Renaturation of recombinant mistletoe lectin I from inclusion bodies

Die vorliegende Arbeit behandelt die Optimierung der Renaturierung von rekombinantem Mistellektin I (rML) aus bakteriell produzierten Inclusion Bodies, sowie die Aufnahme der Renaturierungskinetik und deren Modellierung. Die mit steigender Proteinkonzentration verstärkt einsetzende Aggregation während der Renaturierung stellt einen limitierenden Faktor für die Generierung von biologisch aktivem rML dar. Niedermolekulare Faltungshelfer, wie z.B. Arginin, können zwar die Proteinlöslichkeit erhöhen, führen aber zu einer verringerten Ausbildung des rML Heterodimers. Als wichtige Parameter, die die Renaturierung von rML beeinflussen wurden das Redoxsystem, die Temperatur, der pH- Wert, sowie die Art und Weise der Proteinzugabe in den Rückfaltungspuffer identifiziert. Es lassen sich unter optimierten Bedingungen Konzentrationen von bis zu 4,5 µg/mL renaturiertem rML bei einer eingesetzten Gesamtproteinkonzentration von 20 µg/mL erreichen. Das Redoxpotential spielt im Rückfaltungsprozess die wichtigste Rolle, nur in einem sehr engen Redoxbereich erfolgt die Bildung des heterodimeren disulfidverbrückten Mistellektin I. Durch die Aufnahme der Renaturierungskinetik konnte ein vereinfachtes Modell erstellt werden und so Aussagen über den Faltungsweg getroffen werden. Dabei ergab sich, dass die Bildung der korrekt gefalteten rMLB-Kette den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in der Renaturierung des rML darstellt, aber auch die Assoziation beider Ketten erfolgt langsam, weshalb der Gesamtprozess ca. 100 h benötigt.The thesis deals with the optimization of the renaturation of recombinant mistletoe lectin I (rML) originating from bacterially produced inclusion bodies as well as the determination and mathematical modelling of the renaturation kinetics. Increasing protein concentration during renaturation enhances aggregation, thereby limiting the generation of biologically active rML. Low-molecular folding additives (e.g. arginine) increase protein solubility, but result in reduced formation of the heterodimeric rML. The important parameters influencing the renaturation of rML are redox system, temperature, pH-value, as well as the way of adding the unfolded protein chains into the refolding buffer. Under optimized conditions, concentrations of up to 4.5 µg/mL renatured rML can be achieved by employing a total protein concentration of 20 µg/mL. The redox potential is the most important parameter concerning the refolding process. The formation of heterodimeric disulphide-bonded mistletoe lectin I occurs only within a very narrow redox range. With the determination of the renaturation kinetics, a simplified model describing the refolding process was developed. In particular, it is shown that the formation of the correctly folded rMLB chain represents the rate-determining step of the renaturation of rML. Moreover, it is also shown that the association of both chains is a slow process, and thus, the entire renaturation procedure requires approx. 100 h

The wealth of information from transient guest profiles

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Probing the Nature of Surface Barriers on ZSM-5 by Surface Modification

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