A Sigmoidal Model for the Interpretation of Quantitative PCR (QPCR) Experiments

Real-time or quantitative PCR (qPCR) is the most commonly used technique for estimating the amount of starting nucleic acids in a PCR or RT-PCR reaction. Quantification of PCR product is achieved in real time by measuring the increase in fluorescence of intercalating dyes, labeled primers or oligonucleotides in the presence of double stranded DNA. This amplification curve follows a sigmoid behavior and is used to estimate the relative and/or absolute amount of template using different methods and assumptions. Estimation of C0 normally requires the measurement of a threshold cycle and some assumption about the efficiency of the reaction. An accurate estimation of efficiency is paramount for a precise determination of template levels at time zero. Several non-linear fitting methods have been implemented to model the sigmoid behavior using different empirical models with varying amounts of parameters; however, interpretation of the corresponding parameters is not straightforward. In this paper a model of PCR amplification is deduced and used in the interpretation of qPCR experiments. A non-linear regression analysis of this equation gives a direct estimation of C0 and automatically calculates a parameter k related to the reaction efficiency. This model takes into account non-idealities in the amplification reaction and avoids a priori assumptions about efficiency

Caracterización molecular del Potato virus V (PVV) infectando Solanum phureja mediante secuenciación de nueva generación

Las enfermedades virales son uno de los problemas más limitantes para la producción de papa en el mundo. Uno de los materiales de papa más susceptibles a los virus corresponde a Solanum phureja; sin embargo, en Colombia son pocos los estudios adelantados sobre los agentes causales que lo afectan. En este trabajo se realizó una caracterización molecular del Potato virus V (PVV) infectando plantas de S. phureja en Antioquia, utilizando métodos de secuenciación de nueva generación (NGS), pruebas de DAS-ELISA, RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) y RT-PCR convencional. Los resultados indican la ocurrencia de niveles muy variables de incidencia del virus entre lotes de cultivo (6,7 % a 86 %). El PVV tiene un genoma de 9828 nt que codifica para una poliproteína de 3066 aa y presenta dos variantes principales (Var_A y Var_B) en proporciones de 72 y 28 %. Estas variantes comparten altos niveles de identidad genética (99,7 % en todo el genoma) entre ellas y con respecto a la cepa PVV-Phureja reportada en Colombia, pero no con otras cepas del mundo (82-83 %). Con base en dichos genomas, se diseñaron y evaluaron en muestras foliares de S. phureja, dos pares de cebadores para la detección del virus en pruebas de RT-PCR (459 pb) y RT-qPCR (89 pb, Ct=12,08-21,86 y Tm= 78,7 °C-80,2 °C), confirmándose la presencia de este virus en tejidos sintomáticos y asintomáticos de papa criolla. La ocurrencia generalizada de PVV en los cultivos de S. phureja indica la necesidad de incorporar en los programas de certificación de tubérculos-semilla de S. phureja en Colombia el diagnóstico de este virus.Viral diseases are one of the most limiting problems in the production of potato worldwide. Solanum phureja constitutes one of the most susceptible materials to viral diseases in Colombia; however, there are few studies on viruses infecting this crop. In the current study, we performed a molecular characterization of Potato virus V (PVV) that infects S. phureja, using different potato plots located in the province of Antioquia, using Next-Generation Sequencing (NGS), DAS-ELISA, real time RT-PCR (RT-qPCR) and RT-PCR. Results revealed variable levels of incidence among plots (6.7 %-86 %) and the presence of two slightly different variants (Var_A and Var_B) present in approximately 72 %:28 % ratio. These PVV strains have a genome of 9828 nt codifying for a polyprotein of 3066 aa and share high nucleotide sequence identity (99,7 % in their complete genome) with respect to PVV-Phureja, recently described in Colombia, but are very divergent with respect to currently available PVV genomes (82-83 %). The genome information was used to design two sets of primers, useful in the specific detection of this virus in S. phureja leaf samples through RT-PCR (459 bp) and RT-qPCR (89 bp, Ct=12.08-21.86; Tm=78.7 °C-80.2 °C). This study underscores the importance of including diagnostics of PVV in S. phureja tuber-seed certification programs in Colombia

