mRNA adenosine methylase (MTA) deposits m6A on pri-miRNAs to modulate miRNA biogenesis in Arabidopsis thaliana

Copyright © 2020 the Author(s). Published by PNAS. In Arabidopsis thaliana, the METTL3 homolog, mRNA adenosine methylase (MTA) introduces N6-methyladenosine (m6A) into various coding and noncoding RNAs of the plant transcriptome. Here, we show that an MTA-deficient mutant (mta) has decreased levels of microRNAs (miRNAs) but accumulates primary miRNA transcripts (pri-miRNAs). Moreover, pri-miRNAs are methylated by MTA, and RNA structure probing analysis reveals a decrease in secondary structure within stem-loop regions of these transcripts in mta mutant plants. We demonstrate interaction between MTA and both RNA Polymerase II and TOUGH (TGH), a plant protein needed for early steps of miRNA biogenesis. Both MTA and TGH are necessary for efficient colocalization of the Microprocessor components Dicer-like 1 (DCL1) and Hyponastic Leaves 1 (HYL1) with RNA Polymerase II. We propose that secondary structure of miRNA precursors induced by their MTA-dependent m6A methylation status, together with direct interactions between MTA and TGH, influence the recruitment of Microprocessor to plant pri-miRNAs. Therefore, the lack of MTA in mta mutant plants disturbs pri-miRNA processing and leads to the decrease in miRNA accumulation. Furthermore, our findings reveal that reduced miR393b levels likely contributes to the impaired auxin response phenotypes of mta mutant plants

Współczesne spojrzenie na proces splicingu oraz mechanizmy jego regulacji

W komórkach eukariotycznych wiele genów transkrybowanych jest w postaci prekursorowego mRNA zawierającego sekwencje kodujące (eksony) i niekodujące (introny), które zostają wycięte w procesie splicingowym, dostarczając kompletnej matrycy do syntezy białka. Komórka dysponuje dwoma rodzajami splicingu: konstytutywnym oraz alternatywnym, w trakcie którego część intronów pozostaje w mRNA. Splicing umożliwia zatem otrzymanie wielu mRNA z jednego genu. Proces splicingowy jest wieloetapowy i pełni w komórce liczne funkcje. Z tego powodu musi być ściśle kontrolowany. Błędy pojawiające się w czasie splicingu mogą wpływać w negatywny sposób na metabolizm komórki, apoptozę i cykl komórkowy, w niektórych przypadkach indukując także proces nowotworzenia. Regulacja splicingu odbywa się w sposób bezpośredni poprzez modyfikację aktywności katalitycznej białek regulatorowych z rodziny białek Sr i hnRNP na drodze fosforylacji/defosforylacji oraz zmianę stężenia ATP i ATPaz Prp, które niezbędne są dla powstania zmian konformacyjnych w kompleksach spliceosomalnych. Regulacja pośrednia oparta jest na dostępności cząsteczek snRNP oraz utrzymaniu integralności oraz funkcjonalności ciał Cajala, które biorą udział w biosyntezie snRNP. Właściwa integralność ciał Cajala utrzymywana jest poprzez wzajemne interakcje pomiędzy koiliną, białkami rdzeniowymi Sm oraz kompleksem SMN, których aktywność modyfikowana jest na drodze fosforylacji i symetrycznej dimetylacji argininy.In eukaryotic cells many gens are transcribed in the form of pre-mRNA containing coding (exon) and non-coding (intron) sequences. In the splicing process, introns are removed and exons ligated providing thus complete template for protein translation. Despite constitutive splicing there occurs also an alternative splicing within which not all introns are taken out. Splicing leads thus to production of multiple copies of mRNA from a single gene. The splicing as a multi-functional and step-wise process needs to be tightly regulated. Many cellular malfunction are effected by errors occurring during constitutive and alternative splicing. These malfunctions encompass metabolism, apoptosis and cell cycle control; in some cases they may lead to cancerogenesis. Splicing could be regulated directly by modifying activity of splicing factors such as SR proteins and RNA-binding proteins (RBPs) by phosphorylation/dephosphorylation and changes in concentration of ATP and ATP-ases Prp involved into conformational changes in of spliceosomal complexes. Indirect pathway of splicing regulation is based on accessibility of snRNP particles and control of the integrity and functionality of Cajal bodies (CB) participating in snRNP biogenesis. The integrity of CB is maintained by mutual interactions between SMN complex, coilin protein and core proteins Sm, the activity of whitch activity is regulated by phosphorylation and symmetrical arginine dimethylation

