71 research outputs found
Morphologisch-funktionelle Untersuchungen zur prognostischen Bewertung der equinen Endometrose
Ziel der Studie war die morphologisch-funktionelle Charakterisierung der Endometrose mittels konventioneller histopathologischer und neuer immunhistologischer Methoden. Die Ergebnisse wurden mit den Abfohlraten der untersuchten Stuten verglichen, um eine genauere
Prognose hinsichtlich der Fertilität zu erhalten.
Innerhalb der physiologischen Decksaison wurden von 159 klinisch gesunden, östrischen Stuten (3 bis 21 Jahre alt) Endometriumbioptate entnommen. Die Stuten wurden danach im selben Jahr besamt und nach Erfassen der Abfohlraten im folgenden Jahr in zwei Gruppen
eingeteilt: güste Stuten und nicht güste Stuten. Im Rahmen einer Doppelblind-Studie wurden endometriale Alterationen lichtmikroskopisch erfasst sowie Grad und Qualität der Endometrose
histomorphologisch definiert. Repräsentativ ausgewählte Bioptate (n=82) wurden immunhistologisch auf die Expression der Steroidhormonrezeptoren (Östrogenrezeptor, ER; Progesteronrezeptor, PR) und ausgewählter endometrialer Proteine (Uteroglobin, UG; Uterokalin, UK; CalbindinD9k, CAL; Uteroferrin, UF) untersucht.
101/159 Stuten zeigen eine, qualitativ und quantitativ variierende, Endometrose. Die fibrotischen Uterindrüsen weisen, im Vergleich zu unveränderten Drüsen, ein zyklusasynchrones, teilweise innerhalb eines Drüsenquerschnittes ungleichmäßiges endometriales Proteinmuster auf. Das ungleichmäßige Expressionsmuster kann als Zeichen einer endometrialen Fehldifferenzierung innerhalb fibrotischer Areale interpretiert werden. Die Aktivität der Endometrose hat keinen Einfluss auf das endometriale Proteinmuster. Güste Stuten besitzen häufiger einemittelgradige, vorwiegend destruierende, inaktive oder gemischte Endometrose. Insbesondere in Arealen mittelgradiger destruierender Endometrosen ist eine deutlich verminderte Expression
von UG und UK nachweisbar. Auch in der geringgradigen Endometrose werden häufiger beide Proteine gleichzeitig zyklusasynchron exprimiert. UF wird innerhalb höhergradiger destruierender fibrotischer Herde überweigend intensiver exprimiert als in den unveränderten
Epithelien, während CAL vielfach ein variables Proteinmuster besitzt. Nicht güste Stuten hingegen zeigen häufig eine geringgradige aktive oder inaktive Endometrose. Bei diesen Stuten weist ein hoher Anteil betroffener glandulärer Epithelien in der mittelgradigen Endometrose
entweder eine zyklussynchrone oder geringgradig zyklusasynchrone Expression von UG, UK und CAL auf. UF wird auch in dieser Gruppe häufig intensiver in fibrotischen Drüsen exprimiert. Zwischen güsten und nicht güsten Stuten bestehen charakteristische Unterschiede im Expressionsmuster von UG und UK: nicht güste Stuten besitzen in gering- und mittelgradig fibrotisch veränderten Uterindrüsen häufiger eine zyklussynchrone Proteinexpression als güste Stuten und seltener deutliche Abweichungen in der Expression von entweder UG oder UK.
Stuten beider Gruppen besitzen eine zyklusasynchrone Expression der ER und PR sowohl in den periglandulären fibrotischen Stromazellen als auch im Drüsenepithel. Die glanduläre Hormonrezeptorexpression ist tendenziell abhängig von der Aktivität der Endometrose. Diese
Resultate sprechen für eine Abkopplung fibrotischer Areale von den uterinen Kontrollmechanismen. Im Rahmen dieser Studie konnte überwiegend bei güsten Stuten in der Endometrose, im Vergleich
zu unveränderten Drüsen, ein deutlich abweichendes endometriales Proteinmuster von UG und UK dargestellt werden. Insbesondere bei Tieren, die an einer mittelgradigen destruierenden Endometrose leiden, könnte diese Tatsache als Hinweis auf eine fertilitätsmindernde
Beeinflussung des uterinen Mikromilieus im Rahmen der Endometrose interpretiert werden.
