Dizajnerski proteini

Proteini su sastavni dio živog svijeta te su s vremenom postali i ključan dio industrije čovječanstva. Potreba za dodavanjem novih svojstava i poboljšavanjem postojećih proteina rodila je novu granu biokemije – proteinsko inženjerstvo. Proteinsko inženjerstvo ima dvije glavne grane stvaranja novih proteina – racionalni dizajn i nasumična mutageneza. Racionalni dizajn je elegantnija metoda koja daje manje varijanti proteina, no zahtijeva više informacija o samom proteinu. Nasumična mutageneza metoda je koja se koristi kada imamo manje informacija o strukturi i funkciji proteina, no ona daje puno više mutiranih varijanti koje onda zahtijevaju temeljito pretraživanje. Kada se primjenjuje metoda nasumične mutageneze nužno je unaprijed odabrati željena svojstva koje protein mora imati kako bi se olakšalo pretraživanje velikog broja dobivenih proteinskih varijatni. Nove varijante proteina dobivene proteinskim inženjerstvom često se koriste za istraživanje odnosa strukture i funkcije proteina. Osim toga, nove varijante proteina često imaju poboljšana svojstva koja su važna za njihovu industrijsku primjenu. Organska sinteza takoĎer je grana koja je prosperirala od uporabe modificiranih proteina kao alat koji olakšava regioselektivne sinteze. Osim široke primjene u industriji, danas se razvijaju i sasvim umjetni proteini čija se namjena tek istražuje. Za dizajniranje tih novih, sasvim umjetnih proteina, donesena su pravila koja omogućuju dizajniranje mnogo stabilnijih proteina koji se mogu koristiti i kao nova vrsta materijala

Temporal stability of human plasma and immunoglobulin G N-glycomes

Glikozilacija je proces koji se nalazi pod značajnom genskom kontrolom te je najmanje 10% ljudskog genoma posredno zaduženo za stvaranje širokog spektra glikanskih struktura. Prijašnja znanstvena istraživanja pokazala su da glikozilacija proteina može biti promijenjena pod utjecajem okolišnih faktora, primjerice pušenja, ali i različitih akutnih i kroničnih upalnih stanja te malignih oboljenja. Stoga je važno proučiti da li se N-glikom krvne plazme i N-glikom imunoglobulina G (IgG) zdrave osobe mijenjaju kroz kraći vremenski period, što je ujedno bila i tema ovog diplomskog rada. U ispitivanju je bilo uključeno pet zdravih muškaraca i pet zdravih žena, kojima je tri puta tijekom deset dana, uzeta krv na antikoagulans (EDTA). Krvna plazma odvojena je centrifugiranjem te je iz nje, uz pomoć monolita s proteinom G, izoliran IgG. N-glikani proteina krvne plazme i IgG, oslobođeni su s proteina enzimom PNGaza F i fluorescentno obilježeni 2-aminobenzamidom, nakon čega su analizirani tekućinskom kromatografijom ultra-visoke djelotvornosti, bazirane na kromatografiji hidrofilnih interakcija (UPLC-HILIC). Dobiveni kromatogrami, koji predstavljaju profil N-glikana krvne plazme, podijeljeni su na 39 kromatografskih vršaka, a oni koji predstavljaju profil N-glikana IgG, na 24 kromatografska vrška odnosno pika. Količina glikana unutar svakog pika izračunata je kao postotak (%) od ukupne integrirane površine. Analizom dobivenih podataka, uočeno je da N-glikom krvne plazme, tijekom deset dana, pokazuje vrlo dobru stabilnost kod muškaraca. Kod žena je promjena izraženija te je smjer promjene izrazito individualan i neovisan o fazi menstruacijskog ciklusa. N-glikom IgG izrazito je stabilan kod većine ispitanih osoba, a najveća promjena uočena je kod dvije ženske osobe. One su se u danim trenucima nalazile u različitim fazama menstruacijskog ciklusa, što se moglo odraziti na opažen suprotan smjer promjene istih glikanskih struktura i deriviranih parametra. Ova studija stoga može poslužiti kao predložak za neka daljnja i opsežnija istraživanja vremenske stabilnosti N-glikoma plazme i IgG, na većem broju ispitanika, uz veći broj ponavljanja, kako bi se utvrdila moguća statistička značajnost uočenih promjena i potencijalna povezanost s pojedinom fazom menstruacijskog ciklusa kod žena.Glycosylation is a process that is under significant genetic control and at least 10% of human genome is indirectly responsible for creating a wide range of different glycan structures. Past studies showed that glycosylation can be altered during acute and chronic inflammatory diseases, carcinomas or as a consequence of environmental influence, like smoking. Thus, it is important to study temporal stability of N-glycan profiles in human plasma and immunoglobuline G (IgG), which was also the aim of this thesis. In this work five healthy male and five healthy female individuals were included. Blood was taken three times trough ten days in epruvetes containing anticoagulant (EDTA) and plasma was separated by centrifugation. IgG was isolated using Protein G monolithic plate. N-glycans were released using PNGase F enzyme and fluorescently labeled with 2-aminobenzamide. Fluorescently labeled N-glycans were separated by ultra performance liquid chromatography, based on hydrophilic interaction chromatography (UPLC-HILIC). The chromatograms obtained were all seperated in the same manner into 39 peaks, for human plasma N-glycome, and 24 peaks for IgG N-glycome. The amount of glycans in each peak was expressed as percentage (%) of total integrated area. The analysis indicated very good temporal stability of human plasma N-glycome in male individuals. The changes were more pronounced in female individuals, but the direction of changes were extremely individual. IgG N-glycome indicated pronounced temporal stability in most individuals and the biggest changes in glycosylation were observed in two female individuals. They were in different stages of menstrual cycle and the observed changes in glycosylation were in the opposite direction for the same glycan structures and derived traits in both female individuals. This work can serve as a template for more extensive studies of temporal stability of human plasma and IgG N-glycome in the future, with more samples, to determine possible statistical significance of changes in protein glycosylation