PRP40 mediates the communication between transcription, splicing and miRNA biogenesis

Wydział BiologiiMicroRNA (miRNA) są to krótkie cząsteczki RNA biorące udział w regulacji ekspresji wielu genów. Transkrybowane są przez polimerazę RNA II (RNAPII) jako prekursorowe miRNA (pri-miRNA), które następnie ulegają przekształceniu w dojrzałe cząsteczki miRNA z udziałem kompleksu nazywanego mikroprocesorem. Kompleks ten jest zbudowany z trzech głównych białek: endorybonukleazy DCL1 (Dicer like 1), SERRATE oraz HYL1 (Hyponasic Leaves 1). Z mikroprocesorem odziałują także inne białka, takie jak: TGH (TOUGH), helikaza CHR2 (Chromatin Remodeling Factor 2), fosfataza CPL1 (C-Terminal Domain Phosphatase-like), SMA1 (Small 1), HOS1 (High Expression of Osmotically Responsive Genes 1), CDF2 (Cyclin DOF 2), NOT2a oraz NOT2b (Negative on TATA Less 2). Poza biogenezą miRNA, białko SERRATE zaangażowane jest w proces alternatywnego splicingu, oddziałuje z kompleksem CBC oraz białkami pomocniczymi U1 snRNP, takimi jak PRP40. Ponieważ PRP40 oddziałuje również z domeną CTD polimerazy RNA II (RNAPII), może pośredniczyć w komunikacji pomiędzy polimerazą a mikroprocesorem. W niniejszej pracy postanowiłem zbadać rolę białka PRP40 w komunikacji pomiędzy transkrypcją, splicingiem oraz biogenezą miRNA. Wykorzystując metody mikroskopii konfokalnej pokazałem, że PRP40 pośredniczy w asocjacji U1-70K oraz SERRATE z kompleksem RNAPII. W mutancie prp40ab zaobserwowałem spadek kolokalizacji obu tych białek z aktywną transkrypcyjnie RNAPII (z fosforylowaną seryną 5 i seryną 2 w domenie CTD). Poza tym, w mutancie prp40ab oraz se-2 obniżeniu ulega także asocjacja DCL1 z kompleksem RNAPII. Otrzymane dane wskazują, że PRP40 i SERRATE wpływają na kolokalizację DCL1 i RNAPII. W przeciwieństwie do tego, asocjacja białka HYL1 z aktywną transkrypcyjnie RNAPII jest niezależna od SERRATE. Otrzymane dane pozwoliły mi zaproponować model kotranskrypcyjnego tworzenia kompleksu mikroprocesora i rozpoznania miejsca splicingowego 5'. Zgodnie z nim, białko PRP40, oddziałując z domeną CTD RNAPII, pośredniczy w asocjacji SERRATE z RNAPII. Na etapie inicjacji transkrypcji, do kompleksu RNAPII dołącza także białko HYL1, jednak jego asocjacja z kompleksem polimerazy RNA II jest niezależna od SERRATE. Następnie, w trakcie elongacji, do kompleksu RNAPII rekrutowany jest U1 snRNP, jeżeli w powstającym miRNA znajduje miejsce 5’ SS. Na tym etapie do mikroprocesora dołącza także białko DCL1, przy czym jego asocjacja z kompleksem RNAPII regulowana jest przez PRP40 oraz SERRATE. Obecnie uważa się, że miejscem biogenezy miRNA są struktury D (ang. dicing bodies, D-bodies). Wykorzystując metody mikroskopowe, takie jak hybrydyzacja FISH (ang. fluorescence in situ hybridization) oraz RNA Stellaris, zlokalizowałem pri-miRNA163 oraz pri-miRNA156a w jądrze komórkowym. Oba te prekursory gromadzą się w specyficznych ciałach jądrowych. Przeprowadzone badania pokazały jednak, że opisane przez mnie struktury, chociaż zawierają nowe transkrypty oraz białka biorące udział w biogenezie miRNA, nie są ciałami D. Wyniki moich badań wskazują, że biogeneza miRNA u roślin jest procesem kotranskrypcyjnym.MiRNAs are short, non-coding RNAs which are engaged in the regulation of many genes. They are transcribed by RNA polymerase II (RNAPII) as long precursors (pri-miRNAs) which then are processed to mature miRNAs. The processing of pri-miRNAs to miRNAs is catalyzed by the complex called Microprocessor, consisting