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A DNA-Free Editing Platform for Genetic Screens in Soybean via CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Delivery
Get PDFCRISPR/Cas9-based ribonucleoprotein (RNP)-mediated system has the property of minimizing the effects related to the unwanted introduction of vector DNA and random integration of recombinant DNA. Here, we describe a platform based on the direct delivery of Cas9 RNPs to soybean protoplasts for genetic screens in knockout gene-edited soybean lines without the transfection of DNA vectors. The platform is based on the isolation of soybean protoplasts and delivery of Cas RNP complex. To empirically test our platform, we have chosen a model gene from the soybean genetic toolbox. We have used five different guide RNA (gRNA) sequences that targeted the constitutive pathogen response 5 (CPR5) gene associated with the growth of trichomes in soybean. In addition, efficient protoplast transformation, concentration, and ratio of Cas9 and gRNAs were optimized for soybean for the first time. Targeted mutagenesis insertion and deletion frequency and sequences were analyzed using both Sanger and targeted deep sequencing strategies. We were able to identify different mutation patterns within insertions and deletions (InDels) between + 5 nt and –30 bp and mutation frequency ranging from 4.2 to 18.1% in the GmCPR5 locus. Our results showed that DNA-free delivery of Cas9 complexes to protoplasts is a useful approach to perform early-stage genetic screens and anticipated analysis of Cas9 activity in soybeans.publishedVersio
FOODPRINT: Rastreabilidade e rotulagem de produtos geneticamente editados na cadeia alimentar
No full textSeminário de Iniciação Científica e Tecnológica.
Universidade Federal de Santa Catarina.
Centro de Ciências Agrárias. Departamento de Fitotecnia.Desde a domesticação das espécies até o melhoramento genético com auxílio de ferramentas moleculares, os seres humanos selecionaram os genótipos existentes para gerar variedades vegetais elite para fins agrícolas e alimentares. Com o advento do DNA recombinante, no entanto, foi possível inserir sequências de DNA desejadas no genoma da espécie hospedeira. Assim, rompendo as barreiras sexuais das plantas e inclusive inserindo sequências não existentes na natureza. Mais recentemente, com o avanço biotecnológico, é possível (1) modificar genes-alvo in vivo, e não apenas in vitro, seguido de reintrodução; (2) aumentar a eficiência da introdução da modificação pretendida em um local desejado e (3) aumentar a gama de organismos nos quais as duas primeiras possibilidades podem ser alcançadas. CRISPR é o sistema de manipulação genética que está se tornando muito popular nos dias de hoje devido ao seu fácil design. As aplicações potenciais dessas nucleases sintéticas vão muito além de pequenas mutações. Tais ferramentas já encontram usos em vários tipos de modificações mais abrangentes do genoma (ou mesmo a construção de genomas artificiais). Ainda, a modificação genética por meio de ácidos nucleicos recombinantes gerou requisitos legais de rotulagem e rastreabilidade na cadeia alimentar devido à falta de “histórico de uso seguro”. No entanto, modificações genéticas oriundas da edição de genoma não possuem metodologias e protocolos validados para implementação e execução da legislação. Assim, este projeto tem como objetivo o desenvolvimento de uma metodologia inovadora e flexível para detecção e identificação de organismos geneticamente editados contendo pequenas alterações na sequência de DNA. Especificamente, esta fase visa desenvolver marcadores moleculares de identificação e quantificação de fragmentos de DNA contendo polimorfismos de sítio único (do inglês, single nucleotide polimorfismo – SNP) presentes no gene alvo da modificação e também em outras regiões do genoma da planta (sítios off-target) para fins de diferenciação entre plantas modificadas e plantas convencionais
FoodPrint- Rastreabilidade e rotulagem de produtos editados geneticamente na cadeia alimentar (Fase 2)
No full textSeminário de Iniciação Científica e Tecnológica
Universidade Federal de Santa Catarina
Centro de Ciências Agrárias
AgronomiaDesde a domesticação das espécies até o melhoramento genético com auxílio de
ferramentas moleculares, os seres humanos selecionaram os genótipos existentes para gerar
variedades vegetais elite para fins agrícolas e alimentares. Com o advento do DNA
recombinante, no entanto, foi possível inserir sequências de DNA desejadas no genoma da
espécie hospedeira. Um dos sistemas de manipulação genética que vem ganhando espaço é o
CRISPR, devido ao seu fácil design e praticidade. As aplicações potenciais dessas tecnologias de
nucleases sintéticas superam o cenário de pequenas mutações, podendo ser aplicadas em
modificações mais abrangentes do genoma (ou mesmo a construção de genomas artificiais).
Ainda, a modificação genética por meio de ácidos nucleicos recombinantes gerou
preocupações quanto a seus requisitos legais de rotulagem e rastreabilidade na cadeia
alimentar devido à falta de ‘histórico de uso seguro’ e os possíveis efeitos não previstos. Esta
fase do projeto “FOODPRINT” visa desenvolver metodologias inovadoras e flexíveis para
detecção e identificação de organismos geneticamente editados, visto que modificações
genéticas provindas de edição de genomas não possuem protocolos validados para
implementação de legislação. Nesse experimento, foram utilizadas como modelo as espécies
vegetais Glycine max e Arabdopsis thaliana para o desenvolvimento dos protocolos. As
atividades do primeiro semestre, referentes ao desenvolvimento e aplicação da metodologia
para isolamento e edição de protoplastos de soja, se mostrou eficiente, resultando em taxas
de edição de 4.2% e 14.3%. As atividades do segundo semestre, referentes ao estabelecimento
de parâmetros e de três abordagens para os ensaios de PCR tempo real com Arabdopsis
thaliana deverão ser testados e validados nos próximos meses, sendo futuramente
submetidos à ENGL para apreciação como um novo método verificado. Os resultados também
serão parte de artigo a ser elaborado e submetido para publicação