Pirosecuenciación del Genoma de una Cepa Andina de Potato Virus S (PVS, Carlavirus) Infectando Solanum phureja (Solanaceae) en Colombia

El Potato virus S (PVS) es uno de los virus prevalentes en los cultivos de papa del mundo. En Colombia este virus es de los más incidentes en diferentes variedades de S. tuberosum subsp.andigena y S. phureja. Estudios previos basados en análisis de secuencias del gen de la cápside viral (CP) de aislamientos colombianos de PVS, detectaron la presencia de las dos razas del patógeno (PVSO y PVSA), así como un alto nivel de variación entre aislamientos de PVSA. En esta investigación se secuenció el 98% (8330 nt) del genoma de la cepa RL5 de PVS obtenida a partir de una planta naturalmente infectada de S. phureja var. Criolla Colombia en el municipio de La Unión (Antioquia). Para esto se realizó una pirosecuenciación del ADNc obtenido a partir del ARNm de dicha planta, utilizando el sistema 454 Life Sciences (Roche). El genoma del aislamiento RL5 de PVSA (Número de Accesión JX683388) fue ensamblado a partir de un total de 10899 reads, con una profundidad promedio de 470.8 y resultó filogenéticamente relacionado con la cepa BB-AND de PVSA de Brasil, con la que compartió una identidad genética del 94%. Un análisis de agrupamiento basado en el gen CP, permitió identificar a dicha cepa como perteneciente al clado III de PVSA. La información de este genoma puede ser utilizada para el diseño de cebadores y sondas específicas que apoyen los programas de certificación de tubérculo-semilla y manejo del PVS en Colombia

Purificación y caracterización de una œ- amilasa producida por la cepa nativa bacillus sp. bbm1

La cepa Bacillus sp. BBM1, productora de aamilasas, fue aislada a partir de una muestra de suelo de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín. La caracterización morfológica, bioquímica y molecular indica que esta bacteria está filogenéticamente relacionada con las especies B. subtilis o B. amyloliquefaciens. La amilasa producida (BBM1) fue purificada por precipitación con sulfato de amonio y su peso molecular fue estimado en 77.6 kDa por electroforésis SDSPAGE. Esta enzima es completamente estable a 60°C y presenta actividad significativa entre 30 y 80°C. La amilasa BBM1 tiene un pH óptimo entre 5.07.0 y no requiere calcio para su funcionamiento; estas propiedades hacen que esta enzima sea atractiva en aplicaciones industriales

Identificación molecular de Potyvirus infectando cultivos de papa en el oriente de Antioquia (Colombia)

Los potyvirus son uno de los grupos de virus más limitantes en los cultivos de papa (Solanum tuberosum y S. phureja) en el mundo, siendo PVY, PVV y PVA las especies más prevalentes. En este trabajo se evaluó la presencia de estos potyvirus en cuatro lotes de S. tuberosum cv. Diacol-Capiro y cuatro lotes de S. phureja cv. Criolla-Colombia ubicados en el oriente de Antioquia, analizando la cápside viral mediante RT-PCR/secuenciación Sanger y secuenciación de nueva generación (NGS) para S. tuberosum. Los resultados indicaron la ocurrencia de los potyvirus PVY y PVV en las muestras de S. tuberosum y S. phureja, respectivamente; siendo detectadas mediante cebadores específicos la presencia de tres diferentes cepas de PVY (PVYN, PVYNTN y PVYO) en la región de estudio. Este hallazgo fue confirmado por NGS, obteniendo las secuencias completas de los genomas de estas tres cepas, lo que representa el primer reporte de PVYO en Colombia. Por su parte, los análisis de secuencias de la región CP de PVV indicaron niveles de identidad superiores a 99% con respecto a aislamientos del linaje PVVPhu reportado previamente en Antioquia. Estos hallazgos evidencian la necesidad de ajustar los sistemas de detección de virus en los programas de certificación de tubérculo-semilla de papa adelantados en el país.Potyviruses are one of the most limiting viruses for the potato (Solanum tuberosum and S. phureja) production worldwide, being PVY, PVV and PVA the most prevalent species. In this work, we tested the presence of these viruses in four commercial S. tuberosum cv. Diacol-Capiro and S. phureja cv. Criolla-Colombia plots in eastern Antioquia using RT-PCR and Sanger sequencing of the coat protein (CP) region, as well as next generation sequencing (NGS) for S. tuberosum samples. Our results revealed the presence of a PVV strain infecting S. phureja with high sequence identity (99%) to lineage PVVPhu previously reported in Antioquia. Three strains of PVY (PVYN, PVYNTN and PVYO) were found to infect S. tuberosum. The presence of these three PVY strains was confirmed by NGS, allowing the assembly of their complete genomes. This is the first report of the full genome sequence of PVYo strain in Colombia. These findings highlight the need to adjust the tuber-seed certification programs currently implemented in the country