of endoribonuclease Dicer like 1 (DCL1), SERRATE (SE) and Hyponastic Leaves 1 (HYL1). In addition, several proteins like TGH (TOUGH), helicase CHR2 (Chromatin Remodeling Factor 2), phosphatase CPL1 (C-Terminal Domain Phosphatase-like), SMA1 (Small 1), HOS1 (High Expression of Osmotically Responsive Genes 1), CDF2 (Cyclin DOF 2), NOT2a and NOT2b (Negative on TATA Less 2) have been found to be involved in plant miRNA biogenesis. It has been shown that SERRATE is engaged in the regulation of alternative splicing and interacts with the nuclear cap-binding complex (CBC) as well as auxiliary proteins of U1 snRNP, like PRP40. On the other hand, it has been also reported that PRP40 interacts with the CTD domain of RNAPII. In this project I have investigated the role of PRP40 in the communication between transcription, splicing and miRNA biogenesis. To this end, I have applied confocal microscopy approaches and found that PRP40 affects the association of SERRATE and U1-70K (a core protein of U1 snRNP) with RNAPII. In the prp40ab mutant, co-localization between these proteins and transcriptionally active RNAPII (phosphorylated at serine 5 and serine 2 in its CTD domain) was decreased in comparison with WT plants. Interestingly, I have also found that co-localization of DCL1 with RNAPII is also decreased in prp40ab and se-2 mutants. On the contrary to that, the association of HYL1 with RNAPII is SERRATE-independent. I did not find any changes in co-localization of HYL1 and RNAPII in the se-2 mutant. The obtained results let me to propose a model presenting co-transcriptional assembly of the Microprocessor complex. According to the model, PRP40 interacts with the CTD domain of RNAPII and mediates the association of SERRATE with RNAPII. At the transcription initiation stage, HYL1 is also recruited to the RNAPII complex, however, in the SERRATE-independent manner. Next, at the transcription elongation stage, U1 snRNP associates with RNAPII if a primary transcript contains a 5’ SS. At this step, DCL1 is also recruited and its association with RNAPII depends on presence of PRP40 and SERRATE, but not HYL1. Currently, it is commonly accepted that miRNA biogenesis in plants occurs in special nuclear structures - dicing bodies (D-bodies). By the application of FISH (fluorescence in situ hybridization) and RNA Stellaris methods I have localized pri-miRNA163 and pri-miRNA156 in one or two nuclear bodies containing newly synthesized transcripts and proteins engaged in miRNA biogenesis. Interestingly, the described by me nuclear structures containing pri-miRNAs are not D-bodies, supporting the idea of co-transcriptional miRNA biogenesis in plant.Narodowego Centrum Nauki (NCN), granty: - UMO-2013/10/A/NZ1/00557 (MAESTRO), kierownik projektu: prof. dr. hab. Artur Jarmołowski, tytuł projektu: Molekularne interakcje pomiędzy białkami kompleksu dojrzewania mikroRNA i czynnikami odpowiedzialnymi za splicing i poliadenylację u roślin. - UMO-2016/23/N/NZ1/00010 (PRELUDIUM), kierownik projektu: mgr Tomasz Gulanicz, tytuł projektu: Nowe ciała jądrowe zawierające prekursory miRNA i ich rola w biogenezie roślinnych miRNA. 2. Poznańskiego Konsorcjum RNA KNOW (01/KNOW2/2014). Autor uzyskał także środki finansowe na przygotowanie rozprawy doktorskiej z Narodowego Centrum Nauki (ETIUDA) na podstawie decyzji numer UMO-2019/32/T/NZ1/00508, tytuł projektu: PRP40 pośredniczy w komunikacji pomiędzy transkrypcją, splicingiem i biogenezą miRNA

