Novel dendritic multifunctional nanocarriers and their application in biomedicine

En el marco de las posibilidades ofrecidas por la nanotecnología, los materiales dendríticos presentan un gran interés debido a su gran potencial como transportadores de moléculas de diversa naturaleza. En este sentido, los dendrímeros y materiales derivados han sido ampliamente utilizados en biomedicina como transportadores de fármacos y de material genético. Dentro de la gran variedad de dendrímeros existente, la presente tesis doctoral se ha centrado en el estudio de materiales dendríticos basados en el ácido 2,2´-bis(hidroximetil)propiónico (bis-MPA) y el ácido 2,2’-bis(gliciloximetil)propiónico (bis-GMPA). Éste último incluye grupos amida internos potencialmente capaces de establecer puentes de hidrógeno con las moléculas que aloje en su interior y reforzar de esta manera su interacción para una encapsulación más eficiente. Basados en estas unidades mínimas, se han diseñado dos tipos de materiales dendríticos: dendrímeros de tipo Jano anfífilos y polímeros hiperramificados dendronizados (DHPs, por sus siglas en inglés). Los dendrímeros tipo Jano anfífilos combinan una cara hidrófila con una lipófila y en esta tesis doctoral, se ha alternado la composición bis-MPA/ bis-GMPA entre ambas caras. Además, también se ha modificado el número de cadenas lipófilas (2 ó 4), alterando de esta manera el balance hidrófilo del dendrímero resultante. En concreto, los dendrímeros Jano sintetizados han sido:- (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)2 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-GMPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-MPA de 1ª generación,- (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)4 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-GMPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-MPA de 2ª generación,- (NH3+)8[MPA]-[GMPA](C17)2 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-MPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-GMPA de 1ª generación,- (NH3+)8[MPA]-[GMPA](C17)4 que consiste en un dendrón hidrófilo de bis-MPA 3ª generación y un dendrón lipófilo de bis-GMPA de 2ª generación.Por otra parte, los DHPs sintetizados consisten en un núcleo hiperramificado de bis-MPA de diferentes generaciones (G2, G3 o G4) en el cual se han insertado dendrones de bis-MPA o de bis-GMPA, obteniendo en ambos casos macromoléculas globulares policatiónicas. Esta última característica es de gran interés para acomplejar electrostáticamente diversas moléculas de naturaleza aniónica. Específicamente, se han sintetizado seis DHPs que se pueden clasificar de la siguiente manera según los dendrones componentes:Serie bis-MPA:- DHP(G2)-MPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 2ª generación rodeado de dendrones de bis-MPA, con un total de 64 grupos amino terminales teóricos,- DHP(G3)-MPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 3ª generación rodeado de dendrones de bis-MPA, con un total de 128 grupos amino terminales teóricos,- DHP(G4)-MPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 4ª generación rodeado de dendrones de bis-MPA, con un total de 256 grupos amino terminales teóricos.Serie bis-GMPA:- DHP(G2)-GMPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 2ª generación rodeado de dendrones de bis-GMPA, con un total de 64 grupos amino terminales teóricos,- DHP(G3)-GMPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 3ª generación rodeado de dendrones de bis-GMPA, con un total de 128 grupos amino terminales teóricos,- DHP(G4)-GMPA que consiste en un núcleo hiperramificado de 4ª generación rodeado de dendrones de bis-GMPA, con un total de 256 grupos amino terminales teóricos.En todos los casos, la estrategia empleada para la unión de los dendrones entre sí o la unión de los dendrones al núcleo hiperramificado ha sido la reacción de cicloadición 1,3-dipolar entre grupos azida y alquino catalizada por Cu (I), CuAAC, dando lugar a un anillo de triazol.Tras sintetizar, caracterizar y estudiar las propiedades de ambos tipos de materiales dendríticos en medio acuoso (capítulo 2), se ha realizado un estudio más específico de los dendrímeros tipo Jano como transportadores de fármacos anti-hepatitis C (capítulo 3) y anti-tuberculosos (capítulo 4); mientras que los DHPs se han explorado como vectores de heparina en el tratamiento de la malaria (capítulo 5) y como vectores de material genético dentro de la estrategia denominada transfección génica (capítulo 6).El estudio de la hepatitis C se ha focalizado en rescatar la actividad antiviral de dos compuestos que inhiben la actividad de la proteasa viral NS3 in vitro, pero que presentan escasa actividad en estudios celulares. Estos compuestos son el ácido iopanoico (IA) y el tiratricol (TRIAC), y ambos se han solubilizado con la ayuda de dendrímeros Jano como nanotransportadores. Inicialmente, se ha realizado un estudio calorimétrico para evaluar la interacción entre los compuestos y los agregados