Capture strategies of human catechol-Omethyltransferase from Komagataella pastoris lysates by gellan microspheres

Catechol-O-methyltransferase (COMT) has become an interesting biopharmaceutical target due to its possible association to some disorders, particularly to Parkinson’s disease (PD), where the development of new COMT inhibitors lead to an improvement in clinical treatments, which requires great quantities of this enzyme in a highly purified form, preserving its enzymatic activity. Since the 1960s, recombinant human soluble COMT (hSCOMT) has been extensively subjected to several purification strategies. However, some of them presented significant losses of hSCOMT activity and yield as the main drawbacks. Thus, the present work consists of developing retention and elution strategies to capture hSCOMT from complex Komagataella pastoris lysates through a batch method using gellan microspheres as the main capture method. Briefly, hSCOMT lysate was recovered from K. pastoris methanol-induced cultures and the gellan microspheres were formulated by water-in-oil emulsion technique and reinforced with a nickel or magnesium ion solution. The hSCOMT capture on gellan microspheres was performed through the batch method at room temperature (RT) and 4 ºC, using two strategies: the first one was based on the interaction between negative charges of gellan microspheres and hSCOMT positive residues (ionic strategy) and the second one was founded on the affinity of the hSCOMT to the divalent ions of gellan microspheres (affinity strategy). After optimization, the conditions that allowed the best outcomes with both microspheres formulations in the ionic strategy were the hSCOMT binding at pH 4.0 and elution with 500 mM and 100 mM NaCl, pH 6.2, at RT and 4 ºC, respectively. In the affinity strategy with nickel-crosslinker gellan microspheres, high levels of hSCOMT were captured at pH 7.5, containing 10 mM imidazole, which was mainly recovered with 150 mM NaCl and 300 mM imidazole, pH 7.5, at 4 ºC. In the affinity strategy with magnesium-crosslinked gellan microspheres, hSCOMT was practically all retained at pH 5.2, and eluted with 100 mM NaCl, pH 5.2, at RT, or with 250 mM NaCl and 500 mM MgCl2, pH 5.2, at 4 ºC. In conclusion, the present work demonstrated the gellan gum versatility in the microspheres formulation for the capture of hSCOMT, not only extrapolating a cation exchanger strand due to the anionic gellan molecules, but also extrapolating different affinity strategies with the divalent ions used in the microspheres reinforcement, thereby allowing the design of capture strategies more specific, efficient and adequate to the target molecules.A catecol-O-metiltransferase (COMT) tem sido descrita como um importante alvo biofarmacêutico devido à sua possível associação a algumas doenças neurológicas, nomeadamente a doença de Parkinson (PD), onde o desenvolvimento de novos inibidores da COMT tem levado a melhorias no tratamento da doença. Para o desenvolvimento de inibidores com um melhor perfil terapêutico é fundamental ter disponibilidade de amostras de COMT recombinante com elevado grau de pureza. De modo a satisfazer os requerimentos da indústria farmacêutica, torna-se imperativo implementar novas estratégias de isolamento e purificação céleres e com reprodutibilidade. O método de Batch surge como uma alternativa a técnicas cromatográficas para o isolamento de proteínas, sendo um método simples, rápido e de baixo custo, que tem a peculiaridade de ser altamente flexível em relação à natureza do material que constitui as partículas de captura. A goma de gelana é um exopolissacarídeo aniónico que tem a capacidade de formar géis com diferentes conformações e estrutura em função da concentração de polímero, temperatura, ambiente aquoso e presença de catiões mono e divalentes. Apesar da goma de gelana possuir inúmeras aplicações na indústria alimentar e biofarmacêutica, entre outras, a sua aplicação como uma matriz cromatográfica só começou a ser investigada recentemente devido não só às