Die Rolle von Oxa1 bei der Biogenese mitochondrialer Carrier

Oxa1 ist ein integrales Protein der mitochondrialen Innenmembran und eine zentrale Komponente der Proteininsertionsmaschinerie in Mitochondrien. Oxa1 ist an der Insertion zweier unterschiedlicher Klassen von Proteinen in die Innenmembran beteiligt: Durch eine C-terminale, matrixständige Domäne interagiert Oxa1 mit mitochondrialen Ribosomen und vermittelt so die ko-translationale Membraninsertion mitochondrial kodierter Proteine. Darüber hinaus wurde auch eine Beteiligung von Oxa1 an der Insertion einiger kernkodierter Proteine beschrieben. Bei allen bisher identifizierten kernkodierten Substraten von Oxa1 handelt es sich um sogenannte konservativ sortierte Proteine, die nach ihrer Synthese im Zytosol zunächst klassisch über die Translokasen der mitochondrialen Außen- und Innenmembran in die mitochondriale Matrix importiert werden. In einem Oxa1-vermittelten Schritt werden sie schließlich von der Matrix aus in die Innenmembran inseriert. Vergleiche mit dem bakteriellen Oxa1-Homolog YidC lassen weiterhin vermuten, dass Oxa1 auch an der Faltung von Membranproteinen beteiligt sein könnte, bisher ist eine solche Oxa1-Funktion jedoch nur in Einzelfällen beschrieben worden. Der genaue molekulare Mechanismus der Proteininsertion durch Oxa1 sowie eine eventuelle Be- teiligung von Oxa1 an der Insertion anderer mitochondrialer Innenmembranproteine ist bisher unklar. Es war daher uberraschend festzustellen, dass die Level des ADP/ATP-Carriers in Abwesenheit von Oxa1 stark reduziert waren. Der Import und die Membraninsertion mitochondrialer Carrier wurden in den vergangenen Jahren im Detail beschrieben, bisherige Studien deuteten jedoch nie auf eine Beteiligung von Oxa1 bei der Carrier-Biogenese hin. Carrier-Proteine werden, im Gegensatz zu konservativ sortierten Proteinen, aus dem Intermembranraum in die Innenmembran inseriert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Importversuche gezeigt werden, dass Oxa1 eine wichtige, wenn auch nicht essentielle Funktion bei der Biogenese verschiedener Vertreter der mitochondrialen Carrier-Familie einnimmt. Die erhaltenen Daten deuten darauf hin, dass Oxa1 nicht an der Membraninsertion der Carrier-Proteine per se beteiligt ist, sondern ahnlich einem Chaperon die TIM22-abh¨ ngig inserierten Carrier stabilisiert und ihre Faltung oder Assemblierung in der Membran begünstigt. Diese Arbeit zeigt somit, dass Oxa1 nicht nur an der Membraninsertion verschiedener mitochondrial und kernkodierter Proteine beteiligt ist, sondern eine weitere wichtige Funktion als Chaperon einnimmt. Bedeutend ist hierbei vor allem, dass diese Rolle bei der Stabilisierung und Faltung mitochondrialer Innenmembranproteine sich nicht auf klassische Oxa1-Substrate beschränkt, die von Seiten der Matrix in die Membran inseriert werden, sondern entscheidend die Biogenese von Proteinen beeinflusst, deren eigentliche Membraninsertion Oxa1- unabhängig verläuft. Die Bedeutung von Oxa1 bei der Insertion mitochondrial kodierter Proteine ist gut dokumentiert, genaue mechanistische Details des Prozesses der Membraninsertion durch Oxa1 fehlen jedoch bisher. Um den molekularen Mechanismus der Oxa1-vermittelten Proteininsertion besser zu verstehen, wurde die native Aufreinigung von rekombinant exprimiertem S. cerevisiae Oxa1 etabliert und gezeigt, dass dieses einen dimeren oder höher oligomeren Komplex ausbildet. Oxa1 wurde weiterhin erfolgreich in Proteoliposomen rekonstituiert und stimuliert in vitro die Insertion des mitochodrial kodierten Proteins Atp8. In dieser Arbeit wurden vorläufige Daten über die Oxa1-vermittelte Proteininsertion gesammelt. Das hier etablierte Rekonstitutionssystem wird eine wichtige Basis für zukünftige Arbeiten bilden, die zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Oxa1-abhängigen Proteininsertion beitragen werden