Detección serológica y molecular del Potato virus X (PVX) en tubérculos-semilla de papa (Solanum tuberosum L. y Solanum phureja Juz. and Bukasov) en Antioquia, Colombia

El Potato virus X (PVX) es uno de los virus más limitantes del cultivo de la papa en el mundo. Es transmitido solamente por contacto y por tubérculo-semilla. Su control se fundamenta en la siembra de tubérculos certificados por su sanidad viral y en la disponibilidad de metodologías de diagnóstico altamente sensibles. En este trabajo se evaluó la prevalencia del PVX en cuatro diferentes tejidos de tubérculos de Solanum tuberosum subsp. andigena var. Diacol-Capiro y S. phureja var. Criolla Colombia utilizando pruebas de DAS-ELISA para 128 submuestras y de RT-qPCR para 32 grupos de submuestras (4 submuestras/grupo). Los resultados de las pruebas serológicas  indicaron la presencia de PVX en el 6,25 y 50% de las submuestras analizadas para la variedad Diacol-Capiro y Criolla Colombia, respectivamente; mientras que los niveles de prevalencia del PVX utilizando la detección por RT-qPCR fueron del 93,75%, independientemente de la variedad de papa y del tejido evaluado. Los valores promedio del ciclo umbral (Ct) en las RT-qPCR fueron de 25,6 (Ct=18,02 a 34,49) y el análisis de las curvas de desnaturalización permitió identificar dos variantes del virus con valores de Tm de 79,5±1°C y 83,7±1°C. La secuenciación de los amplicones obtenidos por RT-qPCR para los controles positivos y para dos de las muestras, confirmó su naturaleza viral. Estos resultados señalan unos muy altos niveles de prevalencia de PVX en el material de siembra de papa en Antioquia y la necesidad de fortalecer los programas de certificación de semilla con pruebas de detección como RT-qPCR.Potato virus X (PVX) is one of the most important virus affecting potato crops worldwide. The virus is only transmitted mechanically and through tuber-seeds. Control of PVX is based on the usage of certified tubers, which in turn depends on the availability of sensitive diagnostic tests that allow its direct detection on seeds. In this work, the prevalence of PVX in four different tuber tissues of Solanum tuberosum subsp. andigena var. Diacol-Capiro and S. phureja var. Criolla was evaluated using DAS-ELISA (128 subsamples) and RT-qPCR (4 subsamples per group). DAS-ELISA revealed the presence of PVX in 6.25 and 50% of Diacol-Capiro and Criolla Colombia subsamples; in contrast, RT-qPCR detected PVX in 93.75% of the samples independent of the potato variety or type of tissue. Ct values were in the 18.02 to 34.49 range with a mean value of 25.6. Melting curve analysis allowed the identification of two virus variants with Tm values of 79.5±1°C and 83.7±1°C. Sanger sequencing of the positive controls and two of the samples confirmed RT-qPCR amplicons to be PVX. These results reveal a high level of prevalence of PVX in potato tuber seeds used in Antioquia and the need to strengthen seed certification programs in Colombia through RT-qPCR detection assays.Key words: DAS-ELISA, Potexvirus, RT-qPCR, Solanaceae