Die vorliegende Untersuchung unterstreicht die Notwendigkeit einer genaueren Klassifizierung der Endometrose und empfiehlt, zusätzlich zum Grad auch die Qualität der Endometrose sowie das endometriale Expressionsmuster von UG und UK in der Epikrise für eine präzisere
Fertilitätsprognose zu berücksichtigen.:1 EINLEITUNG........................................................................................................... 1
2 LITERATURÜBERSICHT ....................................................................................... 2
2.1 Fertilität in der Pferdezucht.............................................................................................. 2
2.2 Die Endometriumbiopsie bei der Stute ............................................................................ 4
2.2.1 Indikationen................................................................................................................... 4
2.2.2 Repräsentativität............................................................................................................ 4
2.2.3 Kategorisierung ............................................................................................................. 5
2.3 Der Sexualzyklus der Stute................................................................................................ 7
2.3.1 Allgemeine Betrachtungen............................................................................................ 7
2.3.2 Histomorphologie des Endometriums in den Zyklusphasen......................................... 9
2.3.3 Regulation des endometrialen Zyklus......................................................................... 12
2.3.4 Immunhistologische Untersuchungen zur Expression der Östrogen- und
Progesteronrezeptoren am Endometrium der Stute im Zyklusverlauf ........................ 13
2.4 Sekretorische Aktivitäten des Uterus ............................................................................. 15
2.4.1 Allgemeine Betrachtung........................................................................................... 15
2.4.2 Endometriale Proteine .............................................................................................. 16
2.4.2.1 Uteroglobin............................................................................................................... 16
2.4.2.2 Uteroferrin................................................................................................................ 17
2.4.2.3 Uterokalin................................................................................................................. 18
2.4.2.4 CalbindinD9k ............................................................................................................. 19
2.4.2.5 Regulation der endometrialen Proteine.................................................................... 19
2.4.2.6 Die endometrialen Proteine im Zyklusverlauf bei der Stute.................................... 21
2.4.2.7 Die endometrialen Proteine während der Gravidität bei der Stute .......................... 22
2.5 Die equine Endometrose .................................................................................................. 24
IV
2.5.1 Allgemeine Betrachtungen....................................................................................... 24
2.5.2 Histomorphologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen der
Endometrose............................................................................................................. 25
2.5.3 Immunhistologische Untersuchungen der Endometrose.......................................... 29
2.5.3.1 Östrogen- und Progesteronrezeptoren...................................................................... 29
2.5.3.2 Sekretorische Proteine.............................................................................................. 30
2.5.4 Die Endometrose während der Gravidität und im Puerperium................................ 31
2.5.5 Mögliche Einflussfaktoren auf die Endometrose ..................................................... 32
2.5.6 Ansätze zur Ätiologie und Pathogenese der Endometrose ...................................... 33
3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN ................................................................. 36
3.1 Tiergut und Probenherkunft........................................................................................... 36
3.2 Nähere Charakterisierung des Tiergutes....................................................................... 36
3.3 Methoden.......................................................................................................................... 37
3.3.1 Probenentnahme und Probenaufbereitung .................................................................. 37
3.3.2 Anfertigung und Färbung der Schnitte........................................................................ 37
3.3.3 Lichtmikroskopische Auswertung und Kategorisierung............................................. 37
3.4 Immunhistologische Methoden ....................................................................................... 39
3.4.1 Immunhistologische Kontrollen.................................................................................. 39
3.4.2 Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen............................................. 39
3.5 Statistische Untersuchungen ........................................................................................... 41
4 ERGEBNISSE....................................................................................................... 42
4.1 Allgemeine histopathologische Befunderhebung im eigenen Untersuchungsgut....... 42
4.1.1 Gruppeneinteilung der Stuten mit einer Endometrose ................................................ 43
4.1.2 Prävalenz der Endometrose im Untersuchungsgut...................................................... 44
4.1.3 Endometrose und Endometritis ................................................................................... 46
4.1.4 Endometrose und Angiosklerose................................................................................. 46
V
4.1.5 Endometrose und Perivaskulitis.................................................................................. 46
4.1.6 Kategorisierung ........................................................................................................... 46
4.2 Histomorphologische Charakteristika der Endometrose im eigenen
Untersuchungsgut unter Berücksichtigung der anamnestischen Daten ..................... 48
4.2.1 Aktive Endometrose.................................................................................................... 51
4.2.2 Inaktive Endometrose.................................................................................................. 52
4.2.3 Gemischte Endometrose.............................................................................................. 53
4.2.4 Aktive destruierende Endometrose ............................................................................. 53
4.2.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................... 54
4.2.6 Gemischte destruierende Endometrose ....................................................................... 54
4.3 Gruppenspezifischer Vergleich zwischen Stuten mit einer Endometrose und
Stuten mit einer Endometrose und Endometritis ......................................................... 55
4.4 Immunhistologische Untersuchungen der unterschiedlichen Erscheinungsformen
der Endometrose im eigenen Untersuchungsgut........................................................... 58
4.4.1 Immunhistologische Ergebnisse der Steroidhormonrezeptor-Analyse.................... 58
4.4.1.1 Aktive Endometrose................................................................................................. 58
4.4.1.2 Inaktive Endometrose............................................................................................... 59
4.4.1.3 Gemischte Endometrose........................................................................................... 60
