Temporal stability of human plasma and immunoglobulin G N-glycomes

Abstract

Glikozilacija je proces koji se nalazi pod značajnom genskom kontrolom te je najmanje 10% ljudskog genoma posredno zaduženo za stvaranje širokog spektra glikanskih struktura. Prijašnja znanstvena istraživanja pokazala su da glikozilacija proteina može biti promijenjena pod utjecajem okolišnih faktora, primjerice pušenja, ali i različitih akutnih i kroničnih upalnih stanja te malignih oboljenja. Stoga je važno proučiti da li se N-glikom krvne plazme i N-glikom imunoglobulina G (IgG) zdrave osobe mijenjaju kroz kraći vremenski period, što je ujedno bila i tema ovog diplomskog rada. U ispitivanju je bilo uključeno pet zdravih muškaraca i pet zdravih žena, kojima je tri puta tijekom deset dana, uzeta krv na antikoagulans (EDTA). Krvna plazma odvojena je centrifugiranjem te je iz nje, uz pomoć monolita s proteinom G, izoliran IgG. N-glikani proteina krvne plazme i IgG, oslobođeni su s proteina enzimom PNGaza F i fluorescentno obilježeni 2-aminobenzamidom, nakon čega su analizirani tekućinskom kromatografijom ultra-visoke djelotvornosti, bazirane na kromatografiji hidrofilnih interakcija (UPLC-HILIC). Dobiveni kromatogrami, koji predstavljaju profil N-glikana krvne plazme, podijeljeni su na 39 kromatografskih vršaka, a oni koji predstavljaju profil N-glikana IgG, na 24 kromatografska vrška odnosno pika. Količina glikana unutar svakog pika izračunata je kao postotak (%) od ukupne integrirane površine. Analizom dobivenih podataka, uočeno je da N-glikom krvne plazme, tijekom deset dana, pokazuje vrlo dobru stabilnost kod muškaraca. Kod žena je promjena izraženija te je smjer promjene izrazito individualan i neovisan o fazi menstruacijskog ciklusa. N-glikom IgG izrazito je stabilan kod većine ispitanih osoba, a najveća promjena uočena je kod dvije ženske osobe. One su se u danim trenucima nalazile u različitim fazama menstruacijskog ciklusa, što se moglo odraziti na opažen suprotan smjer promjene istih glikanskih struktura i deriviranih parametra. Ova studija stoga može poslužiti kao predložak za neka daljnja i opsežnija istraživanja vremenske stabilnosti N-glikoma plazme i IgG, na većem broju ispitanika, uz veći broj ponavljanja, kako bi se utvrdila moguća statistička značajnost uočenih promjena i potencijalna povezanost s pojedinom fazom menstruacijskog ciklusa kod žena.Glycosylation is a process that is under significant genetic control and at least 10% of human genome is indirectly responsible for creating a wide range of different glycan structures. Past studies showed that glycosylation can be altered during acute and chronic inflammatory diseases, carcinomas or as a consequence of environmental influence, like smoking. Thus, it is important to study temporal stability of N-glycan profiles in human plasma and immunoglobuline G (IgG), which was also the aim of this thesis. In this work five healthy male and five healthy female individuals were included. Blood was taken three times trough ten days in epruvetes containing anticoagulant (EDTA) and plasma was separated by centrifugation. IgG was isolated using Protein G monolithic plate. N-glycans were released using PNGase F enzyme and fluorescently labeled with 2-aminobenzamide. Fluorescently labeled N-glycans were separated by ultra performance liquid chromatography, based on hydrophilic interaction chromatography (UPLC-HILIC). The chromatograms obtained were all seperated in the same manner into 39 peaks, for human plasma N-glycome, and 24 peaks for IgG N-glycome. The amount of glycans in each peak was expressed as percentage (%) of total integrated area. The analysis indicated very good temporal stability of human plasma N-glycome in male individuals. The changes were more pronounced in female individuals, but the direction of changes were extremely individual. IgG N-glycome indicated pronounced temporal stability in most individuals and the biggest changes in glycosylation were observed in two female individuals. They were in different stages of menstrual cycle and the observed changes in glycosylation were in the opposite direction for the same glycan structures and derived traits in both female individuals. This work can serve as a template for more extensive studies of temporal stability of human plasma and IgG N-glycome in the future, with more samples, to determine possible statistical significance of changes in protein glycosylation