Detection and sequencing of Potato virus Y (PVY) and Potato leafroll virus (PLRV) in a volunteer plant of Solanum tuberosum L. cv. Diacol-Capiro

Viral diseases are among the most limiting factors in the production of potato in Colombia and the rest of the world. The best strategy to control plant viruses consists on the use of certified seed tubers, control of arthropod vectors and the use of adequate crop management practices that reduce mechanical transmission and the presence of viral reservoirs like weeds and volun-teer plants. However, the successful implementation of these practices relies on the availability of highly sensitive techniques that allow for the asymptomatic detection of viruses. In this work, we tested the performance of Next-generation sequencing (NGS) and real time RT-PCR (RT-qPCR) on a single volunteer potato plant (cv. Diacol-Capiro) growing naturally in a seed-tuber storage facility in Yarumal (Antioquia). Our NGS results demonstrate a mixed infection with Potato virus Y (PVY) and Potato leafroll virus (PLRV). RT-qPCR was performed in roots, main stolons, crown (root collar) and upper, middle and lower leaves using specific primers for PVY, PLRV, Potato virus S (PVS), Potato virus V (PVV), Potato virus X (PVX) and Potato yellow vein virus (PYVV). Only PVY and PLRV were detected in good agreement with the NGS data. This work demonstrates the use-fulness of both techniques for supporting integrated management of plant viruses in potato, in-cluding virus detection in natural reservoirs such as volunteer plants and weeds

Análisis de la movilidad diaria en los municipios de la Sierra de Guadarrama: Informe final (noviembre de 2022)

El actual modelo de movilidad diaria en ámbitos locales y regionales sigue descansando mayoritariamente sobre el uso del vehículo particular. Ello lo hace difícilmente sostenible, por causa de sus importantes impactos negativos medioambientales y climáticos. En zonas suburbanas y rurales de áreas montañosas los impactos se ven agravados por sus características físicas y por la fragilidad de su valor natural, así como por la dispersión urbanística. Esta además incrementa la dependencia del automóvil, debido a la mayor separación de los usos urbanos y la menor cobertura de los servicios de transporte público. Por otro lado, la circunstancia anterior hace que en gran parte de desplazamientos solo la disponibilidad de un automóvil permita una movilidad eficiente en el tiempo de viaje y equitativa en la accesibilidad. Este es el caso de los municipios de la Sierra de Guadarrama en la Comunidad de Madrid, que asimismo presentan una acusada dependencia general respecto de la gran metrópoli madrileña, principalmente en términos laborales. En el presente proyecto se realiza un análisis de la movilidad cotidiana en estos municipios, que confirma su insostenibilidad, y se proponen medidas de acción con las que intentar reorientarlo hacia patrones más sostenible

Isolation and characterization of potential phytase-producing fungi from environmental samples of antioquia (colombia) / aislamiento y caracterización de hongos productores de fitasa a partir de muestras ambientales de antioquia (colombia)

