Molecular regulation of mitochondrial dynamics by dynamin-related protein 1 (Drp1) and Bid in model systems of neuronal cell death

Mitochondrien sind Schlüsselorganelle in Signalwegen der neuronalen Apoptose und in Entwicklungs- und Alterungsprozessen der Zelle. Mitochondrien sind hoch dynamische Organelle, welche sich abhängig der physiologischen Bedingungen als lange miteinander verbundene Netzwerke oder als kleine, runde Organelle darstellen. Unter pathologischen Bedingungen und im neuronalen Zelltod ist die Regulation der Mitochondrienmorphologie deutlich verändert, wobei das Gleichgewicht der mitochondrialen Dynamik in Richtung Fragmentierung verschoben wird. Entsprechende Veränderungen der Mitochondrien treten z. B. im verzögerten neuronalen Zelltod nach Schlaganfall oder Schädel-Hirn-Trauma auf und vermehrt fragmentierte Mitochondrien sind auch in geschädigtem Hirngewebe bei alters-bedingten neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson nachgewiesen worden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde vor allem eine neuronale hippokampale Zelllinie (HT-22 Zellen) verwendet, um die Regulation und die Bedeutung der vermehrten Mitochondrienfragmentierung im oxidativen neuronalen Zelltod zu untersuchen. In diesen Zellen führt eine Behandlung mit Glutamat zu einem kontinuierlichen Abfall der intrazellulären Glutathionspiegel und induziert somit oxidativen Stress. Zusätzlich wurden primäre neuronale Zellkulturen und ein in vivo-Modell der zerebralen Ischämie eingesetzt, um die in HT-22 Zellen erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen und auszubauen. Der erste Teil dieser Arbeit untersucht, ob verstärkte mitochondriale Fragmentierung den Glutamat-induzierten Zelltod begleitet. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass Glutamat-induzierte Apoptose mit einer verstärkten Fragmentierung von Mitochondrien, dem Verlust von mitochondrialen Membranpotential und einer Umverteilung von fragmentierten Mitochondrien um den Zellkern verbunden ist. Weiter zeigen die hier dargestellten Ergebnisse eine Schlüsselrolle für das BH3-Protein Bid in der mitochondrialen Fragmentierung auf, die durch den oxidativen Stress ausgelöst wurde. Der zweite Teil der Arbeit untersucht die Rolle des Dynamin Proteins Drp1 im neuronalen Zelltod nach Glutamat-Schädigung in HT-22 Zellen und in primären kortikalen Neuronen. Um die Rolle von Drp1 im Glutamat-induzierten Zelltod nachzuweisen, wurde in dem hier angewendeten Modellsystem des oxidativen Stress zum ersten Mal hoch spezifische Drp1 Inhibitoren und Drp1 siRNA angewendet. Die Deletion von Drp1 durch siRNA oder durch den Drp1 Inhibitor zeigen, das mitochondriale Membranpotential aufrechterhalten werden kann und die mitochondriale Fragmentierung in HT-22 Zellen, als auch in primären Neuronen verhindert werden. Der Drp1 Inhibitor blockierte zudem den neuronalen Zelltod nach Sauerstoff-Glukose-Entzug in primären Neuronen und verringert auch signifikant das Infarktvolumen in einem Schlaganfallmodell in Mäusen. Diese Daten heben Drp1 als einen Schlüsselfaktor bei ischämisch- und Glutamat-induziertem neuronalen Zelltod hervor und identifizierten Drp1-abhängige mitochondriale Fragmentierung als eine mögliche therapeutischen Zielstruktur für die Therapie von akuten zerebrovaskulären Erkrankungen. Weitere Untersuchungen zu einer möglichen Wechselwirkung zwischen Bid und Drp1 im neuronalen Zelltod zeigten zudem erstmalig, dass offenbar beide Proteine nach oxidativem Stress zusammen an der Mitochondrienmembran agieren, um intrinsische Signalkaskaden der Apoptose zu induzieren. Die Hemmung eines der Proteine war ausreichend, um die mitochondriale Translokation bzw. die toxischen Effekte des Partners an den Mitochondrien zu hemmen und so den neuronalen Zelltod zu verhindern. Insgesamt konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Bid und Drp1 zusammen als Schlüsselregulatoren des mitochondrialen neuronalen Zelltodes in HT-22 Zellen agieren und das die Hemmung von Drp1 auch in primären Neuronen, und auch in einem Schlaganfallmodell in Mäusen eine protektive Wirkung vermittelt. Der Bid-vermittelte neuronale Zelltod umfasst Drp1-abhängige mitochondriale Fragmentierung, mitochondriale Umverteilung um den Zellkern, mitochondriale Membranschädigung und die Freisetzung von mitochondrialen Apoptose-Mediatoren wie AIF. Aus diesem Grund sind Bid und Drp1 vielversprechende therapeutische Zielstrukturen, die durch neuartige Inhibitor-Moleküle blockiert werden können, um mitochondriale Fragmentierung und Dysfunktion, als Kennzeichen des neuronalen Zelltodes bei akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen zu verhindern, in denen Glutamatschädigung bzw. oxidativer Stress zu den wesentlichen auslösenden Faktoren für die Nervenschädigung führen

