán koleszterin tartalma befolyásolja az ABCG2 transzporter aktivitását, tehát a fehérje működése különböző membrán kompartmentekbe történő lokalizációja illetve internalizációja által szabályozódhat. 6. Fluoreszcens ?címkével? ellátott ABCG2 fehérjét hoztunk létre, amellyel pl. ABCG2 szubsztrátok tesztelhetők élő sejtekben vagy lokalizációs vizsgálatok végezhetők. | Human ABCG2 is a plasma membrane glycoprotein that protects our body against toxic compounds. ABCG2 is also able to confer resistance against several drugs used in cancer chemotherapy. ABCG2 is a marker protein of stem cells. The main findings of our research are the following: 1) We have generated ABCG2 mutants having altered substrate specificity and transport activity by inducing single amino acid change at position 482. These mutants are ideal candidates to be used for protection of modified cells in medical gene therapy. 2) We have shown that the Q141K polymorphism of ABCG2 has decreased activity, therefore may result in altered pharmacokinetics of ABCG2 substrates and increase chemosensitivity in clinical oncology. 3) We have demonstrated that ABCG2 interacts with several clinically relevant tyrosine kinase inhibitors; therefore this protein may influence their effectiveness. 4) We have characterised an ABCG2-specific antibody that can be an important tool in detection of ABCG2 in clinical samples or in stem cell research. 5) We have shown that membrane cholesterol level influences the activity of ABCG2, therefore the localisation of ABCG2 e.g. in cholesterol rich rafts may have major impact on the activity of this transporter. 6) We have generated a cell line expressing functionally active, green fluorescence protein tagged ABCG2 that may be a useful tool for e.g. localisation studies or drug-screening in living cells

ABCC6 is a basolateral plasma membrane protein

RATIONALE:: ABCC6 plays a crucial role in ectopic calcification; mutations of the gene cause pseudoxanthoma elasticum and general arterial calcification of infancy. To elucidate the role of ABCC6 in cellular physiology and disease, it is crucial to establish the exact subcellular localization of the native ABCC6 protein. OBJECTIVE:: In a recent article in Circulation Research, ABCC6 was reported to localize to the mitochondria-associated membrane and not the plasma membrane. As the suggested mitochondrial localization is inconsistent with published data and the presumed role of ABCC6, we performed experiments to determine the cellular localization of ABCC6 in its physiological environment. METHODS AND RESULTS:: We performed immunofluorescent labeling of frozen mouse and human liver sections, as well as primary hepatocytes. We used several different antibodies recognizing human and mouse ABCC6. Our results unequivocally show that ABCC6 is in the basolateral membrane of hepatocytes and is not associated with the mitochondria, mitochondria-associated membrane, or the endoplasmic reticulum. CONCLUSIONS:: Our findings support the model that ABCC6 is in the basolateral membrane, mediating the sinusoidal efflux of a metabolite from the hepatocytes to systemic circulation. © 2013 American Heart Association, Inc

ABC TRANSZPORTEREK ÚTON ÚTFÉLEN

A különböző ABC transzporterek igen fontos szerepet látnak el a szervezet határ- felületei anyagforgalmának szabályozásában. Ezek az élettani határolók polari- zált sejtekből állnak, melyek szoros sejtkapcsolattal kapcsolódnak egymáshoz, megakadályozva az anyagok szabad áramlását. A polarizált sejtekben megfelelő rend szerint helyezkednek el a transzporter fehérjék, és funkciójuk révén megha- tározzák a különböző anyagok áthaladását a határfelületeken. Kutatásainkban arra keresünk választ, hogy az egyes ABC transzporterek milyen úton kerülnek el a feladatuk ellátásához szükséges cél-kompartmentbe, milyen tényezők ha- tározzák meg ott a sorsukat, és milyen szabályozó mechanizmusok működtetik a transzporter fehérjék sejten belüli vándorlását. Munkánk során elsősorban a májat alkotó poláris sejtekre: hepatocitákra és epevezetéksejtekre összponto- sítjuk figyelmünket, de reményeink szerint ezekkel a vizsgálatokkal általánosabb érvényű összefüggésekre tudunk majd fény deríteni

Az ABCA1 membránfehérje funkciójának és fehérje-kölcsönhatásainak vizsgálata = Investigation of the function and protein interactions of the ABCA1 membrane protein