4.4.1.4 Aktive destruierende Endometrose .......................................................................... 61
4.4.1.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................ 61
4.4.1.6 Gemischte destruierende Endometrose .................................................................... 62
4.4.2 Immunhistologische Ergebnisse zum Nachweis der endometrial synthetisierten
Proteine..................................................................................................................... 64
4.4.2.1 Aktive Endometrose................................................................................................. 64
4.4.2.2 Inaktive Endometrose............................................................................................... 66
4.4.2.3 Gemischte Endometrose........................................................................................... 67
4.4.2.4 Aktive destruierende Endometrose .......................................................................... 69
4.4.2.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................ 70
4.4.2.6 Gemischte destruierende Endometrose .................................................................... 71
VI
4.5 Gruppenspezifischer Vergleich der immunhistologischen Ergebnisse zwischen Stuten
mit einer Endometrose und Stuten mit einer Endometrose und Endometritis ... 73
4.6 Vergleichende Zusammenfassung der histopathologischen und immunhistologischen
Befunde unter Berücksichtigung der anamnestischen Daten ........................ 78
5 DISKUSSION ........................................................................................................ 82
5.1 Ziele der Arbeit................................................................................................................. 82
5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsmaterials und der Untersuchungsmethoden
........................................................................................................................... 82
5.3 Die equine Endometrose .................................................................................................. 83
5.3.1 Allgemeine Betrachtungen zur Endometrose.............................................................. 83
5.3.2 Morphologie der Endometrose.................................................................................... 84
5.3.3 Einflussfaktoren auf die Endometrose ........................................................................ 87
5.3.4 Kategorisierung ........................................................................................................... 88
5.3.5 Veränderungen im sekretorischen Proteinmuster im Rahmen der Endometrose........ 90
5.3.6 Mögliche Konsequenzen eines defizienten Proteinmusters auf die Fertilität ............. 94
6 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................ 97
7 SUMMARY............................................................................................................ 99
8 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................101
9 ANHANG..............................................................................................................112
9.1 Charakterisierung des Tiergutes mit einer Endometrose .......................................... 112
9.2 Für die Immunhistologie verwendete Antikörper, Seren und Positivkontrollen..... 115
9.3 Verfahrensschritte der immunhistologischen Untersuchungen ................................ 118
9.3.1 Vorbehandlung .......................................................................................................... 118
VII
9.3.2 Besondere Verfahren................................................................................................. 118
9.3.3 Antigennachweis mittels monoklonaler AK nach der PAP-Methode....................... 119
9.3.4 Antigennachweis mittels polyklonaler AK nach der PAP-Methode......................... 119
9.3.5 Standard zur Nachbehandlung .................................................................................. 120
9.3.6 Lösungen und Puffer ................................................................................................. 120
9.4 Bilddokumentatio
Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: Preservation of DNA integrity
The aim of this study was to investigate preservation of biomolecular structures, particularly DNA, in freeze-dried fibroblasts, after loading with trehalose via freezing-induced uptake. Cells were freeze-dried with trehalose alone or in a mixture of albumin and trehalose. Albumin was added to increase the glass transition temperature and storage stability. No viable cells were recovered after freeze-drying and rehydration. FTIR studies showed that membrane phase behavior of freeze-dried cells resembles that of fresh cells. However, one day after rehydration membrane phase separation was observed, irrespective of the presence or absence of trehalose during freeze-drying. Freeze-drying did not affect the overall protein secondary structure. Analysis of DNA damage via single cell gel electrophoresis ('comet assay') showed that DNA damage progressively increased with storage duration and temperature. DNA damage was prevented during storage at 4 °C. It is shown that trehalose reduces DNA damage during storage, whereas addition of albumin did not seem to have an additional protective effect on storage stability (i.e. DNA integrity) despite the fact that albumin increased the glass transition temperature. Taken together, DNA in freeze-dried somatic cells can be preserved using trehalose as protectant and storage at or below 4 °C
Loading equine oocytes with cryoprotective agents captured with a finite element method model
Cryopreservation can be used to store equine oocytes for extended periods so that they can be used in artificial reproduction technologies at a desired time point. It requires use of cryoprotective agents (CPAs) to protect the oocytes against freezing injury. The intracellular introduction of CPAs, however, may cause irreversible osmotic damage. The response of cells exposed to CPA solutions is governed by the permeability of the cellular membrane towards water and the CPAs. In this study, a mathematical mass transport model describing the permeation of water and CPAs across an oocyte membrane was used to simulate oocyte volume responses and concomitant intracellular CPA concentrations during the exposure of oocytes to CPA solutions. The results of the analytical simulations were subsequently used to develop a phenomenological finite element method (FEM) continuum model to capture the response of oocytes exposed to CPA solutions with spatial information. FEM simulations were used to depict spatial differences in CPA concentration during CPA permeation, namely at locations near the membrane surface and towards the middle of the cell, and to capture corresponding changes in deformation and hydrostatic pressure. FEM simulations of the multiple processes occurring during CPA loading of oocytes are a valuable tool to increase our understanding of the mechanisms underlying cryopreservation outcome. © 2021, The Author(s)
Stored Stallion Sperm Quality Depends on Sperm Preparation Method in INRA82 or INRA96
Removal of seminal plasma facilitates stallion sperm survival during storage, but washing may damage sperm chromatin. Therefore, sperm quality was compared in samples following single-layer centrifugation (SLC) or sperm washing and controls (extension only) in two extenders, INRA82 and INRA96. Ejaculates from six stallions were split among six treatments: SLC, sperm washing, and controls, in INRA82 and INRA96. Sperm motility and acrosome status were evaluated at 0, 24, 48, 72 and 96 hours; morphology at 0, 24, 48, 72 hours and chromatin integrity at 0 and 96 hours, with storage at 6 degrees C. Sperm samples in INRA96 had better motility, acrosome status, and normal morphology than samples in INRA82. The SLC samples had higher motility and fewer reacted acrosomes than controls, and lower fragmented chromatin than washed samples. Fewer spermatozoa with tail defects were observed after SLC than after sperm washing; spermatozoa washed in INRA82 had fewer tail defects than those washed in INRA96. In conclusion, sperm quality (except for morphology) was better in INRA96 than in INRA82 and was better in SLC samples than in washed samples or controls. The SLC method is a useful adjunct to stallion sperm preparation, especially for storage before artificial insemination. (C) 2020 The Author(s). Published by Elsevier Inc