propriedades já mencionadas, mas também à sua porosidade, hidrofilicidade, elevada capacidade de ligação e aptidão para formar géis resistentes à temperatura e a condições acídicas extremas. Assim, o principal objetivo deste trabalho foi desenvolver estratégias de captura da isoforma solúvel humana recombinante da COMT (hSCOMT) obtida de lisados de Komagataella pastoris (K. pastoris) através de um método de Batch com microesferas de gelana, reforçando a sua aplicabilidade no isolamento de biomoléculas e clarificação de amostras. Para atingir tal objetivo, os lisados de hSCOMT foram obtidos de culturas de K. pastoris induzidas por metanol, enquanto que as microesferas de gelana foram formuladas pela técnica de emulsão de água em óleo e reforçadas com uma solução de iões níquel ou magnésio. As microesferas de gelana com níquel e magnésio como crosslinkers foram caracterizadas quanto ao diâmetro médio, morfologia e presença dos iões usados no crosslinking através de microscopia semiótica, microscopia eletrónica de varrimento e espetroscopia de raio X de energia dispersiva, respetivamente. As duas formulações de microesferas apresentaram uma estrutura uniforme e consistente de forma esférica. No entanto, as microesferas de gelana com magnésio como crosslinker apresentaram um diâmetro médio menor que aquelas formuladas com o ião níquel, uma vez que o magnésio tem um raio atómico maior, ocupando mais espaço entre as moléculas de gelana. Pela mesma razão, o conteúdo de magnésio foi menor do que o de níquel na análise elementar. De seguida, as duas formulações de microesferas de gelana foram aplicadas num método Batch para capturar a proteína hSCOMT através de duas estratégias desenvolvidas à temperatura ambiente (RT) e a 4 ºC: a primeira estratégia foi baseada na interação entre as cargas negativas das microesferas de gelana e os resíduos positivos da proteína hSCOMT (estratégia iónica) e a segunda na afinidade da hSCOMT para os iões divalentes das microesferas de gelana (estratégia de afinidade). Após otimização, as condições que deram origem aos melhores resultados de captura com ambas as formulações de microesferas de gelana na estratégia iónica foram a ligação da hSCOMT a pH 4.0 e eluição com 500 mM e 100 mM NaCl, pH 6.2, a RT e a 4 ºC, respetivamente. Na estratégia de afinidade ainda com as microesferas de gelana com níquel como crosslinker foram capturados elevados níveis de hSCOMT a pH 7.5 contendo 10 mM imidazole, e foi maioritariamente recuperada com 150 mM NaCl e 300 mM imidazole, pH 7.5, a 4 ºC. No caso das microesferas de gelana com magnésio como crosslinker, níveis elevados da proteína hSCOMT foram capturados a pH 5.2, e eluídos com 100 mM NaCl, pH 5.2, a RT, ou com 250 mM NaCl e 500 mM MgCl2, pH 5.2, a 4 ºC. De forma geral, todas as estratégias demonstraram ótimos resultados tanto à temperatura ambiente como a 4 ºC, permitindo uma retenção quase completa da proteína hSCOMT e a sua recuperação praticamente num único passo, dando origem a amostras bastante clarificadas e enriquecidas em hSCOMT através da eliminação de contaminantes noutros passos. Extrapolando a aplicação destas microesferas na captura de outras proteínas recombinantes, a estratégia de afinidade com as microesferas de gelana com níquel como crosslinker é mais adequada para proteínas que sejam produzidas com cauda de histidinas. Por outro lado, proteínas que possuam afinidade natural para iões divalentes, estes podem ser incorporados nas esferas, desenvolvendo-se assim uma estratégia de bioafinidade como foi o caso das microesferas com magnésio no presente trabalho. Em conclusão, este trabalho demostrou a versatilidade da goma de gelana na formulação de microesferas para captura da hSCOMT,que permitiu não só extrapolar uma vertente de trocador catiónico devido às moléculas aniónicas de gelana, mas também extrapolar diferentes interações de afinidade com os iões divalentes usados no reforço das microesferas, permitindo assim o design de estratégias de captura mais específicas, eficientes e adequadas à molécula alvo