A kutatás célja az ABCA1 membránfehérje működésének és fehérje-kölcsönhatásainak jellemzése volt. Új modellrendszereket alakítottunk ki Sf9 rovarsejt-bakulovírus és retrovirális expressziós rendszerek segítségével, részletesen vizsgáltuk a vad-típusú és mutáns ABCA1 fehérjék sejten belüli lokalizációját, működését és PDZ fehérjékkel való kölcsönhatását. Bizonyítottuk, hogy az ABCA1 fehérje mind az ApoA1-függő koleszterin kiáramlás, mind a Ca2+-aktivált sejtfelszíni foszfatidilszerin expozíció folyamatában fontos szerepet játszik. Elsőként mutattunk ki összefüggést egy vérzékenységi betegség és az ABCA1 működése között. Elemeztük az ABCA1 mutációnak hatását a betegségre jellemző hibás foszfatidilszerin expozícióban. Vizsgáltuk a lipidanyagcserére ható vegyületek hatását az ABCA1-hez köthető funkciókra, azonosítottunk két új gátló vegyületet. Megállapítottuk, hogy egy speciális PDZ fehérje a vizsgált ABC fehérjék közül egyedül az ABCA1 fehérjével lép kölcsönhatásba, más ABC transzporterekhez kötő egyéb PDZ fehérjék nem kötődtek az ABCA1-hez. Kimutattuk polarizált sejtekben az ABCA1, a b2-syntrophin és az utrophin bazolaterális ko-lokalizációját. A kidolgozott mérési módszereket más ABC transzporterek működésének vizsgálatára is eredményesen alkalmaztuk. Megkezdtük a foszfolipid-transzportért felelős ABC fehérjék azonosítását trombocitákban. | The aims of this project were the functional characterization of the ABCA1 protein and identification of its potential interactions with intracellular proteins. We installed new assay systems to analyse the function, subcellular localization and protein interactions of the wild-type and mutant ABCA1 versions, by using two expression systems: the baculovirus-Sf9 insect cell system and retrovirus based expression system for mammalian cells. We proved that ABCA1 plays a key role both in cellular ApoAI-mediated cholesterol removal pathway, and in the exofacial translocation of phosphatidylserine. Our results provided the first link between a defect in a transbilayer phospholipid transport pathway, that of ABCA1, and the bleeding phenotype. We analysed the effects of various mutations of ABCA1 on the Ca2+-stimulated PS exposition. We screened the influence of potential inhibitors on the ABCA1-dependent processes and identified new inhibitors of the PS exposition. We demonstrated that among the examined ABC transporters only ABCA1 binds b2-syntrophin. A diverse group of PDZ proteins that interacts with other ABC proteins does not bind to ABCA1. We showed basolateral colocalization of ABCA1 protein with b2-syntrophin and utrophin. The assays for ABCA1 characterization were applied for studying other ABC proteins successfully. We started the identification of ABC proteins involved in phospholipid translocation in platelets

Activation of the P2Y2 receptor regulates bone cell function by enhancing ATP release

Bone cells constitutively release ATP into the extracellular environment where it acts locally via P2 receptors to regulate bone cell function. Whilst P2Y2 receptor stimulation regulates bone mineralisation, the functional effects of this receptor in osteoclasts remain unknown. This investigation used the P2Y2 receptor knockout (P2Y2R−/−) mouse model to investigate the role of this receptor in bone. MicroCT analysis of P2Y2R−/− mice demonstrated age-related increases in trabecular bone volume (≤48%), number (≤30%) and thickness (≤17%). In vitro P2Y2R−/− osteoblasts displayed a 3-fold increase in bone formation and alkaline phosphatase activity, whilst P2Y2R−/− osteoclasts exhibited a 65% reduction in resorptive activity. Serum cross-linked C-telopeptide levels (CTX, resorption marker) were also decreased (≤35%). The resorption defect in P2Y2R−/− osteoclasts was rescued by the addition of exogenous ATP, suggesting that an ATP deficit could be a key factor in the reduced function of these cells. In agreement, we found that basal ATP release was reduced up to 53% in P2Y2R−/− osteoclasts. The P2Y2 receptor agonists, UTP and 2-thioUTP, increased osteoclast activity and ATP release in wild-type but not in P2Y2R−/− cells. This indicates that the P2Y2 receptor may regulate osteoclast function indirectly by promoting ATP release. UTP and 2-thioUTP also stimulate ATP release from osteoblasts suggesting that the P2Y2 receptor exerts a similar function in these cells. Taken together, our findings are consistent with the notion that the primary action of P2Y2 receptor signalling in bone is to regulate extracellular ATP levels

