Perinnöllinen hemokromatoosi, HFE-geenin C282Y- ja H63D -mutaatioiden osoitusmenetelmän koekäyttö, optimointi ja työohjeen laadinta

Perinnöllinen hemokromatoosi on autosomissa periytyvä raudan imeytymishäiriö, jossa elimistöön kertyy ylimääräistä rautaa. Se aiheutuu yleisimmin HFE-geenissä tapahtuvista C282Y- ja H63D -mutaatioista, joissa emäsmuutokset tapahtuvat nukleotideissä 845 ja 187. Emäsmuutos nukleotidissä 845 (G845A) aiheuttaa kysteiinin korvautumisen tyrosiinilla aminohappopaikassa 282 ja emäsmuutos nukleotidissa 187 (C187G) aiheuttaa histidiinin korvautumisen asparagiinihapolla paikassa 63. Hemokromatoosia aiheuttavat mutaatiot osoitetaan usein polymeraasiketjureaktioon (PCR) perustuvilla menetelmillä, joissa tiettyä osaa geenistä monistetaan tunnettujen alukkeiden ja DNA:ta monistavan polymeraasientsyymin avulla. PCR-tuotteiden ja niihin lisättyjen restriktioentsyymien seosta inkuboidaan entsyymien vaatimissa lämpötiloissa. Mutaatiot aiheuttavat DNA:ssa restriktioentyymien tunnistuskohtien häviämistä tai niiden lisääntymistä. Restriktioentsyymien pilkkomat DNA-jaksot saadaan esille agaroosigeelielektroforeesilla. Opinnäytetyö tehtiin Tampereen ammattikorkeakoululle, jossa sen tuotoksena valmistunutta työohjetta voidaan käyttää bioanalytiikan ja laboratorioalan koulutusohjelmien harjoitustöissä ja syventävillä opintojaksoilla. Opinnäytetyön tarkoituksena oli koekäyttää hemokromatoosia aiheuttavien mutaatioiden osoittamiseen käytettävä kaupallinen työohje, optimoida restriktiofragmenttien pituuspolymorfia-analyysiin perustuva menetelmä sekä laatia toimiva ja selkeä suomenkielinen työohje. Koekäytön ja menetelmäoptimoinnin aikana havaitut alkuperäisen työohjeen epäjohdonmukaisuudet korjattiin ja menetelmä saatiin toimimaan toivotulla tavalla. Samalla menetelmään tehtiin muutoksia, jotka tuovat säästöjä reagenssikuluihin. Tuotoksena valmistui työohje, jonka avulla opiskelijat pystyvät itsenäisesti suorittamaan menetelmän eri vaiheet. Jatkotutkimuksena menetelmää voisi kehittää edelleen korvaamalla polymeraasientsyymin edullisemmalla vaihtoehdolla ja optimoimalla sille polymeraasiketjureaktio-ohjelma. Samalla menetelmän digestiovaiheessa voisi kokeilla lyhyempiä digestioaikoja.Hereditary haemochromatosis is an autosomal recessive disorder of iron metabolism in which the body accumulates too much iron. It is most commonly caused by two mutations in the HFE-gene, namely C282Y and H63D. Both of these mutations cause a single amino acid to be replaced with another one, resulting in a conformation change in the HFE-protein encoded by the gene. The mutations causing haemochromatosis are often detected with a process called restriction fragment length polymorphism analysis (RFLP). The method is based on polymerase chain reaction (PCR), which amplifies the mutated part of a specific gene. A mutation can either create a new restriction enzyme recognition site, or delete one, and this can be detected after restriction enzyme digestion with gel electrophoresis. This thesis was made for Tampere University of Applied Sciences, where the work instruction can be used in student laboratory practice. The aim of the study was to test an existing method for detecting the mutations, to optimize it and to establish a new, functioning and easy-to-use instruction in Finnish. A few problems of the original instruction were corrected, and also some changes were made to it that will cut down reagent expenses. As a product of this thesis a new instruction was established that can be used by students to perform all stages of the method independently. The method could be developed further by replacing the polymerase enzyme with a less expensive one, and by optimizing a new polymerase chain reaction program for it. At the same time shorter incubation times could be tested in the restriction digestion