Increase of skin temperature prior to parturition in mares
Prediction of impending foaling is highly desirable as early intervention may improve mare and foal outcomes. However, monitoring the peripartum mare is a time-consuming challenge for breeders and many foaling prediction systems have limitations. "Heating up" of the mare is empirically used by breeders as a sign of upcoming parturition in mares. The purpose of this study was to investigate if an increase in skin temperature shortly before parturition is detectable and to determine whether such physiological changes could be an additional valuable parameter to predict foaling. For that, 56 foalings of 14 Warmblood mares, 5 Arabian mares, 27 Thoroughbred mares, and 2 mares of other breeds were analyzed in this 2-year-study. Eight mares were monitored in both years. Mares were between 4 and 22 years old (average: 10 ± 5.5 years) and the mean pregnancy length was 342 days (±9 days), resulting in 14 births from primiparous mares and 42 multiparous mares. For monitoring the periparturient mares, the Piavet® system (Piavita AG, Zurich, Switzerland) was fixed daily when the mares had returned from the field between 4:00 and 6:00 p.m. and collected the next morning between 6:30 and 7:30 a.m. until the time of foaling. Nocturnal rhythms of the skin temperature with the highest values at the start of measurements and a nadir at 6:00 a.m. were observed. On the foaling night, we found a rise in skin temperature starting on average around 90 min prepartum. Skin temperatures recorded at 50 min before parturition and at each 5 min time point until rupture of the allantochorion were significantly higher (p < 0.05) than the mean temperatures measured in the 5 nights before parturition at the same time, reaching a difference of approximately 0.5 °C. There was a significant effect of parity (p = 0.04) on skin temperature during the last hours before foaling where primiparous mares showed a higher mean temperature than uni- or pluriparous mares as early as from 180 min on before parturition. In conclusion, our study shows an increase in skin temperature in most mares within 90 min before birth. Using new biomechanical and digital technologies, this finding could generate an additional potential parameter for the detection of impending parturition. However, skin temperature cannot be used as the only predictive diagnostic of impending parturition in the absence of other parameters
Comparison of systemic trimethoprim-sulfadimethoxine treatment and intrauterine ozone application as possible therapies for bacterial endometritis in equine practice
Bacterial endometritis is one of the major problems in equine reproduction and usually treated with antimicrobial drugs. The study aimed to compare the effects of intrauterine ozone application and systemic antibiotic treatment (trimethoprim-sulfadimethoxine) on intrauterine bacterial growth and possible side effects on the endometrium in a clinical setting. Mares (n = 30) with signs of endometritis (positive uterine bacterial culture and cytological findings) were assigned randomly to different treatments: intrauterine insufflation of an ozone-air-mix (240 ml, 80 μg ozone/ml) twice at a 48 h-interval (Ozone; n = 10), systemic antibiotic therapy with trimethoprim-sulfadimethoxine (30 mg/kg, p.o., twice daily) for 5 days (TMS; n = 10), or intrauterine insufflation of air (240 ml, sterile-filtered) twice at a 48 h-interval (air; n = 10). Endometrial biopsy for histological examination was obtained before the treatment. Histological examination revealed no differences among groups. A control examination, including transrectal ultrasound, bacterial culture, cytological evaluation, and biopsy, was performed 7 days after the last treatment. Overall bacterial growth was reduced in every group after the treatment (p < 0.05), irrespective of the therapy [Ozone: 4/9 (positive culture after treatment/number of mares), TMS: 3/10 and Air: 6/10; p > 0.05]. However, Ozone and TMS (p < 0.05) were more effective in reducing growth of gram-negative bacteria as compared to Air (p > 0.05). No effects on the number of polymorphonuclear granulocytes (cytology) were observed (p > 0.05). In conclusion, trimethoprim-sulfadimethoxine and intrauterine ozone insufflation are safe treatment options for bacterial endometritis in mares but the efficacy of both treatments in reducing bacterial growth did not result in a complete absence of intrauterine bacterial growth
Screening of whole genome sequences identified high-impact variants for stallion fertility
Morphologisch-funktionelle Untersuchungen zur prognostischen Bewertung der equinen Endometrose
Ziel der Studie war die morphologisch-funktionelle Charakterisierung der Endometrose mittels konventioneller histopathologischer und neuer immunhistologischer Methoden. Die Ergebnisse wurden mit den Abfohlraten der untersuchten Stuten verglichen, um eine genauere
Prognose hinsichtlich der Fertilität zu erhalten.
Innerhalb der physiologischen Decksaison wurden von 159 klinisch gesunden, östrischen Stuten (3 bis 21 Jahre alt) Endometriumbioptate entnommen. Die Stuten wurden danach im selben Jahr besamt und nach Erfassen der Abfohlraten im folgenden Jahr in zwei Gruppen
eingeteilt: güste Stuten und nicht güste Stuten. Im Rahmen einer Doppelblind-Studie wurden endometriale Alterationen lichtmikroskopisch erfasst sowie Grad und Qualität der Endometrose
histomorphologisch definiert. Repräsentativ ausgewählte Bioptate (n=82) wurden immunhistologisch auf die Expression der Steroidhormonrezeptoren (Östrogenrezeptor, ER; Progesteronrezeptor, PR) und ausgewählter endometrialer Proteine (Uteroglobin, UG; Uterokalin, UK; CalbindinD9k, CAL; Uteroferrin, UF) untersucht.
101/159 Stuten zeigen eine, qualitativ und quantitativ variierende, Endometrose. Die fibrotischen Uterindrüsen weisen, im Vergleich zu unveränderten Drüsen, ein zyklusasynchrones, teilweise innerhalb eines Drüsenquerschnittes ungleichmäßiges endometriales Proteinmuster auf. Das ungleichmäßige Expressionsmuster kann als Zeichen einer endometrialen Fehldifferenzierung innerhalb fibrotischer Areale interpretiert werden. Die Aktivität der Endometrose hat keinen Einfluss auf das endometriale Proteinmuster. Güste Stuten besitzen häufiger einemittelgradige, vorwiegend destruierende, inaktive oder gemischte Endometrose. Insbesondere in Arealen mittelgradiger destruierender Endometrosen ist eine deutlich verminderte Expression
von UG und UK nachweisbar. Auch in der geringgradigen Endometrose werden häufiger beide Proteine gleichzeitig zyklusasynchron exprimiert. UF wird innerhalb höhergradiger destruierender fibrotischer Herde überweigend intensiver exprimiert als in den unveränderten
Epithelien, während CAL vielfach ein variables Proteinmuster besitzt. Nicht güste Stuten hingegen zeigen häufig eine geringgradige aktive oder inaktive Endometrose. Bei diesen Stuten weist ein hoher Anteil betroffener glandulärer Epithelien in der mittelgradigen Endometrose
entweder eine zyklussynchrone oder geringgradig zyklusasynchrone Expression von UG, UK und CAL auf. UF wird auch in dieser Gruppe häufig intensiver in fibrotischen Drüsen exprimiert. Zwischen güsten und nicht güsten Stuten bestehen charakteristische Unterschiede im Expressionsmuster von UG und UK: nicht güste Stuten besitzen in gering- und mittelgradig fibrotisch veränderten Uterindrüsen häufiger eine zyklussynchrone Proteinexpression als güste Stuten und seltener deutliche Abweichungen in der Expression von entweder UG oder UK.