O conhecimento matemático dos Professores de 1.º ciclo em Portugal

Durante muitas décadas, em todo o mundo, os esforços para se melhorar os sistemas educativos centraram-se sobretudo na organização e na gestão das escolas e na melhoria e na inovação dos currículos. Atualmente, a melhoria da qualidade de ensino e dos conhecimentos dos professores encontra-se na primeira linha dos fatores críticos a ter em conta para melhorar a educação, emergindo, assim, consequentemente, a relevância da avaliação dos professores. Neste perspetiva, com este trabalho, inserido no estudo do Doutoramento em Estudos da Criança, especialidade Matemática Elementar, na Universidade do Minho, iniciado em Outubro de 2014, com recurso a uma metodologia mista, vai-se investigar o conhecimento matemático dos professores do 1º ciclo, em Portugal. Para isso, definiu-se as seguintes questões de investigação: (1) O que se avalia nos docentes de 1.º ciclo em Portugal? (2) Como se caracteriza o conhecimento matemático de professores de 1.º ciclo em Portugal até 5 anos de serviço? (3) Que conhecimentos matemáticos revelam os professores de 1º ciclo sobre conceitos de geometria elementares? (4) Quais os obstáculos (de natureza cognitiva, didática, epistemológica e metacognitiva) na construção de conceitos geométricos elementares por parte de professores de 1.º ciclo em Portugal? A recolha de dados será feita recorrendo fundamentalmente a 4 técnicas: análise documental, donde se dastaca a analise das Provas de Avaliação de Conhecimentos e Capacidades – Componente Específica – Matemática nível 1 e respetivos resultados, questionário e entrevistas.CIEC - Centro de Investigação em Estudos da Criança, IE, UMinho (UI 317 da FCT), PortugalFundos Nacionais através da FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) e cofinanciado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) através do COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI) com a referência POCI-01-0145-FEDER-007562info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Mas afinal o que se avaliou na Componente Específica Matemática nível 1 da PACC e qual o desempenho dos professores na sua realização?

Os governos e os responsáveis políticos têm vindo a dar cada vez mais importância à avaliação dos alunos, professores, escolas e sistemas educativos, na medida que a avaliação tem vindo a ser cada vez mais vista como uma forma de se poder compreender como é que os alunos aprendem e de que forma é que os agentes do ato educativo devem agir de modo a que isto aconteça com sucesso. Nesta linha de ideias, este estudo irá centrar-se na análise da prova componente específica de Matemática nível 1, realizada em 2015, com o objetivo de se responder às seguintes questões de investigação: (1) Quais os conhecimentos matemáticos avaliados pela PACC componente específica – Matemática nível 1?; (2) Qual o desempenho dos professores dos grupos 110 e 230 na realização da PACC?Governments and policy makers have been giving increasing importance to the assessment of students, teachers, schools and education systems, to the extent that the assessment has been increasingly seen as a way to be able to understand how the students learn and how is that the agents of the educational act must act so that this success happen. In this line of ideas, this study will focus on the analysis of the specific component proof Mathematics level 1 , held in 2015 , in order to answer the following research questions : ( 1 ) What are the mathematical skills assessed by PACC specific component - Mathematics level 1 ?; ( 2 ) What is the group teacher performance 110 and 230 in the realization of PACC ?CIEC - Centro de Investigação em Estudos da Criança, IE, UMinho (UI 317 da FCT), PortugalFundos Nacionais através da FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) e cofinanciado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) através do COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI) com a referência POCI-01-0145-FEDER-007562info:eu-repo/semantics/publishedVersio

As constantes e variáveis da casa do emocional ao formal: a forma primitiva, a contemporaneidade e a (eco)sustentabilidade

Desde sempre o Homem procurou um lugar para ―habitar‖. A necessidade de se abrigar e a procura de um posicionamento no mundo, suscitaram a construção de um lugar; onde o Homem, para além de se abrigar fisicamente, abriga-se o seu Ser. Neste percurso, a forma estereotómica da caverna, deu lugar à tectónica insípida da cabana (arquétipo da casa e da arquitectura), e esta, por sua vez, fundamentou a origem da casa. Nesta medida, que a casa é equacionada como um lugar do habitar do Homem e, na sua essencialidade, determina a morada do mesmo, no mundo. A casa, como objecto arquitectónico, é composta por um conjunto de constantes e variáveis, que na sua essência, constroem a dimensão emocional e formal da casa (respectivamente). As evidências emocionais expõem a necessidade do homem encontrar na casa um lugar de morada e de-mora; onde deposita memórias e imagens, que lhe permitem reencontrar o aconchego do ventre materno, a segurança e os valores de intimidade do ninho primordial. As evidências formais, por sua vez, configuram esta mesma necessidade. É nesta relação essencial que o homem encontra o retorno às origens; consagrando as formas desta ―casa emocional‖, essencial; numa forma significante, universalmente reconhecida. Ao longo do tempo o conceito de casa foi delapidado pelo tempo e sujeito a mutáveis metamorfoses do homem e da sociedade. As dimensões (emocional e formal) da casa foram um papel químico das constantes mutações antropológicas, sociais, tecnológicas, políticas, filosóficas e mesmo arquitectónicas. O tempo dissolveu o homem fenomenológico, expondo o homem tecnológico e ―robotizado‖. A casa primordial (fenomenológica, existencialista) deixou de constituir o lugar único de morada e de-mora sobre o mundo, para passar a ser um objecto da cultura material, o símbolo tangível da face social do homem. A designada, ―casa da cidade‖ codificou o rumo da casa até à contemporaneidade. Hoje, o conceito de casa (e a Arquitectura em geral) exige uma nova dimensão (emocional e formal), mas; numa corrente quase oposta, pretende-se reencontrar a sua essencialidade. A demanda de um desenvolvimento ecologicamente sustentável, tem procurado reconstruir a relação entre o homem e o meio ambiente, e neste processo, a casa tem sido um modelo da arquitectura ecologicamente sustentável; procurando-se reencontrar soluções e práticas construtivas nos modelos da Arquitectura Vernacular. Como referência, salientamos as casas da Arquitectura Popular Portuguesa, onde os arquitectos portugueses têm recuperado técnicas e práticas construtivas, que permitem reintegrar a casa num processo cíclico, ecologicamente sustentável. As intuições tectónicas que caracterizam estas casas, são manifestações empíricas de processos eco-sustentáveis, que marcam a identidade da casa com o lugar natural, social e cultural onde se inserem