PRP40 mediates the communication between transcription, splicing and miRNA biogenesis

Wydział BiologiiMicroRNA (miRNA) są to krótkie cząsteczki RNA biorące udział w regulacji ekspresji wielu genów. Transkrybowane są przez polimerazę RNA II (RNAPII) jako prekursorowe miRNA (pri-miRNA), które następnie ulegają przekształceniu w dojrzałe cząsteczki miRNA z udziałem kompleksu nazywanego mikroprocesorem. Kompleks ten jest zbudowany z trzech głównych białek: endorybonukleazy DCL1 (Dicer like 1), SERRATE oraz HYL1 (Hyponasic Leaves 1). Z mikroprocesorem odziałują także inne białka, takie jak: TGH (TOUGH), helikaza CHR2 (Chromatin Remodeling Factor 2), fosfataza CPL1 (C-Terminal Domain Phosphatase-like), SMA1 (Small 1), HOS1 (High Expression of Osmotically Responsive Genes 1), CDF2 (Cyclin DOF 2), NOT2a oraz NOT2b (Negative on TATA Less 2). Poza biogenezą miRNA, białko SERRATE zaangażowane jest w proces alternatywnego splicingu, oddziałuje z kompleksem CBC oraz białkami pomocniczymi U1 snRNP, takimi jak PRP40. Ponieważ PRP40 oddziałuje również z domeną CTD polimerazy RNA II (RNAPII), może pośredniczyć w komunikacji pomiędzy polimerazą a mikroprocesorem. W niniejszej pracy postanowiłem zbadać rolę białka PRP40 w komunikacji pomiędzy transkrypcją, splicingiem oraz biogenezą miRNA. Wykorzystując metody mikroskopii konfokalnej pokazałem, że PRP40 pośredniczy w asocjacji U1-70K oraz SERRATE z kompleksem RNAPII. W mutancie prp40ab zaobserwowałem spadek kolokalizacji obu tych białek z aktywną transkrypcyjnie RNAPII (z fosforylowaną seryną 5 i seryną 2 w domenie CTD). Poza tym, w mutancie prp40ab oraz se-2 obniżeniu ulega także asocjacja DCL1 z kompleksem RNAPII. Otrzymane dane wskazują, że PRP40 i SERRATE wpływają na kolokalizację DCL1 i RNAPII. W przeciwieństwie do tego, asocjacja białka HYL1 z aktywną transkrypcyjnie RNAPII jest niezależna od SERRATE. Otrzymane dane pozwoliły mi zaproponować model kotranskrypcyjnego tworzenia kompleksu mikroprocesora i rozpoznania miejsca splicingowego 5'. Zgodnie z nim, białko PRP40, oddziałując z domeną CTD RNAPII, pośredniczy w asocjacji SERRATE z RNAPII. Na etapie inicjacji transkrypcji, do kompleksu RNAPII dołącza także białko HYL1, jednak jego asocjacja z kompleksem polimerazy RNA II jest niezależna od SERRATE. Następnie, w trakcie elongacji, do kompleksu RNAPII rekrutowany jest U1 snRNP, jeżeli w powstającym miRNA znajduje miejsce 5’ SS. Na tym etapie do mikroprocesora dołącza także białko DCL1, przy czym jego asocjacja z kompleksem RNAPII regulowana jest przez PRP40 oraz SERRATE. Obecnie uważa się, że miejscem biogenezy miRNA są struktury D (ang. dicing bodies, D-bodies). Wykorzystując metody mikroskopowe, takie jak hybrydyzacja FISH (ang. fluorescence in situ hybridization) oraz RNA Stellaris, zlokalizowałem pri-miRNA163 oraz pri-miRNA156a w jądrze komórkowym. Oba te prekursory gromadzą się w specyficznych ciałach jądrowych. Przeprowadzone badania pokazały jednak, że opisane przez mnie struktury, chociaż zawierają nowe transkrypty oraz białka biorące udział w biogenezie miRNA, nie są ciałami D. Wyniki moich badań wskazują, że biogeneza miRNA u roślin jest procesem kotranskrypcyjnym.MiRNAs are short, non-coding RNAs which are engaged in the regulation of many genes. They are transcribed by RNA polymerase II (RNAPII) as long precursors (pri-miRNAs) which then are processed to mature miRNAs. The processing of pri-miRNAs to miRNAs is catalyzed by the complex called Microprocessor, consisting of endoribonuclease Dicer like 1 (DCL1), SERRATE (SE) and Hyponastic Leaves 1 (HYL1). In addition, several proteins like TGH (TOUGH), helicase CHR2 (Chromatin Remodeling Factor 2), phosphatase CPL1 (C-Terminal Domain Phosphatase-like), SMA1 (Small 1), HOS1 (High Expression of Osmotically Responsive Genes 1), CDF2 (Cyclin DOF 2), NOT2a and NOT2b (Negative on TATA Less 2) have been found to be involved in plant miRNA biogenesis. It has been shown that SERRATE is engaged in the regulation of alternative splicing and interacts with the nuclear cap-binding complex (CBC) as well as auxiliary proteins of U1 snRNP, like PRP40. On the other