Stuten beider Gruppen besitzen eine zyklusasynchrone Expression der ER und PR sowohl in den periglandulären fibrotischen Stromazellen als auch im Drüsenepithel. Die glanduläre Hormonrezeptorexpression ist tendenziell abhängig von der Aktivität der Endometrose. Diese
Resultate sprechen für eine Abkopplung fibrotischer Areale von den uterinen Kontrollmechanismen. Im Rahmen dieser Studie konnte überwiegend bei güsten Stuten in der Endometrose, im Vergleich
zu unveränderten Drüsen, ein deutlich abweichendes endometriales Proteinmuster von UG und UK dargestellt werden. Insbesondere bei Tieren, die an einer mittelgradigen destruierenden Endometrose leiden, könnte diese Tatsache als Hinweis auf eine fertilitätsmindernde
Beeinflussung des uterinen Mikromilieus im Rahmen der Endometrose interpretiert werden.
Die vorliegende Untersuchung unterstreicht die Notwendigkeit einer genaueren Klassifizierung der Endometrose und empfiehlt, zusätzlich zum Grad auch die Qualität der Endometrose sowie das endometriale Expressionsmuster von UG und UK in der Epikrise für eine präzisere
Fertilitätsprognose zu berücksichtigen.:1 EINLEITUNG........................................................................................................... 1
2 LITERATURÜBERSICHT ....................................................................................... 2
2.1 Fertilität in der Pferdezucht.............................................................................................. 2
2.2 Die Endometriumbiopsie bei der Stute ............................................................................ 4
2.2.1 Indikationen................................................................................................................... 4
2.2.2 Repräsentativität............................................................................................................ 4
2.2.3 Kategorisierung ............................................................................................................. 5
2.3 Der Sexualzyklus der Stute................................................................................................ 7
2.3.1 Allgemeine Betrachtungen............................................................................................ 7
2.3.2 Histomorphologie des Endometriums in den Zyklusphasen......................................... 9
2.3.3 Regulation des endometrialen Zyklus......................................................................... 12
2.3.4 Immunhistologische Untersuchungen zur Expression der Östrogen- und
Progesteronrezeptoren am Endometrium der Stute im Zyklusverlauf ........................ 13
2.4 Sekretorische Aktivitäten des Uterus ............................................................................. 15
2.4.1 Allgemeine Betrachtung........................................................................................... 15
2.4.2 Endometriale Proteine .............................................................................................. 16
2.4.2.1 Uteroglobin............................................................................................................... 16
2.4.2.2 Uteroferrin................................................................................................................ 17
2.4.2.3 Uterokalin................................................................................................................. 18
2.4.2.4 CalbindinD9k ............................................................................................................. 19
2.4.2.5 Regulation der endometrialen Proteine.................................................................... 19
2.4.2.6 Die endometrialen Proteine im Zyklusverlauf bei der Stute.................................... 21
2.4.2.7 Die endometrialen Proteine während der Gravidität bei der Stute .......................... 22
2.5 Die equine Endometrose .................................................................................................. 24
IV
2.5.1 Allgemeine Betrachtungen....................................................................................... 24
2.5.2 Histomorphologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen der
Endometrose............................................................................................................. 25
2.5.3 Immunhistologische Untersuchungen der Endometrose.......................................... 29
2.5.3.1 Östrogen- und Progesteronrezeptoren...................................................................... 29
2.5.3.2 Sekretorische Proteine.............................................................................................. 30
2.5.4 Die Endometrose während der Gravidität und im Puerperium................................ 31
2.5.5 Mögliche Einflussfaktoren auf die Endometrose ..................................................... 32
2.5.6 Ansätze zur Ätiologie und Pathogenese der Endometrose ...................................... 33
3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN ................................................................. 36
3.1 Tiergut und Probenherkunft........................................................................................... 36
3.2 Nähere Charakterisierung des Tiergutes....................................................................... 36
3.3 Methoden.......................................................................................................................... 37
3.3.1 Probenentnahme und Probenaufbereitung .................................................................. 37
3.3.2 Anfertigung und Färbung der Schnitte........................................................................ 37
3.3.3 Lichtmikroskopische Auswertung und Kategorisierung............................................. 37
3.4 Immunhistologische Methoden ....................................................................................... 39
3.4.1 Immunhistologische Kontrollen.................................................................................. 39
3.4.2 Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen............................................. 39
3.5 Statistische Untersuchungen ........................................................................................... 41
4 ERGEBNISSE....................................................................................................... 42
4.1 Allgemeine histopathologische Befunderhebung im eigenen Untersuchungsgut....... 42
4.1.1 Gruppeneinteilung der Stuten mit einer Endometrose ................................................ 43
4.1.2 Prävalenz der Endometrose im Untersuchungsgut...................................................... 44
4.1.3 Endometrose und Endometritis ................................................................................... 46
4.1.4 Endometrose und Angiosklerose................................................................................. 46
V
4.1.5 Endometrose und Perivaskulitis.................................................................................. 46