Glutamate Induces Mitochondrial Dynamic Imbalance and Autophagy Activation: Preventive Effects of Selenium

Glutamate-induced cytotoxicity is partially mediated by enhanced oxidative stress. The objectives of the present study are to determine the effects of glutamate on mitochondrial membrane potential, oxygen consumption, mitochondrial dynamics and autophagy regulating factors and to explore the protective effects of selenium against glutamate cytotoxicity in murine neuronal HT22 cells. Our results demonstrated that glutamate resulted in cell death in a dose-dependent manner and supplementation of 100 nM sodium selenite prevented the detrimental effects of glutamate on cell survival. The glutamate induced cytotoxicity was associated with mitochondrial hyperpolarization, increased ROS production and enhanced oxygen consumption. Selenium reversed these alterations. Furthermore, glutamate increased the levels of mitochondrial fission protein markers pDrp1 and Fis1 and caused increase in mitochondrial fragmentation. Selenium corrected the glutamate-caused mitochondrial dynamic imbalance and reduced the number of cells with fragmented mitochondria. Finally, glutamate activated autophagy markers Beclin 1 and LC3-II, while selenium prevented the activation. These results suggest that glutamate targets the mitochondria and selenium supplementation within physiological concentration is capable of preventing the detrimental effects of glutamate on the mitochondria. Therefore, adequate selenium supplementation may be an efficient strategy to prevent the detrimental glutamate toxicity and further studies are warranted to define the therapeutic potentials of selenium in animal disease models and in human

Activation of SK2 channels preserves ER Ca(2+) homeostasis and protects against ER stress-induced cell death

Alteration of endoplasmic reticulum (ER) Ca(2+) homeostasis leads to excessive cytosolic Ca(2+) accumulation and delayed neuronal cell death in acute and chronic neurodegenerative disorders. While our recent studies established a protective role for SK channels against excessive intracellular Ca(2+) accumulation, their functional role in the ER has not been elucidated yet. We show here that SK2 channels are present in ER membranes of neuronal HT-22 cells, and that positive pharmacological modulation of SK2 channels with CyPPA protects against cell death induced by the ER stressors brefeldin A and tunicamycin. Calcium imaging of HT-22 neurons revealed that elevated cytosolic Ca(2+) levels and decreased ER Ca(2+) load during sustained ER stress could be largely prevented by SK2 channel activation. Interestingly, SK2 channel activation reduced the amount of the unfolded protein response transcription factor ATF4, but further enhanced the induction of CHOP. Using siRNA approaches we confirmed a detrimental role for ATF4 in ER stress, whereas CHOP regulation was dispensable for both, brefeldin A toxicity and CyPPA-mediated protection. Cell death induced by blocking Ca(2+) influx into the ER with the SERCA inhibitor thapsigargin was not prevented by CyPPA. Blocking the K(+) efflux via K(+)/H(+) exchangers with quinine inhibited CyPPA-mediated neuroprotection, suggesting an essential role of proton uptake and K(+) release in the SK channel-mediated neuroprotection. Our data demonstrate that ER SK2 channel activation preserves ER Ca(2+) uptake and retention which determines cell survival in conditions where sustained ER stress contributes to progressive neuronal death.Cell Death and Differentiation advance online publication, 20 November 2015; doi:10.1038/cdd.2015.146.</p