Temporal stability of human plasma and immunoglobulin G N-glycomes

Glikozilacija je proces koji se nalazi pod značajnom genskom kontrolom te je najmanje 10% ljudskog genoma posredno zaduženo za stvaranje širokog spektra glikanskih struktura. Prijašnja znanstvena istraživanja pokazala su da glikozilacija proteina može biti promijenjena pod utjecajem okolišnih faktora, primjerice pušenja, ali i različitih akutnih i kroničnih upalnih stanja te malignih oboljenja. Stoga je važno proučiti da li se N-glikom krvne plazme i N-glikom imunoglobulina G (IgG) zdrave osobe mijenjaju kroz kraći vremenski period, što je ujedno bila i tema ovog diplomskog rada. U ispitivanju je bilo uključeno pet zdravih muškaraca i pet zdravih žena, kojima je tri puta tijekom deset dana, uzeta krv na antikoagulans (EDTA). Krvna plazma odvojena je centrifugiranjem te je iz nje, uz pomoć monolita s proteinom G, izoliran IgG. N-glikani proteina krvne plazme i IgG, oslobođeni su s proteina enzimom PNGaza F i fluorescentno obilježeni 2-aminobenzamidom, nakon čega su analizirani tekućinskom kromatografijom ultra-visoke djelotvornosti, bazirane na kromatografiji hidrofilnih interakcija (UPLC-HILIC). Dobiveni kromatogrami, koji predstavljaju profil N-glikana krvne plazme, podijeljeni su na 39 kromatografskih vršaka, a oni koji predstavljaju profil N-glikana IgG, na 24 kromatografska vrška odnosno pika. Količina glikana unutar svakog pika izračunata je kao postotak (%) od ukupne integrirane površine. Analizom dobivenih podataka, uočeno je da N-glikom krvne plazme, tijekom deset dana, pokazuje vrlo dobru stabilnost kod muškaraca. Kod žena je promjena izraženija te je smjer promjene izrazito individualan i neovisan o fazi menstruacijskog ciklusa. N-glikom IgG izrazito je stabilan kod većine ispitanih osoba, a najveća promjena uočena je kod dvije ženske osobe. One su se u danim trenucima nalazile u različitim fazama menstruacijskog ciklusa, što se moglo odraziti na opažen suprotan smjer promjene istih glikanskih struktura i deriviranih parametra. Ova studija stoga može poslužiti kao predložak za neka daljnja i opsežnija istraživanja vremenske stabilnosti N-glikoma plazme i IgG, na većem broju ispitanika, uz veći broj ponavljanja, kako bi se utvrdila moguća statistička značajnost uočenih promjena i potencijalna povezanost s pojedinom fazom menstruacijskog ciklusa kod žena.Glycosylation is a process that is under significant genetic control and at least 10% of human genome is indirectly responsible for creating a wide range of different glycan structures. Past studies showed that glycosylation can be altered during acute and chronic inflammatory diseases, carcinomas or as a consequence of environmental influence, like smoking. Thus, it is important to study temporal stability of N-glycan profiles in human plasma and immunoglobuline G (IgG), which was also the aim of this thesis. In this work five healthy male and five healthy female individuals were included. Blood was taken three times trough ten days in epruvetes containing anticoagulant (EDTA) and plasma was separated by centrifugation. IgG was isolated using Protein G monolithic plate. N-glycans were released using PNGase F enzyme and fluorescently labeled with 2-aminobenzamide. Fluorescently labeled N-glycans were separated by ultra performance liquid chromatography, based on hydrophilic interaction chromatography (UPLC-HILIC). The chromatograms obtained were all seperated in the same manner into 39 peaks, for human plasma N-glycome, and 24 peaks for IgG N-glycome. The amount of glycans in each peak was expressed as percentage (%) of total integrated area. The analysis indicated very good temporal stability of human plasma N-glycome in male individuals. The changes were more pronounced in female individuals, but the direction of changes were extremely individual. IgG N-glycome indicated pronounced temporal stability in most individuals and the biggest changes in glycosylation were observed in two female individuals. They were in different stages of menstrual cycle and the observed changes in glycosylation were in the opposite direction for the same glycan structures and derived traits in both female individuals. This work can serve as a template for more extensive studies of temporal stability of human plasma and IgG N-glycome in the future, with more samples, to determine possible statistical significance of changes in protein glycosylation