dendríticos, y posteriormente, se han incorporado dichos compuestos mediante difusión en los agregados dendríticos previamente formados. Estos agregados cargados con los compuestos se han caracterizado morfológicamente y se ha evaluado su actividad antiviral al mismo tiempo que se ha estudiado su efecto citotóxico sobre las células. Los dendrímeros más prometedores para esta aplicación han sido (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)2 y (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)4, consiguiendo reducir considerablemente la EC40 de los fármacos libres.En cuanto a la tuberculosis, el carácter anfífilo de los dendrímeros Jano se ha aprovechado para encapsular fármacos de diferente naturaleza de manera individual (rifampicina (RIF), isoniazida (INH), estreptomicina o bedaquilina) y combinaciones de ellos (RIF+INH). Los agregados resultantes se han caracterizado y la cantidad de fármaco encapsulada se ha cuantificado mediante HPLC. Adicionalmente, se ha evaluado la actividad antimicrobiana de todos los fármacos libres y encapsulados individualmente en los cuatro dendrímeros Jano frente a M. bovis BCG, comprobando que se mantiene de manera generalizada la actividad de los fármacos tras su encapsulación excepto en el caso de la bedaquilina. Posteriormente y tras comprobar la ausencia de sinergismo entre RIF e INH libres, se ha seleccionado el dendrímero (NH3+)8[GMPA]-[MPA](C17)4 para realizar la co-encapsulación de ambos (RIF+INH), y tras la correspondiente caracterización de los nanoagregados resultantes, se ha explorado su actividad antimicrobiana frente a diferentes cepas (M. bovis BCG, M. tuberculosis y Mtb-THP1). Otro estudio interesante realizado ha consistido en la evaluación de la cinética de muerte de Mtb con el tiempo frente a las diferentes combinaciones de fármacos libres y encapsulados en el dendrímero, lo que permite visualizar la aparición de resistencias bacterianas. En este sentido, ciertas condiciones de fármacos encapsulados han permitido retrasar la aparición de resistencias bacterianas, lo cual es muy positivo e interesante de cara a posibles estudios in vivo.El estudio sobre la malaria se ha centrado en mejorar las propiedades ventajosas del polisacárido heparina como agente antimalárico y como molécula de direccionamiento hacia glóbulos rojos infectados por el parásito. Para ello, se han empleado los DHPs como vectores capaces de acomplejar la heparina y potencialmente capaces de reducir los efectos laterales perjudiciales del tratamiento con el polisacárido (fuerte actividad anticoagulante que puede derivar en hemorragias cerebrales, escaso tiempo de circulación en sangre, etc.). En primer lugar, se han formado los complejos DHP/heparina mediante interacciones electrostáticas y se han caracterizado morfológicamente. A continuación, se ha estudiado la cinética de liberación de la heparina de los complejos, observando un posible efecto de las amidas del bis-GMPA como grupos capaces de establecer puentes de hidrógeno y retener en mayor medida el polisacárido. La actividad antiparasitaria de todos los complejos DHP/heparina formados, así como la de los complejos entre la heparina y los DHPs marcados con el fluoróforo rodamina (DHP-Rh/heparina), ha revelado buenos niveles de actividad de la heparina acomplejada, mejorando la IC50 de la heparina libre en algunos casos. Además, se ha estudiado mediante distintas técnicas el direccionamiento preferencial de los complejos DHPs-Rh/heparina frente a glóbulos rojos sanos o infectados por el parásito. Por último, se ha estudiado el tiempo de circulación en plasma de la heparina libre y formando complejos con los DHPs en un modelo animal in vivo.Los DHPs también se han explorado como vectores no virales para introducir material genético en células tumorales (HeLa) y mesenquimales (mMSCs); es decir, para la aplicación denominada transfección génica. En primer lugar, se han establecido los ratios N/P a los cuales se forman los dendriplejos (complejos entre dendrímero y material genético) con pDNA y siRNA. Tras caracterizar los dendriplejos mediante diversas técnicas fisico-químicas, se ha evaluado su actividad como vectores génicos en las correspondientes líneas celulares, empleando la proteína verde fluorescente (GFP) como marcador. La valoración de los resultados de transfección (sobreexpresión de GFP con pDNA o inhibición de GFP con siRNA) junto a la toxicidad producida en las líneas celulares, postulan a los DHPs de la serie de bis-MPA como mejores candidatos, ya que los homólogos de la serie bis-GMPA presentan una actividad prácticamente despreciable, probablemente debido a su menor internalización celular y a una menor disociación del material genético del dendriplejo. En concreto, la actividad como vector de transfección mejora conforme aumenta la generación del núcleo hiperramificado y son necesarios ratios N/P elevados para alcanzar buenos niveles de transfección e incluso superar a agentes comerciales muy eficaces.<br /