Abstract. Phytases are enzymes used as feed additive that enhance the phosphorus and mineral uptake in monogastric animals and reduce the level of phosphate excretion in their manure. Due to their easy cultivation and high production of extracellular enzymes, filamentous fungi are one of best sources of phytase for use in the feed industry. Phytase has been found principally in the genera Aspergillus, Penicillium, Mucor and Rhizopus. In this work, we report the isolation and characterization of environmental fungi producers of phytase with potential use as feed additives. Samples were collected from soils, fruits and cereals in Antioquia (Colombia). A total of 26 fungal strains were isolated and identified using ITS sequencing and morphological analysis. Strains belonged to the following genera: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mortierella, Pestalotiopsis, Phoma, Paecilomyces and Rigidoporus. Fifty percent of isolates exhibited halos in phytase screening agar indicating that acidic phytases are common enzymes secreted by environmental fungi. Ten isolates were also able to grow in liquid phytase screening medium revealing their potential use for enzyme production in submerged fermentations. Molecular detection of the PhyA gene from Aspergillus was achieved. Partial sequence of the phyA gene from one A. niger isolate was obtained and analyzed. / Resumen. Las fitasas son enzimas utilizadas como aditivo en productos de alimentación animal, con el fin de mejorar la asimilación de fósforo y minerales en animales monogástricos y disminuir la excreción de fósforo al ambiente. Los hongos filamentosos son una de las mejores fuentes de fitasas debido a su facilidad de cultivo y altos niveles de producción de enzimas extracelulares. Los principales productores de fitasas corresponden a miembros de los géneros Aspergillus, Penicillium, Mucor y Rhizopus. En este trabajo se reporta el aislamiento y caracterización de hongos ambientales productores de fitasas con aplicación potencial en la industria de alimentación animal. Se obtuvieron e identificaron un total de 26 aislamientos; caracterizados por secuenciación de la región ITS-ADNr y análisis morfológico. Los aislamientos pertenecieron a los siguientes géneros: Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Mortierella, Pestalotiopsis, Phoma, Paecilomyces y Rigidoporus. Se observó la secreción de fitasas en 50% de los aislamientos sugiriendo la ubiquidad de esta enzima en hongos ambientales. Diez aislamientos crecieron eficientemente en medio líquido con fitato como única fuente de fósforo. Estos últimos cumplen con los requisitos para la producción de enzimas mediante fermentación sumergida. Se diseñaron cebadores para la detección molecular del gen PhyA en los aislamientos del género Aspergillus. Se obtuvo y analizó la secuencia parcial del gen PhyA de un aislamiento de A. nige

Identification and molecular characterization of the complete genome of three viruses infecting lulo (Solanum quitoense) crops in Antioquia (Colombia)

1 recurso en línea (páginas 281-292).Lulo is one the most promising crops in the Andean region of Colombia because of its unique organoleptic properties and potential for industrial processing. In Antioquia, there has been a marked increase of lulo plants exhibiting typical symptoms of viral diseases, such as interveinal yellowing, mosaics and sprout deformation. In this research, we studied the presence of viruses infecting lulo in bulked leaf samples from Eastern Antioquia. Viruses were detected using Next-generation sequencing (NGS), with confirmation by RT-PCR. The NGS resulted in a total of 10’777,822 paired-end reads, of which 40.4% corresponded to Cucumber mosaic virus (CMV), 0.09% to Potato yellow vein virus (PYVV) and 0.06% to Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV). Complete genome sequences were obtained for each of these viruses. RT-PCR primers for CMV and ANSV detection were designed using the assembled genomes reported in this study. Future research should investigate the effect of these viruses on crop yield, plant longevity and seed quality as well as their means of transmission, host range and specific symptoms.El lulo es uno de los renglones agrícolas más promisorios para la región andina de Colombia, gracias a sus excelentes características organolépticas y a su potencial para el procesamiento industrial. En Antioquia, se ha observado en los últimos años la presencia de plantas con síntomas de enfermedades virales, que incluyen amarillamientos intervenales, mosaicos y deformación de brotes. En este trabajo, se evaluó dicha situación en un grupo (bulk) de muestras foliares de plantas sintomáticas de lulo obtenidas en municipios del Oriente Antioqueño, utilizando la metodología molecular de secuenciación de nueva generación (NGS), y la confirmación posterior por RT-PCR. Los análisis bioinformáticos de las secuencias obtenidas (10.777.822 de reads) indicaron la presencia de tres virus de RNA en el transcriptoma evaluado; el Cucumber mosaic virus (CMV) se encontró en mayores niveles de infección (40,4% del total de reads), mientras que los otros virus corresponden al Potato yellow vein virus (PYVV) (0,09%) y Alstroemeria necrotic streak virus (ANSV) (0,06%), siendo posible obtener sus genomas completos. La ocurrencia de los tres virus fue confirmada en plantas individuales de lulo mediante pruebas de RT-PCR/secuenciación Sanger con cebadores específicos diseñados a partir de los datos de NGS (ANSV y CMV), o con cebadores reportados previamente (PYVV). En el futuro será necesario evaluar los efectos de estos virus sobre los rendimientos, longevidad de plantas y calidad de semilla en los cultivos de lulo en el país, así como sus métodos de transmisión, rango de hospedantes y sintomatología específica.Bibliografía y webgrafía: páginas 291-29