Synaptic dysfunction, memory deficits and hippocampal atrophy due to ablation of mitochondrial fission in adult forebrain neurons

Well-balanced mitochondrial fission and fusion processes are essential for nervous system development. Loss of function of the main mitochondrial fission mediator, dynamin-related protein 1 (Drp1), is lethal early during embryonic development or around birth, but the role of mitochondrial fission in adult neurons remains unclear. Here we show that inducible Drp1 ablation in neurons of the adult mouse forebrain results in progressive, neuronal subtype-specific alterations of mitochondrial morphology in the hippocampus that are marginally responsive to antioxidant treatment. Furthermore, DRP1 loss affects synaptic transmission and memory function. Although these changes culminate in hippocampal atrophy, they are not sufficient to cause neuronal cell death within 10 weeks of genetic Drp1 ablation. Collectively, our in vivo observations clarify the role of mitochondrial fission in neurons, demonstrating that Drp1 ablation in adult forebrain neurons compromises critical neuronal functions without causing overt neurodegeneration

Mitochondrial division inhibitor-1 is neuroprotective in the A53T-α-synuclein rat model of Parkinson’s disease

Alpha-synuclein (α-syn) is involved in both familial and sporadic Parkinson’s disease (PD). One of the proposed pathogenic mechanisms of α-syn mutations is mitochondrial dysfunction. However, it is not entirely clear the impact of impaired mitochondrial dynamics induced by α-syn on neurodegeneration and whether targeting this pathway has therapeutic potential. In this study we evaluated whether inhibition of mitochondrial fission is neuroprotective against α-syn overexpression in vivo. To accomplish this goal, we overexpressed human A53T-α- synuclein (hA53T-α-syn) in the rat nigrostriatal pathway, with or without treatment using the small molecule Mitochondrial Division Inhibitor-1 (mdivi-1), a putative inhibitor of the mitochondrial fission Dynamin-Related Protein-1 (Drp1). We show here that mdivi-1 reduced neurodegeneration, α-syn aggregates and normalized motor function. Mechanistically, mdivi-1 reduced mitochondrial fragmentation, mitochondrial dysfunction and oxidative stress. These in vivo results support the negative role of mutant α-syn in mitochondrial function and indicate that mdivi-1 has a high therapeutic potential for PD

Molecular regulation of mitochondrial dynamics by dynamin-related protein 1 (Drp1) and Bid in model systems of neuronal cell death