O conhecimento matemático de professores do 1.º ciclo em Portugal

Neste poster apresentamos uma parte de um projeto de Doutoramento, que ainda está na sua fase inicial e no qual se pretende investigar sobre o conhecimento matemático de professores do 1.º ciclo, em Portugal. Nesse âmbito, definiram-se quatro questões de investigação: (1) O que se avalia nos docentes de 1.º ciclo em Portugal? (2) Como se caracteriza o conhecimento matemático de professores de 1.º ciclo em Portugal até 5 anos de serviço? (3) Que conhecimentos matemáticos revelam os professores de 1.º ciclo sobre conceitos de geometria elementar? (4) Quais os obstáculos na construção de conceitos geométricos elementares por parte de professores de 1.º ciclo? Recorreremos a uma metodologia mista envolvendo métodos qualitativos e quantitativos.CIEC - Centro de Investigação em Estudos da Criança, IE, UMinho (UI 317 da FCT), PortugalFundos Nacionais através da FCT (Fundação para a Ciência e a Tecnologia) e cofinanciado pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) através do COMPETE 2020 – Programa Operacional Competitividade e Internacionalização (POCI) com a referência POCI-01-0145-FEDER-007562info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Peso e massa de um corpo

Na linguagem do nosso dia-a-dia, confundem-se muitas vezes Massa e Peso (Fiolhais, 2002). Usamos inúmeras vezes o termo “pesar” para designar a operação de determinar a massa de um corpo. Isto gera alguma confusão dando origem a ideias erradas (concepções alternativas), por vezes muito difíceis de eliminar. Neste relato pretendemos partilhar experiências, vividas numa aula de Ciências Físico-Químicas, que se revelaram muito positivas para nós na compreensão destes conceitos

Are we getting less sexist? a ten-year gap comparison analysis of sexism in a Portuguese sample

Widely and slowly, discrimination against women based upon gender has become socially unacceptable. However, less is known about how sexist beliefs have progressed in the last years and if we are responding to this social antagonizing of a sexist discourse. Our goal was to verify the existence of differences in ambivalent sexism and neosexism over a ten-year gap in a Portuguese adult sample and to assess possible modifications in the relationship between the variables. A cross-sectional, correlational study was conducted using two independent groups, with measures taken in 2009 and then in 2019. Both groups were invariant in terms of average age and proportion of sexes. Our results show a decrease in hostile and benevolent forms of sexism, while neosexism remains constant. The relationships between variables suggest that sexist beliefs are changing to accommodate subtler and modernized forms of sexism, like neosexism, that deny the existence of discrimination against women, resent discrimination complaints, and maintain a paternalistic view of women. Neosexism also seems to have a stronger correlation with hostile sexism than with benevolent forms of sexism in the male subsample. This relationship is stronger for the 2019 sample. These relationships suggest that sexism is more deeply rooted than we would like to admit and adapts to social discourse. Despite our best efforts, it is yet to be overcome.info:eu-repo/semantics/publishedVersio