hand, it has been also reported that PRP40 interacts with the CTD domain of RNAPII. In this project I have investigated the role of PRP40 in the communication between transcription, splicing and miRNA biogenesis. To this end, I have applied confocal microscopy approaches and found that PRP40 affects the association of SERRATE and U1-70K (a core protein of U1 snRNP) with RNAPII. In the prp40ab mutant, co-localization between these proteins and transcriptionally active RNAPII (phosphorylated at serine 5 and serine 2 in its CTD domain) was decreased in comparison with WT plants. Interestingly, I have also found that co-localization of DCL1 with RNAPII is also decreased in prp40ab and se-2 mutants. On the contrary to that, the association of HYL1 with RNAPII is SERRATE-independent. I did not find any changes in co-localization of HYL1 and RNAPII in the se-2 mutant. The obtained results let me to propose a model presenting co-transcriptional assembly of the Microprocessor complex. According to the model, PRP40 interacts with the CTD domain of RNAPII and mediates the association of SERRATE with RNAPII. At the transcription initiation stage, HYL1 is also recruited to the RNAPII complex, however, in the SERRATE-independent manner. Next, at the transcription elongation stage, U1 snRNP associates with RNAPII if a primary transcript contains a 5’ SS. At this step, DCL1 is also recruited and its association with RNAPII depends on presence of PRP40 and SERRATE, but not HYL1. Currently, it is commonly accepted that miRNA biogenesis in plants occurs in special nuclear structures - dicing bodies (D-bodies). By the application of FISH (fluorescence in situ hybridization) and RNA Stellaris methods I have localized pri-miRNA163 and pri-miRNA156 in one or two nuclear bodies containing newly synthesized transcripts and proteins engaged in miRNA biogenesis. Interestingly, the described by me nuclear structures containing pri-miRNAs are not D-bodies, supporting the idea of co-transcriptional miRNA biogenesis in plant.Narodowego Centrum Nauki (NCN), granty: - UMO-2013/10/A/NZ1/00557 (MAESTRO), kierownik projektu: prof. dr. hab. Artur Jarmołowski, tytuł projektu: Molekularne interakcje pomiędzy białkami kompleksu dojrzewania mikroRNA i czynnikami odpowiedzialnymi za splicing i poliadenylację u roślin. - UMO-2016/23/N/NZ1/00010 (PRELUDIUM), kierownik projektu: mgr Tomasz Gulanicz, tytuł projektu: Nowe ciała jądrowe zawierające prekursory miRNA i ich rola w biogenezie roślinnych miRNA. 2. Poznańskiego Konsorcjum RNA KNOW (01/KNOW2/2014). Autor uzyskał także środki finansowe na przygotowanie rozprawy doktorskiej z Narodowego Centrum Nauki (ETIUDA) na podstawie decyzji numer UMO-2019/32/T/NZ1/00508, tytuł projektu: PRP40 pośredniczy w komunikacji pomiędzy transkrypcją, splicingiem i biogenezą miRNA

R-loops at microRNA encoding loci promote co-transcriptional processing of pri-miRNAs in plants

In most organisms, the maturation of nascent RNAs is coupled to transcription. Unlike in animals, the RNA polymerase II (RNAPII) transcribes microRNA genes (MIRNAs) as long and structurally variable pri-miRNAs in plants. Current evidence suggests that the miRNA biogenesis complex assembly initiates early during the transcription of pri-miRNAs in plants. However, it is unknown whether miRNA processing occurs co-transcriptionally. Here, we used native elongating transcript sequencing data and imaging techniques to demonstrate that plant miRNA biogenesis occurs coupled to transcription. We found that the entire biogenesis occurs co-transcriptionally for pri-miRNAs processed from the loop of the hairpin but requires a second nucleoplasmic step for those processed from the base. Furthermore, we found that co- and post-transcriptional miRNA processing mechanisms co-exist for most miRNAs in a dynamic balance. Notably, we discovered that R-loops, formed near the transcription start site region of MIRNAs, promote co-transcriptional pri-miRNA processing. Furthermore, our results suggest the neofunctionalization of co-transcriptionally processed miRNAs, boosting countless regulatory scenarios