4.1.6 Kategorisierung ........................................................................................................... 46
4.2 Histomorphologische Charakteristika der Endometrose im eigenen
Untersuchungsgut unter Berücksichtigung der anamnestischen Daten ..................... 48
4.2.1 Aktive Endometrose.................................................................................................... 51
4.2.2 Inaktive Endometrose.................................................................................................. 52
4.2.3 Gemischte Endometrose.............................................................................................. 53
4.2.4 Aktive destruierende Endometrose ............................................................................. 53
4.2.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................... 54
4.2.6 Gemischte destruierende Endometrose ....................................................................... 54
4.3 Gruppenspezifischer Vergleich zwischen Stuten mit einer Endometrose und
Stuten mit einer Endometrose und Endometritis ......................................................... 55
4.4 Immunhistologische Untersuchungen der unterschiedlichen Erscheinungsformen
der Endometrose im eigenen Untersuchungsgut........................................................... 58
4.4.1 Immunhistologische Ergebnisse der Steroidhormonrezeptor-Analyse.................... 58
4.4.1.1 Aktive Endometrose................................................................................................. 58
4.4.1.2 Inaktive Endometrose............................................................................................... 59
4.4.1.3 Gemischte Endometrose........................................................................................... 60
4.4.1.4 Aktive destruierende Endometrose .......................................................................... 61
4.4.1.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................ 61
4.4.1.6 Gemischte destruierende Endometrose .................................................................... 62
4.4.2 Immunhistologische Ergebnisse zum Nachweis der endometrial synthetisierten
Proteine..................................................................................................................... 64
4.4.2.1 Aktive Endometrose................................................................................................. 64
4.4.2.2 Inaktive Endometrose............................................................................................... 66
4.4.2.3 Gemischte Endometrose........................................................................................... 67
4.4.2.4 Aktive destruierende Endometrose .......................................................................... 69
4.4.2.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................ 70
4.4.2.6 Gemischte destruierende Endometrose .................................................................... 71
VI
4.5 Gruppenspezifischer Vergleich der immunhistologischen Ergebnisse zwischen Stuten
mit einer Endometrose und Stuten mit einer Endometrose und Endometritis ... 73
4.6 Vergleichende Zusammenfassung der histopathologischen und immunhistologischen
Befunde unter Berücksichtigung der anamnestischen Daten ........................ 78
5 DISKUSSION ........................................................................................................ 82
5.1 Ziele der Arbeit................................................................................................................. 82
5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsmaterials und der Untersuchungsmethoden
........................................................................................................................... 82
5.3 Die equine Endometrose .................................................................................................. 83
5.3.1 Allgemeine Betrachtungen zur Endometrose.............................................................. 83
5.3.2 Morphologie der Endometrose.................................................................................... 84
5.3.3 Einflussfaktoren auf die Endometrose ........................................................................ 87
5.3.4 Kategorisierung ........................................................................................................... 88
5.3.5 Veränderungen im sekretorischen Proteinmuster im Rahmen der Endometrose........ 90
5.3.6 Mögliche Konsequenzen eines defizienten Proteinmusters auf die Fertilität ............. 94
6 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................ 97
7 SUMMARY............................................................................................................ 99
8 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................101
9 ANHANG..............................................................................................................112
9.1 Charakterisierung des Tiergutes mit einer Endometrose .......................................... 112
9.2 Für die Immunhistologie verwendete Antikörper, Seren und Positivkontrollen..... 115
9.3 Verfahrensschritte der immunhistologischen Untersuchungen ................................ 118
9.3.1 Vorbehandlung .......................................................................................................... 118
VII
9.3.2 Besondere Verfahren................................................................................................. 118
9.3.3 Antigennachweis mittels monoklonaler AK nach der PAP-Methode....................... 119
9.3.4 Antigennachweis mittels polyklonaler AK nach der PAP-Methode......................... 119
9.3.5 Standard zur Nachbehandlung .................................................................................. 120
9.3.6 Lösungen und Puffer ................................................................................................. 120
9.4 Bilddokumentatio
Morphologisch-funktionelle Untersuchungen zur prognostischen Bewertung der equinen Endometrose
Ziel der Studie war die morphologisch-funktionelle Charakterisierung der Endometrose mittels konventioneller histopathologischer und neuer immunhistologischer Methoden. Die Ergebnisse wurden mit den Abfohlraten der untersuchten Stuten verglichen, um eine genauere
Prognose hinsichtlich der Fertilität zu erhalten.
Innerhalb der physiologischen Decksaison wurden von 159 klinisch gesunden, östrischen Stuten (3 bis 21 Jahre alt) Endometriumbioptate entnommen. Die Stuten wurden danach im selben Jahr besamt und nach Erfassen der Abfohlraten im folgenden Jahr in zwei Gruppen
eingeteilt: güste Stuten und nicht güste Stuten. Im Rahmen einer Doppelblind-Studie wurden endometriale Alterationen lichtmikroskopisch erfasst sowie Grad und Qualität der Endometrose
histomorphologisch definiert. Repräsentativ ausgewählte Bioptate (n=82) wurden immunhistologisch auf die Expression der Steroidhormonrezeptoren (Östrogenrezeptor, ER; Progesteronrezeptor, PR) und ausgewählter endometrialer Proteine (Uteroglobin, UG; Uterokalin, UK; CalbindinD9k, CAL; Uteroferrin, UF) untersucht.