Dizajnerski proteini

Proteini su sastavni dio živog svijeta te su s vremenom postali i ključan dio industrije čovječanstva. Potreba za dodavanjem novih svojstava i poboljšavanjem postojećih proteina rodila je novu granu biokemije – proteinsko inženjerstvo. Proteinsko inženjerstvo ima dvije glavne grane stvaranja novih proteina – racionalni dizajn i nasumična mutageneza. Racionalni dizajn je elegantnija metoda koja daje manje varijanti proteina, no zahtijeva više informacija o samom proteinu. Nasumična mutageneza metoda je koja se koristi kada imamo manje informacija o strukturi i funkciji proteina, no ona daje puno više mutiranih varijanti koje onda zahtijevaju temeljito pretraživanje. Kada se primjenjuje metoda nasumične mutageneze nužno je unaprijed odabrati željena svojstva koje protein mora imati kako bi se olakšalo pretraživanje velikog broja dobivenih proteinskih varijatni. Nove varijante proteina dobivene proteinskim inženjerstvom često se koriste za istraživanje odnosa strukture i funkcije proteina. Osim toga, nove varijante proteina često imaju poboljšana svojstva koja su važna za njihovu industrijsku primjenu. Organska sinteza takoĎer je grana koja je prosperirala od uporabe modificiranih proteina kao alat koji olakšava regioselektivne sinteze. Osim široke primjene u industriji, danas se razvijaju i sasvim umjetni proteini čija se namjena tek istražuje. Za dizajniranje tih novih, sasvim umjetnih proteina, donesena su pravila koja omogućuju dizajniranje mnogo stabilnijih proteina koji se mogu koristiti i kao nova vrsta materijala

Dizajnerski proteini

Proteini su sastavni dio živog svijeta te su s vremenom postali i ključan dio industrije čovječanstva. Potreba za dodavanjem novih svojstava i poboljšavanjem postojećih proteina rodila je novu granu biokemije – proteinsko inženjerstvo. Proteinsko inženjerstvo ima dvije glavne grane stvaranja novih proteina – racionalni dizajn i nasumična mutageneza. Racionalni dizajn je elegantnija metoda koja daje manje varijanti proteina, no zahtijeva više informacija o samom proteinu. Nasumična mutageneza metoda je koja se koristi kada imamo manje informacija o strukturi i funkciji proteina, no ona daje puno više mutiranih varijanti koje onda zahtijevaju temeljito pretraživanje. Kada se primjenjuje metoda nasumične mutageneze nužno je unaprijed odabrati željena svojstva koje protein mora imati kako bi se olakšalo pretraživanje velikog broja dobivenih proteinskih varijatni. Nove varijante proteina dobivene proteinskim inženjerstvom često se koriste za istraživanje odnosa strukture i funkcije proteina. Osim toga, nove varijante proteina često imaju poboljšana svojstva koja su važna za njihovu industrijsku primjenu. Organska sinteza takoĎer je grana koja je prosperirala od uporabe modificiranih proteina kao alat koji olakšava regioselektivne sinteze. Osim široke primjene u industriji, danas se razvijaju i sasvim umjetni proteini čija se namjena tek istražuje. Za dizajniranje tih novih, sasvim umjetnih proteina, donesena su pravila koja omogućuju dizajniranje mnogo stabilnijih proteina koji se mogu koristiti i kao nova vrsta materijala