Increasing mtDNA levels as therapy for mitochondrial optic neuropathies

Leber hereditary optic neuropathy (LHON) is a rare, inherited mitochondrial disease. No treatment has shown a clear-cut benefit on a clinically meaningful end-point. Primary open-angle glaucoma (POAG) is a frequent, acquired optic neuropathy. Lowering intraocular pressure (IOP) reduces disease progression. However, current methods to decelerate this progression are recognized as being inadequate. Therefore, there is a clear need to look for new therapeutic approaches. The growing evidence indicates that POAG can also be a mitochondrial optic neuropathy (MON). Several risk elements are common for both diseases and all of them decrease mitochondrial (mt)DNA content. Based on these susceptibility factors and their molecular mechanism, we suggest herein pharmacological therapies targeted to increase mtDNA levels, oxidative phosphorylation (OXPHOS) capability, and mitochondrial energy production as treatments for MONs

Direct Optofluidic Measurement of the Lipid Permeability of Fluoroquinolones.

Quantifying drug permeability across lipid membranes is crucial for drug development. In addition, reduced membrane permeability is a leading cause of antibiotic resistance in bacteria, and hence there is a need for new technologies that can quantify antibiotic transport across biological membranes. We recently developed an optofluidic assay that directly determines the permeability coefficient of autofluorescent drug molecules across lipid membranes. Using ultraviolet fluorescence microscopy, we directly track drug accumulation in giant lipid vesicles as they traverse a microfluidic device while exposed to the drug. Importantly, our measurement does not require the knowledge of the octanol partition coefficient of the drug - we directly determine the permeability coefficient for the specific drug-lipid system. In this work, we report measurements on a range of fluoroquinolone antibiotics and find that their pH dependent lipid permeability can span over two orders of magnitude. We describe various technical improvements for our assay, and provide a new graphical user interface for data analysis to make the technology easier to use for the wider community.The work was supported by an ERC Consolidator grant “DesignerPores” awarded to UFK. JC acknowledges support from the BBSRC. MS was supported by the Friedrich Naumann Foundation for Freedom and the Swiss- European Mobility Programme. KAN was supported by the Erasmus Plus student exchange programme. SHA is supported by a Herchel Smith Postdoctoral Fellowship. SP acknowledges support from the Leverhulme Trust through an Early Career Fellowship (ECF-2013-444).This is the final version of the article. It first appeared from Nature Publishing Group at http://dx.doi.org/10.1038/srep32824

Análisis desagregado por género en el carcinoma hepatocelular: diagnóstico, tratamiento y resultados

Objetivos: Analizar las características del diagnóstico, tratamiento y supervivencia del carcinoma hepatocelular (HCC) en hombres y mujeres y descartar o confirmar posibles diferencias.Material y métodos: estudio observacional, retrospectivo y unicéntrico en el que se analizan las diferencias en una muestra obtenida de los pacientes diagnosticados de carcinoma hepatocelular en el Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa de Zaragoza desde 2001 hasta 2019. El programa estadístico utilizado es el R (versión 4.0.3).Resultados: el tamaño de la muestra es n=388 pacientes: 82,5% hombres y 17,5% mujeres. Se han encontrado diferencias significativas en la edad de presentación, apareciendo el tumor antes en hombres (62,0±11,1 años) que en mujeres (66,7±13,1 años) con una p=0,008. El consumo de tabaco es mayor en hombres (p=0,014), no habiendo consumido nunca tabaco el 46,3% de los hombres respecto al 64,8% de las mujeres. Igualmente, el consumo de alcohol en dosis de riesgo es mayor en el sexo masculino (51,8%) respecto al femenino (20,3%), con una pConclusiones: existen diferencias entre hombres y mujeres. La enfermedad hepática de base esdiferente, los hombres se diagnostican a edades más tempranas y las mujeres se diagnostican con mayor frecuencia a través del programa de cribado. Sin embargo, no hay diferencias en la estadificación del tumor en el momento del diagnóstico ni tampoco diferencias en lasupervivencia.<br /

Caracterización bioquímica de un cíbrido transmitocondrial: un modelo celular del Síndrome de Pearson