101/159 Stuten zeigen eine, qualitativ und quantitativ variierende, Endometrose. Die fibrotischen Uterindrüsen weisen, im Vergleich zu unveränderten Drüsen, ein zyklusasynchrones, teilweise innerhalb eines Drüsenquerschnittes ungleichmäßiges endometriales Proteinmuster auf. Das ungleichmäßige Expressionsmuster kann als Zeichen einer endometrialen Fehldifferenzierung innerhalb fibrotischer Areale interpretiert werden. Die Aktivität der Endometrose hat keinen Einfluss auf das endometriale Proteinmuster. Güste Stuten besitzen häufiger einemittelgradige, vorwiegend destruierende, inaktive oder gemischte Endometrose. Insbesondere in Arealen mittelgradiger destruierender Endometrosen ist eine deutlich verminderte Expression
von UG und UK nachweisbar. Auch in der geringgradigen Endometrose werden häufiger beide Proteine gleichzeitig zyklusasynchron exprimiert. UF wird innerhalb höhergradiger destruierender fibrotischer Herde überweigend intensiver exprimiert als in den unveränderten
Epithelien, während CAL vielfach ein variables Proteinmuster besitzt. Nicht güste Stuten hingegen zeigen häufig eine geringgradige aktive oder inaktive Endometrose. Bei diesen Stuten weist ein hoher Anteil betroffener glandulärer Epithelien in der mittelgradigen Endometrose
entweder eine zyklussynchrone oder geringgradig zyklusasynchrone Expression von UG, UK und CAL auf. UF wird auch in dieser Gruppe häufig intensiver in fibrotischen Drüsen exprimiert. Zwischen güsten und nicht güsten Stuten bestehen charakteristische Unterschiede im Expressionsmuster von UG und UK: nicht güste Stuten besitzen in gering- und mittelgradig fibrotisch veränderten Uterindrüsen häufiger eine zyklussynchrone Proteinexpression als güste Stuten und seltener deutliche Abweichungen in der Expression von entweder UG oder UK.
Stuten beider Gruppen besitzen eine zyklusasynchrone Expression der ER und PR sowohl in den periglandulären fibrotischen Stromazellen als auch im Drüsenepithel. Die glanduläre Hormonrezeptorexpression ist tendenziell abhängig von der Aktivität der Endometrose. Diese
Resultate sprechen für eine Abkopplung fibrotischer Areale von den uterinen Kontrollmechanismen. Im Rahmen dieser Studie konnte überwiegend bei güsten Stuten in der Endometrose, im Vergleich
zu unveränderten Drüsen, ein deutlich abweichendes endometriales Proteinmuster von UG und UK dargestellt werden. Insbesondere bei Tieren, die an einer mittelgradigen destruierenden Endometrose leiden, könnte diese Tatsache als Hinweis auf eine fertilitätsmindernde
Beeinflussung des uterinen Mikromilieus im Rahmen der Endometrose interpretiert werden.
Die vorliegende Untersuchung unterstreicht die Notwendigkeit einer genaueren Klassifizierung der Endometrose und empfiehlt, zusätzlich zum Grad auch die Qualität der Endometrose sowie das endometriale Expressionsmuster von UG und UK in der Epikrise für eine präzisere
Fertilitätsprognose zu berücksichtigen.:1 EINLEITUNG........................................................................................................... 1
2 LITERATURÜBERSICHT ....................................................................................... 2
2.1 Fertilität in der Pferdezucht.............................................................................................. 2
2.2 Die Endometriumbiopsie bei der Stute ............................................................................ 4
2.2.1 Indikationen................................................................................................................... 4
2.2.2 Repräsentativität............................................................................................................ 4
2.2.3 Kategorisierung ............................................................................................................. 5
2.3 Der Sexualzyklus der Stute................................................................................................ 7
2.3.1 Allgemeine Betrachtungen............................................................................................ 7
2.3.2 Histomorphologie des Endometriums in den Zyklusphasen......................................... 9
2.3.3 Regulation des endometrialen Zyklus......................................................................... 12
2.3.4 Immunhistologische Untersuchungen zur Expression der Östrogen- und
Progesteronrezeptoren am Endometrium der Stute im Zyklusverlauf ........................ 13
2.4 Sekretorische Aktivitäten des Uterus ............................................................................. 15
2.4.1 Allgemeine Betrachtung........................................................................................... 15
2.4.2 Endometriale Proteine .............................................................................................. 16
2.4.2.1 Uteroglobin............................................................................................................... 16
2.4.2.2 Uteroferrin................................................................................................................ 17
2.4.2.3 Uterokalin................................................................................................................. 18
2.4.2.4 CalbindinD9k ............................................................................................................. 19
2.4.2.5 Regulation der endometrialen Proteine.................................................................... 19
2.4.2.6 Die endometrialen Proteine im Zyklusverlauf bei der Stute.................................... 21
2.4.2.7 Die endometrialen Proteine während der Gravidität bei der Stute .......................... 22
2.5 Die equine Endometrose .................................................................................................. 24
IV
2.5.1 Allgemeine Betrachtungen....................................................................................... 24
2.5.2 Histomorphologische und elektronenmikroskopische Untersuchungen der
Endometrose............................................................................................................. 25
2.5.3 Immunhistologische Untersuchungen der Endometrose.......................................... 29
2.5.3.1 Östrogen- und Progesteronrezeptoren...................................................................... 29
2.5.3.2 Sekretorische Proteine.............................................................................................. 30
2.5.4 Die Endometrose während der Gravidität und im Puerperium................................ 31
2.5.5 Mögliche Einflussfaktoren auf die Endometrose ..................................................... 32
2.5.6 Ansätze zur Ätiologie und Pathogenese der Endometrose ...................................... 33
3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN ................................................................. 36
3.1 Tiergut und Probenherkunft........................................................................................... 36
3.2 Nähere Charakterisierung des Tiergutes....................................................................... 36
3.3 Methoden.......................................................................................................................... 37
3.3.1 Probenentnahme und Probenaufbereitung .................................................................. 37
3.3.2 Anfertigung und Färbung der Schnitte........................................................................ 37