Managing customer relationship

The paper points out the key market changes in the first decades of the twenty-first century and their implications on business philosophy, concepts, principles and techniques of relationship marketing from the point of making strategic marketing decisions. In that context points are made to the important role of developing customer relationship management (CRM), highlighting the effectiveness of a combination of the CRM and the customer experience management (CEM) models. One of the important aspects of that relationship is reflected in the fact that CRM tells us what the customer has done, whereas CEM can tell us why he/she has done it. Consequently, CEM can vastly improve the power of CRM to predict future customer behaviour. Successful implementation of CRM concepts implies: excellent understanding of the field of activity and competition; knowledge of customers; market-oriented thinking; an integrated approach to managing channels of communication and sales; and finally, a database development. In this paper we have also presented the CRM value chain as a model which businesses can follow when developing and implementing their CRM strategies and the related CRM diamond model, based on strong theoretical principles and practical requirements of business

Anti-TNF Biologicals Enhance the Anti-Inflammatory Properties of IgG N-Glycome in Crohn's Disease

Crohn’s disease (CD) is a chronic inflammation of the digestive tract that significantly impairs patients’ quality of life and well-being. Anti-TNF biologicals revolutionised the treatment of CD,yet many patients do not adequately respond to such therapy. Previous studies have demonstrated apro-inflammatory pattern in the composition of CD patients’ immunoglobulin G (IgG) N-glycomecompared to healthy individuals. Here, we utilised the high-throughput UHPLC method for N-glycan analysis to explore the longitudinal effect of the anti-TNF drugs infliximab and adalimumabon N-glycome composition of total serum IgG in 198 patients, as well as the predictive potential ofIgG N-glycans at baseline to detect primary non-responders to anti-TNF therapy in 1315 patients. Wediscovered a significant decrease in IgG agalactosylation and an increase in monogalactosylation,digalactosylation and sialylation during the 14 weeks of anti-TNF treatment, regardless of therapyresponse, all of which suggested a diminished inflammatory environment in CD patients treated withanti-TNF therapy. Furthermore, we observed that IgG N-glycome might contain certain informationregarding the anti-TNF therapy outcome before initiating the treatment. However, it is impossible to predict future primary non-responders to anti-TNF therapy based solely on IgG N-glycomecomposition at baseline

Minimal B Cell Extrinsic IgG Glycan Modifications of Pro- and Anti-Inflammatory IgG Preparations in vivo

Select residues in the biantennary sugar moiety attached to the fragment crystallizable of immunoglobulin G (IgG) antibodies can modulate IgG effector functions. Thus, afucosylated IgG glycovariants have enhanced cytotoxic activity, whereas IgG glycovariants rich in terminal sialic acid residues can trigger anti-inflammatory effects. More recent evidence suggests that terminal α2,6 linked sialic acids can be attached to antibodies post IgG secretion. These findings raise concerns for the use of therapeutic antibodies as they may change their glycosylation status in the patient and hence affect their activity. To investigate to what extent B cell extrinsic sialylation processes modify therapeutic IgG preparations in vivo, we analyzed changes in human intravenous IgG (IVIg) sialylation upon injection in mice deficient in B cells or in mice lacking the sialyltransferase 1, which catalyzes the addition of α2,6 linked sialic acid residues. By performing a time course of IgG glycan analysis with HILIC-UPLC-FLR (plus MS) and xCGE-LIF our study suggests that therapeutic IgG glycosylation is stable upon injection in vivo. Only a very small fraction of IgG molecules acquired sialic acid structures predominantly in the Fab- but not the Fc-portion upon injection in vivo, suggesting that therapeutic antibody glycosylation will remain stable upon injection in vivo

Interdisciplinary investigation of the human dipeptidyl peptidase III mutants R620C, R623W and R623L