Mitochondrien sind Schlüsselorganelle in Signalwegen der neuronalen Apoptose und in Entwicklungs- und Alterungsprozessen der Zelle. Mitochondrien sind hoch dynamische Organelle, welche sich abhängig der physiologischen Bedingungen als lange miteinander verbundene Netzwerke oder als kleine, runde Organelle darstellen. Unter pathologischen Bedingungen und im neuronalen Zelltod ist die Regulation der Mitochondrienmorphologie deutlich verändert, wobei das Gleichgewicht der mitochondrialen Dynamik in Richtung Fragmentierung verschoben wird. Entsprechende Veränderungen der Mitochondrien treten z. B. im verzögerten neuronalen Zelltod nach Schlaganfall oder Schädel-Hirn-Trauma auf und vermehrt fragmentierte Mitochondrien sind auch in geschädigtem Hirngewebe bei alters-bedingten neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer und Morbus Parkinson nachgewiesen worden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde vor allem eine neuronale hippokampale Zelllinie (HT-22 Zellen) verwendet, um die Regulation und die Bedeutung der vermehrten Mitochondrienfragmentierung im oxidativen neuronalen Zelltod zu untersuchen. In diesen Zellen führt eine Behandlung mit Glutamat zu einem kontinuierlichen Abfall der intrazellulären Glutathionspiegel und induziert somit oxidativen Stress. Zusätzlich wurden primäre neuronale Zellkulturen und ein in vivo-Modell der zerebralen Ischämie eingesetzt, um die in HT-22 Zellen erhaltenen Ergebnisse zu bestätigen und auszubauen. Der erste Teil dieser Arbeit untersucht, ob verstärkte mitochondriale Fragmentierung den Glutamat-induzierten Zelltod begleitet. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass Glutamat-induzierte Apoptose mit einer verstärkten Fragmentierung von Mitochondrien, dem Verlust von mitochondrialen Membranpotential und einer Umverteilung von fragmentierten Mitochondrien um den Zellkern verbunden ist. Weiter zeigen die hier dargestellten Ergebnisse eine Schlüsselrolle für das BH3-Protein Bid in der mitochondrialen Fragmentierung auf, die durch den oxidativen Stress ausgelöst wurde. Der zweite Teil der Arbeit untersucht die Rolle des Dynamin Proteins Drp1 im neuronalen Zelltod nach Glutamat-Schädigung in HT-22 Zellen und in primären kortikalen Neuronen. Um die Rolle von Drp1 im Glutamat-induzierten Zelltod nachzuweisen, wurde in dem hier angewendeten Modellsystem des oxidativen Stress zum ersten Mal hoch spezifische Drp1 Inhibitoren und Drp1 siRNA angewendet. Die Deletion von Drp1 durch siRNA oder durch den Drp1 Inhibitor zeigen, das mitochondriale Membranpotential aufrechterhalten werden kann und die mitochondriale Fragmentierung in HT-22 Zellen, als auch in primären Neuronen verhindert werden. Der Drp1 Inhibitor blockierte zudem den neuronalen Zelltod nach Sauerstoff-Glukose-Entzug in primären Neuronen und verringert auch signifikant das Infarktvolumen in einem Schlaganfallmodell in Mäusen. Diese Daten heben Drp1 als einen Schlüsselfaktor bei ischämisch- und Glutamat-induziertem neuronalen Zelltod hervor und identifizierten Drp1-abhängige mitochondriale Fragmentierung als eine mögliche therapeutischen Zielstruktur für die Therapie von akuten zerebrovaskulären Erkrankungen. Weitere Untersuchungen zu einer möglichen Wechselwirkung zwischen Bid und Drp1 im neuronalen Zelltod zeigten zudem erstmalig, dass offenbar beide Proteine nach oxidativem Stress zusammen an der Mitochondrienmembran agieren, um intrinsische Signalkaskaden der Apoptose zu induzieren. Die Hemmung eines der Proteine war ausreichend, um die mitochondriale Translokation bzw. die toxischen Effekte des Partners an den Mitochondrien zu hemmen und so den neuronalen Zelltod zu verhindern. Insgesamt konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass Bid und Drp1 zusammen als Schlüsselregulatoren des mitochondrialen neuronalen Zelltodes in HT-22 Zellen agieren und das die Hemmung von Drp1 auch in primären Neuronen, und auch in einem Schlaganfallmodell in Mäusen eine protektive Wirkung vermittelt. Der Bid-vermittelte neuronale Zelltod umfasst Drp1-abhängige mitochondriale Fragmentierung, mitochondriale Umverteilung um den Zellkern, mitochondriale Membranschädigung und die Freisetzung von mitochondrialen Apoptose-Mediatoren wie AIF. Aus diesem Grund sind Bid und Drp1 vielversprechende therapeutische Zielstrukturen, die durch neuartige Inhibitor-Moleküle blockiert werden können, um mitochondriale Fragmentierung und Dysfunktion, als Kennzeichen des neuronalen Zelltodes bei akuten und chronischen neurodegenerativen Erkrankungen zu verhindern, in denen Glutamatschädigung bzw. oxidativer Stress zu den wesentlichen auslösenden Faktoren für die Nervenschädigung führen