3.3.3 Lichtmikroskopische Auswertung und Kategorisierung............................................. 37
3.4 Immunhistologische Methoden ....................................................................................... 39
3.4.1 Immunhistologische Kontrollen.................................................................................. 39
3.4.2 Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen............................................. 39
3.5 Statistische Untersuchungen ........................................................................................... 41
4 ERGEBNISSE....................................................................................................... 42
4.1 Allgemeine histopathologische Befunderhebung im eigenen Untersuchungsgut....... 42
4.1.1 Gruppeneinteilung der Stuten mit einer Endometrose ................................................ 43
4.1.2 Prävalenz der Endometrose im Untersuchungsgut...................................................... 44
4.1.3 Endometrose und Endometritis ................................................................................... 46
4.1.4 Endometrose und Angiosklerose................................................................................. 46
V
4.1.5 Endometrose und Perivaskulitis.................................................................................. 46
4.1.6 Kategorisierung ........................................................................................................... 46
4.2 Histomorphologische Charakteristika der Endometrose im eigenen
Untersuchungsgut unter Berücksichtigung der anamnestischen Daten ..................... 48
4.2.1 Aktive Endometrose.................................................................................................... 51
4.2.2 Inaktive Endometrose.................................................................................................. 52
4.2.3 Gemischte Endometrose.............................................................................................. 53
4.2.4 Aktive destruierende Endometrose ............................................................................. 53
4.2.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................... 54
4.2.6 Gemischte destruierende Endometrose ....................................................................... 54
4.3 Gruppenspezifischer Vergleich zwischen Stuten mit einer Endometrose und
Stuten mit einer Endometrose und Endometritis ......................................................... 55
4.4 Immunhistologische Untersuchungen der unterschiedlichen Erscheinungsformen
der Endometrose im eigenen Untersuchungsgut........................................................... 58
4.4.1 Immunhistologische Ergebnisse der Steroidhormonrezeptor-Analyse.................... 58
4.4.1.1 Aktive Endometrose................................................................................................. 58
4.4.1.2 Inaktive Endometrose............................................................................................... 59
4.4.1.3 Gemischte Endometrose........................................................................................... 60
4.4.1.4 Aktive destruierende Endometrose .......................................................................... 61
4.4.1.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................ 61
4.4.1.6 Gemischte destruierende Endometrose .................................................................... 62
4.4.2 Immunhistologische Ergebnisse zum Nachweis der endometrial synthetisierten
Proteine..................................................................................................................... 64
4.4.2.1 Aktive Endometrose................................................................................................. 64
4.4.2.2 Inaktive Endometrose............................................................................................... 66
4.4.2.3 Gemischte Endometrose........................................................................................... 67
4.4.2.4 Aktive destruierende Endometrose .......................................................................... 69
4.4.2.5 Inaktive destruierende Endometrose ........................................................................ 70
4.4.2.6 Gemischte destruierende Endometrose .................................................................... 71
VI
4.5 Gruppenspezifischer Vergleich der immunhistologischen Ergebnisse zwischen Stuten
mit einer Endometrose und Stuten mit einer Endometrose und Endometritis ... 73
4.6 Vergleichende Zusammenfassung der histopathologischen und immunhistologischen
Befunde unter Berücksichtigung der anamnestischen Daten ........................ 78
5 DISKUSSION ........................................................................................................ 82
5.1 Ziele der Arbeit................................................................................................................. 82
5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsmaterials und der Untersuchungsmethoden
........................................................................................................................... 82
5.3 Die equine Endometrose .................................................................................................. 83
5.3.1 Allgemeine Betrachtungen zur Endometrose.............................................................. 83
5.3.2 Morphologie der Endometrose.................................................................................... 84
5.3.3 Einflussfaktoren auf die Endometrose ........................................................................ 87
5.3.4 Kategorisierung ........................................................................................................... 88
5.3.5 Veränderungen im sekretorischen Proteinmuster im Rahmen der Endometrose........ 90
5.3.6 Mögliche Konsequenzen eines defizienten Proteinmusters auf die Fertilität ............. 94
6 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................ 97
7 SUMMARY............................................................................................................ 99
8 LITERATURVERZEICHNIS .................................................................................101
9 ANHANG..............................................................................................................112
9.1 Charakterisierung des Tiergutes mit einer Endometrose .......................................... 112
9.2 Für die Immunhistologie verwendete Antikörper, Seren und Positivkontrollen..... 115
9.3 Verfahrensschritte der immunhistologischen Untersuchungen ................................ 118
9.3.1 Vorbehandlung .......................................................................................................... 118
VII
9.3.2 Besondere Verfahren................................................................................................. 118
9.3.3 Antigennachweis mittels monoklonaler AK nach der PAP-Methode....................... 119
9.3.4 Antigennachweis mittels polyklonaler AK nach der PAP-Methode......................... 119
9.3.5 Standard zur Nachbehandlung .................................................................................. 120
9.3.6 Lösungen und Puffer ................................................................................................. 120
9.4 Bilddokumentatio
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