Activation of multidrug efflux transporter activity at fertilization in sea urchin embryos (Strongylocentrotus purpuratus)

AbstractThis study presents functional and molecular evidence for acquisition of multidrug transporter-mediated efflux activity as a consequence of fertilization in the sea urchin. Sea urchin eggs and embryos express low levels of efflux transporter genes with homology to the multidrug resistance associated protein (mrp) and permeability glycoprotein (p-gp) families of ABC transporters. The corresponding efflux activity is low in unfertilized eggs but is dramatically upregulated within 25 min of fertilization; the expression of this activity does not involve de novo gene expression and is insensitive to inhibitors of transcription and translation indicating activation of pre-existing transporter protein. Our study, using specific inhibitors of efflux transporters, indicates that the major activity is from one or more mrp-like transporters. The expression of activity at fertilization requires microfilaments, suggesting that the transporters are in vesicles and moved to the surface after fertilization. Pharmacological inhibition of mrp-mediated efflux activity with MK571 sensitizes embryos to the toxic compound vinblastine, confirming that one role for the efflux transport activity is embryo protection from xenobiotics. In addition, inhibition of mrp activity with MK571 alone retards mitosis indicating that mrp-like activity may also be required for early cell divisions

Reliable transgene-independent method for determining Sleeping Beauty transposon copy numbers

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>The transposon-based gene delivery technique is emerging as a method of choice for gene therapy. The <it>Sleeping Beauty </it>(SB) system has become one of the most favored methods, because of its efficiency and its random integration profile. Copy-number determination of the delivered transgene is a crucial task, but a universal method for measuring this is lacking. In this paper, we show that a real-time quantitative PCR-based, transgene-independent (qPCR-TI) method is able to determine SB transposon copy numbers regardless of the genetic cargo.</p> <p>Results</p> <p>We designed a specific PCR assay to amplify the left inverted repeat-direct repeat region of SB, and used it together with the single-copy control gene <it>RPPH1 </it>and a reference genomic DNA of known copy number. The qPCR-TI method allowed rapid and accurate determination of SB transposon copy numbers in various cell types, including human embryonic stem cells. We also found that this sensitive, rapid, highly reproducible and non-radioactive method is just as accurate and reliable as the widely used blotting techniques or the transposon display method. Because the assay is specific for the inverted repeat region of the transposon, it could be used in any system where the SB transposon is the genetic vehicle.</p> <p>Conclusions</p> <p>We have developed a transgene-independent method to determine copy numbers of transgenes delivered by the SB transposon system. The technique is based on a quantitative real-time PCR detection method, offering a sensitive, non-radioactive, rapid and accurate approach, which has a potential to be used for gene therapy.</p

Characterization of new, efficient Mycobacterium tuberculosis topoisomerase-I inhibitors and their interaction with human ABC multidrug transporters

Drug resistant tuberculosis (TB) is a major worldwide health problem. In addition to the bacterial mechanisms, human drug transporters limiting the cellular accumulation and the pharmacological disposition of drugs also influence the efficacy of treatment. Mycobacterium tuberculosis topoisomerase-I (MtTopo-I) is a promising target for antimicrobial treatment. In our previous work we have identified several hit compounds targeting the MtTopo-I by in silico docking. Here we expand the scope of the compounds around three scaffolds associated with potent MtTopo-I inhibition. In addition to measuring the effect of newly generated compounds on MtTopo-I activity, we characterized the compounds' antimicrobial activity, toxicity in human cells, and interactions with human multidrug transporters. Some of the newly developed MtTopo-I inhibitors have strong antimicrobial activity and do not harm mammalian cells. Moreover, our studies revealed significant human ABC drug transporter interactions for several MtTopo-I compounds that may modify their ADME-Tox parameters and cellular effects. Promising new drug candidates may be selected based on these studies for further anti-TB drug development