Genome Editing With TALEN, CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cas12a in Combination With AAV6 Homology Donor Restores T Cell Function for XLP

X-linked lymphoproliferative disease is a rare inherited immune disorder, caused by mutations or deletions in the SH2D1A gene that encodes an intracellular adapter protein SAP (Slam-associated protein). SAP is essential for mediating several key immune processes and the immune system - T cells in particular - are dysregulated in its absence. Patients present with a spectrum of clinical manifestations, including haemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH), dysgammaglobulinemia, lymphoma and autoimmunity. Treatment options are limited, and patients rarely survive to adulthood without an allogeneic haematopoietic stem cell transplant (HSCT). However, this procedure can have poor outcomes in the mismatched donor setting or in the presence of active HLH, leaving an unmet clinical need. Autologous haematopoeitic stem cell or T cell therapy may offer alternative treatment options, removing the need to find a suitable donor for HSCT and any risk of alloreactivity. SAP has a tightly controlled expression profile that a conventional lentiviral gene delivery platform may not be able to fully replicate. A gene editing approach could preserve more of the endogenous regulatory elements that govern SAP expression, potentially providing a more optimum therapy. Here, we assessed the ability of TALEN, CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cas12a nucleases to drive targeted insertion of SAP cDNA at the first exon of the SH2D1A locus using an adeno-associated virus serotype 6 (AAV6)-based vector containing the donor template. All nuclease platforms were capable of high efficiency gene editing, which was optimised using a serum-free AAV6 transduction protocol. We show that T cells from XLP patients corrected by gene editing tools have restored physiological levels of SAP gene expression and restore SAP-dependent immune functions, indicating a new therapeutic opportunity for XLP patients

Die Rolle von Oxa1 bei der Biogenese mitochondrialer Carrier

Oxa1 ist ein integrales Protein der mitochondrialen Innenmembran und eine zentrale Komponente der Proteininsertionsmaschinerie in Mitochondrien. Oxa1 ist an der Insertion zweier unterschiedlicher Klassen von Proteinen in die Innenmembran beteiligt: Durch eine C-terminale, matrixständige Domäne interagiert Oxa1 mit mitochondrialen Ribosomen und vermittelt so die ko-translationale Membraninsertion mitochondrial kodierter Proteine. Darüber hinaus wurde auch eine Beteiligung von Oxa1 an der Insertion einiger kernkodierter Proteine beschrieben. Bei allen bisher identifizierten kernkodierten Substraten von Oxa1 handelt es sich um sogenannte konservativ sortierte Proteine, die nach ihrer Synthese im Zytosol zunächst klassisch über die Translokasen der mitochondrialen Außen- und Innenmembran in die mitochondriale Matrix importiert werden. In einem Oxa1-vermittelten Schritt werden sie schließlich von der Matrix aus in die Innenmembran inseriert. Vergleiche mit dem bakteriellen Oxa1-Homolog YidC lassen weiterhin vermuten, dass Oxa1 auch an der Faltung von Membranproteinen beteiligt sein könnte, bisher ist eine solche Oxa1-Funktion jedoch nur in Einzelfällen beschrieben worden. Der genaue molekulare Mechanismus der Proteininsertion durch Oxa1 sowie eine eventuelle Be- teiligung von Oxa1 an der Insertion anderer mitochondrialer Innenmembranproteine ist bisher unklar. Es war daher uberraschend festzustellen, dass die Level des ADP/ATP-Carriers in Abwesenheit von Oxa1 stark reduziert waren. Der Import und die Membraninsertion mitochondrialer Carrier wurden in den vergangenen Jahren im Detail beschrieben, bisherige Studien deuteten jedoch nie auf eine Beteiligung von Oxa1 bei der Carrier-Biogenese hin. Carrier-Proteine werden, im Gegensatz zu konservativ sortierten Proteinen, aus dem Intermembranraum in die Innenmembran inseriert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Importversuche gezeigt werden, dass Oxa1 eine wichtige, wenn auch nicht essentielle Funktion bei der Biogenese verschiedener Vertreter der mitochondrialen Carrier-Familie einnimmt. Die erhaltenen Daten deuten darauf hin, dass Oxa1 nicht an der Membraninsertion der Carrier-Proteine per se beteiligt ist, sondern ahnlich einem Chaperon die TIM22-abh¨ ngig inserierten Carrier stabilisiert und ihre Faltung oder Assemblierung in der Membran begünstigt. Diese Arbeit zeigt somit, dass Oxa1 nicht nur an der Membraninsertion verschiedener mitochondrial und kernkodierter Proteine beteiligt ist, sondern eine weitere wichtige Funktion als Chaperon einnimmt. Bedeutend ist hierbei vor allem, dass diese Rolle bei der Stabilisierung und Faltung mitochondrialer Innenmembranproteine sich nicht auf klassische Oxa1-Substrate beschränkt, die von Seiten der Matrix in die Membran inseriert werden, sondern entscheidend die Biogenese von Proteinen beeinflusst, deren eigentliche Membraninsertion Oxa1- unabhängig verläuft. Die Bedeutung von Oxa1 bei der Insertion mitochondrial kodierter Proteine ist gut dokumentiert, genaue mechanistische Details des Prozesses der Membraninsertion durch Oxa1 fehlen jedoch bisher. Um den molekularen Mechanismus der Oxa1-vermittelten Proteininsertion besser zu verstehen, wurde die native Aufreinigung von rekombinant exprimiertem S. cerevisiae Oxa1 etabliert und gezeigt, dass dieses einen dimeren oder höher oligomeren Komplex ausbildet. Oxa1 wurde weiterhin erfolgreich in Proteoliposomen rekonstituiert und stimuliert in vitro die Insertion des mitochodrial kodierten Proteins Atp8. In dieser Arbeit wurden vorläufige Daten über die Oxa1-vermittelte Proteininsertion gesammelt. Das hier etablierte Rekonstitutionssystem wird eine wichtige Basis für zukünftige Arbeiten bilden, die zum Verständnis der molekularen Mechanismen der Oxa1-abhängigen Proteininsertion beitragen werden