El Síndrome de Pearson (PS) es una enfermedad mitocondrial rara caracterizada por la aparición de fallos multisistémicos, como anemia sideroblástica refractaria y disfunción del páncreas exocrino. Está causada por deleciones grandes únicas del ADN mitocondrial (mtADN) que afectan al sistema OXPHOS de la mitocondria. En este trabajo estudiamos el efecto en el metabolismo celular de una deleción mitocondrial de 6517 pb (6897-13414), causante del PS. Utilizamos como modelo celular cuatro clones de cíbridos mitocondriales de la línea celular CibPS-143B, con grados de heteroplasmia del 0 %, 60-65 %, 70-75 % y 75-80 %. Los parámetros analizados fueron el número de copias de mtADN, la actividad y cantidad del complejo IV mitocondrial (CIV), la actividad de citrato sintasa y los niveles de ATP mitocondrial. Observamos que al aumentar el grado de heteroplasmia de las células, se incrementa el déficit del CIV y disminuye la producción de ATP mitocondrial. Por otro lado, el aumento del porcentaje de deleción supone un incremento del número de copias de mtADN, lo que seguramente se trate de un mecanismo de compensación de la célula. Además, se ha observado que durante el crecimiento en cultivo los clones estudiados tienden a aumentar su grado de heteroplasmia, evolucionando hacia la homoplasmia mutante

INCIDENCIA Y EVOLUCIÓN DE LAS MANIFESTACIONES EXTRAHEPÁTICAS AUTOINMUNES EN PACIENTES RECEPTORES DE TRASPLANTE HEPÁTICO POR ENFERMEDAD HEPÁTICA AUTOINMUNE

Las hepatopatías autoinmunes más frecuentes son la hepatitis autoinmune, la colangitis esclerosante primaria, la colangitis biliar primaria. En algunos casos el tratamiento médico de estas enfermedades no es capaz de frenar su avance por lo que el trasplante hepático pasa a ser la opción terapéutica de elección. Se ha realizado una revisión bibliográfica con el objetivo de conocer las manifestaciones autoinmunes extrahepáticas en pacientes con alguna de estas hepatopatías. Por otra parte, se ha llevado a cabo un estudio retrospectivo de una cohorte de pacientes formada por los pacientes receptores de trasplante hépatico en el Hospital Clinico Universitario Lozano Blesa desde 1998 a 2019 analizando la evolución de las manifestaciones extrahepáticas y cómo influye el trasplante en ellas. El trasplante hepático supone un tratamiento curativo para la hepatopatía autoinmune, que junto al tratamiento inmunosupresor post- trasplante modifican la evolución de las manifestaciones extrahepáticas. Sin embargo en ocasiones este tratamiento no es efectivo y el desarrollo de estas manifestaciones no varía e incluso la hepatopatía autoinmune recurre en el injerto. Se necesitan más estudios para conocer en profundidad la evolución de las manifestaciones extrahepáticas tras el trasplante hepático para así poder proporcionar un tratamiento óptimo de la hepatopatía, así como de todas las manifestaciones extrahepáticas.<br /

Food derived respiratory complex I inhibitors modify the effect of Leber hereditary optic neuropathy mutations

Mitochondrial DNA mutations in genes encoding respiratory complex I polypeptides can cause Leber hereditary optic neuropathy. Toxics affecting oxidative phosphorylation system can also cause mitochondrial optic neuropathy. Some complex I inhibitors found in edible plants might differentially interact with these pathologic mutations and modify their penetrance. To analyze this interaction, we have compared the effect of rotenone, capsaicin and rolliniastatin-1 on cybrids harboring the most frequent Leber hereditary optic neuropathy mutations and found that m.3460G > A mutation increases rotenone resistance but capsaicin and rolliniastatin-1 susceptibility. Thus, to explain the pathogenicity of mitochondrial diseases due to mitochondrial DNA mutations, their potential interactions with environment factors will have to be considered

Coating and Stabilization of Liposomes by Clathrin-Inspired DNA Self-Assembly

The self-assembly of the protein clathrin on biological membranes facilitates essential processes of endocytosis and has provided a source of inspiration for materials design by the highly ordered structural appearance. By mimicking the architecture of the protein building blocks and clathrin self-assemblies to coat liposomes with biomaterials, advanced hybrid carriers can be derived. Here we present a method for fabricating DNA-coated liposomes by hydrophobically anchoring and subsequently connecting DNA-based triskelion structures on the liposome surface inspired by the assembly of the protein clathrin. Dynamic light scattering, ζ-potential, confocal microscopy and cryo-electron microscopy measurements independently demonstrate successful DNA coating. Nanomechanical measurements conducted with atomic force microscopy show that the DNA coating enhances the mechanical stability of the liposomes relative to uncoated ones. Furthermore, we provide the possibility to reverse the coating process by triggering the disassembly of the DNA coats through a toehold-mediated displacement reaction. Our results describe a straightforward, versatile, and reversible approach for coating and stabilizing lipid vesicles through the assembly of rationally designed DNA structures. This method has potential for further development towards the ordered arrangement of tailored functionalities on the surface of liposomes and for applications as hybrid nanocarrier