Ljudska dipeptidil–peptidaza III (hDPP III) uz katalitičku aktivnost cijepanja dipeptida s N–kraja oligopeptida ima ulogu regulacije Keap1–Nrf2 signalnog puta. Keap1 protein veže Nrf2, transkripcijski faktor ključan za antioksidativni odgovor stanice te ga usmjerava prema ubikvitinaciji. Interakcija između domene Kelch proteina Keap1 i faktora Nrf2 ostvaruje se preko ETGE motiva na Nrf2, a isti motiv sadrži hDPP III. Dokazano je da vezanje hDPP III za Keap1 sprječava deaktivaciju Nrf2 što rezultira pojačanom ekspresijom antioksidativnih gena. Nemogućnost deaktivacije faktora Nrf2 povećava otpornost prema antitumorskim terapijama. Na internetskom portalu za genomiku raka cBioPortal nalaze se genomske sekvence mutanata hDPP III pronađene u stanicama raka. U ovom radu, istraživan je utjecaj tri supstitucije iz navedene baze, R620C, R623L i R623W na peptidaznu aktivnost i interakciju hDPP III s proteinom Keap1. U istraživanjima su korištene biokemijske i biofizičke metode, te molekulsko dinamičke simulacije divljeg tipa proteina i mutanta R623W.Besides the catalytic activity of cleaving dipeptides from the N-terminus of oligopeptides, human dipeptidyl peptidase III (hDPP III) has a role in regulation of the Keap1-Nrf2 signaling pathway which is a part of the cell's response to oxidative stress. Human DPP III competes with Nrf2 for binding to Keap1 through its ETGE motif. Keap1 directs Nrf2 to ubiqutination but binding of hDPP III to Keap1 hinder Nrf2 deactivation resulting in higher expression of antioxidative genes. A consequence of Nrf2 activation in tumor cells is the increased resistance to antitumor therapies. On the portal for cancer genomics (cBio Portal) genome sequences of the following hDPPP III mutants were found and chosen for further investigation: R620C, R623L and R623W. The influence of these mutations on both the peptidase activity and the interaction with Keap1 was investigated by biochemical and biophysical methods, as well as molecular dynamics simulations

Interdisciplinary investigation of the human dipeptidyl peptidase III mutants R620C, R623W and R623L

Ljudska dipeptidil–peptidaza III (hDPP III) uz katalitičku aktivnost cijepanja dipeptida s N–kraja oligopeptida ima ulogu regulacije Keap1–Nrf2 signalnog puta. Keap1 protein veže Nrf2, transkripcijski faktor ključan za antioksidativni odgovor stanice te ga usmjerava prema ubikvitinaciji. Interakcija između domene Kelch proteina Keap1 i faktora Nrf2 ostvaruje se preko ETGE motiva na Nrf2, a isti motiv sadrži hDPP III. Dokazano je da vezanje hDPP III za Keap1 sprječava deaktivaciju Nrf2 što rezultira pojačanom ekspresijom antioksidativnih gena. Nemogućnost deaktivacije faktora Nrf2 povećava otpornost prema antitumorskim terapijama. Na internetskom portalu za genomiku raka cBioPortal nalaze se genomske sekvence mutanata hDPP III pronađene u stanicama raka. U ovom radu, istraživan je utjecaj tri supstitucije iz navedene baze, R620C, R623L i R623W na peptidaznu aktivnost i interakciju hDPP III s proteinom Keap1. U istraživanjima su korištene biokemijske i biofizičke metode, te molekulsko dinamičke simulacije divljeg tipa proteina i mutanta R623W.Besides the catalytic activity of cleaving dipeptides from the N-terminus of oligopeptides, human dipeptidyl peptidase III (hDPP III) has a role in regulation of the Keap1-Nrf2 signaling pathway which is a part of the cell's response to oxidative stress. Human DPP III competes with Nrf2 for binding to Keap1 through its ETGE motif. Keap1 directs Nrf2 to ubiqutination but binding of hDPP III to Keap1 hinder Nrf2 deactivation resulting in higher expression of antioxidative genes. A consequence of Nrf2 activation in tumor cells is the increased resistance to antitumor therapies. On the portal for cancer genomics (cBio Portal) genome sequences of the following hDPPP III mutants were found and chosen for further investigation: R620C, R623L and R623W. The influence of these mutations on both the peptidase activity and the interaction with Keap1 was investigated by biochemical and biophysical methods, as well as molecular dynamics simulations