The signal peptide of the mouse mammary tumor virus Rem protein is released from the endoplasmic reticulum membrane and accumulates in nucleoli.

N-terminal signal sequences mediate endoplasmic reticulum (ER) targeting and insertion of nascent secretory and membrane proteins and are, in most cases, cleaved off by signal peptidase. The mouse mammary tumor virus envelope protein and its alternative splice variant Rem have an unusually long signal sequence, which contains a nuclear localization signal. Although the envelope protein is targeted to the ER, inserted, and glycosylated, Rem has been described as a nuclear protein. Rem as well as a truncated version identical to the cleaved signal sequence have been shown to function as nuclear export factors for intron-containing transcripts. Using transiently transfected cells, we found that Rem is targeted to the ER, where the C-terminal portion is translocated and glycosylated. The signal sequence is cleaved off and accumulates in nucleoli. In a cell-free in vitro system, the generation of the Rem signal peptide depends on the presence of microsomal membranes. In vitro and in cells, the signal peptide initially accumulates in the membrane and is subsequently released into the cytosol. This release does not depend on processing by signal peptide peptidase, an intramembrane cleaving protease that can mediate the liberation of signal peptide fragments from the ER membrane. Our study suggests a novel pathway by which a signal peptide can be released from the ER membrane to fulfill a post-targeting function in a different compartment

Preclinical Evaluation of a Novel TALEN Targeting CCR5 Confirms Efficacy and Safety in Conferring Resistance to HIV-1 Infection

Therapies to treat patients infected with human immunodeficiency virus (HIV) aim at preventing viral replication but fail to eliminate the virus. Although transplantation of allogeneic CCR5Δ32 homozygous stem cell grafts provided a cure for a few patients, this approach is not considered a general therapeutic strategy because of potential side effects. Conversely, gene editing to disrupt the C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) locus, which encodes the major HIV coreceptor, has shown to confer resistance to CCR5-tropic HIV strains. Here, an engineered transcription activator-like effector nuclease (TALEN) that enables efficient CCR5 editing in hematopoietic cells is presented. After transferring TALEN-encoding mRNA into primary CD4+ T cells, up to 89% of CCR5 alleles are disrupted. Genotyping confirms the genetic stability of the CCR5-edited cells, and genome-wide off-target analyses established the absence of relevant mutagenic events. When challenging the edited T cells with CCR5-tropic HIV, protection in a dose-dependent manner is observed. Functional assessments reveal no significant differences between edited and control cells in terms of proliferation and their ability to secrete cytokines upon exogenous stimuli. In conclusion, a highly active and specific TALEN to disrupt CCR5 is successfully engineered, paving the way for its clinical application in hematopoietic stem cell grafts