Determination of lignocellulolytic properties and genetic study of wild microorganisms isolated from different brazilian regions for bioethanol production

Orientadores: Francisco Maugeri Filho, Gonçalo Amarante Guimarães PereiraTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: O etanol vem novamente despertando de modo crescente a atenção de pesquisadores, empresas e governo, devido ao aumento do preço do petróleo e perspectivas de esgotamento das fontes não-renováveis de combustíveis fósseis, bem como, preocupações de natureza ambiental, relacionadas à emissão de substâncias que comprometem o meio ambiente. O estabelecimento de metas extremamente ambiciosas para aumento do consumo do etanol nos próximos anos requer um aumento substancial da produção de etanol e, nesse sentido, estimula a pesquisa e o desenvolvimento de tecnologias que permitem o uso de novas matérias-primas na produção de etanol, como a biomassa lignocelulósica. No entanto a ampliação desta tecnologia é limitante devido ao alto custo das enzimas, indicando desta forma a importância da busca por novas fontes de enzimas capazes de contribuir para este processo. Em face disto, este trabalho teve como objetivo estudar as propriedades lignocelulolíticas de micro-organismos silvestres isolados de diversas regiões brasileiras, bem como realizar um estudo genético visando à produção de bioetanol. Inicialmente foi realizada uma seleção das cepas que apresentaram capacidade de produção de celulases, a partir de micro-organismos silvestres isolados de diversas regiões do país. Após a seleção, a cepa nomeada AAJ6 foi selecionada como potencial produtor de celulases e identificada molecularmente como Acremonium strictum. Posteriormente, foram realizados estudos de recuperação, purificação e caracterização enzimática das enzimas produzidas pelo microorganismo em estudo. A precipitação com acetona 60% foi o método que resultou em melhores porcentagens de recuperação, registrando 80,67% de recuperação para as endoglucanases (CMCase), 65% para a atividade de papel de filtro (FPase) e 25% para celobiase. Em relação à purificação, a resina Q-Sepharose foi selecionada como mais eficiente para a purificação das enzimas do complexo celulase produzidas por Acremonium strictum. Quanto à caracterização enzimática, as faixas de temperatura e pH estudadas não tiveram diferença significativa (p<0,05) em relação à atividade de endoglucanase (CMCase). Já para a atividade de FPase e celobiase, a faixa temperatura ótima foi de 54 a 57 °C e o pH ótimo foi de 4,7. Para a b-glicosidase, apenas a temperatura foi significativa, favorecendo temperaturas mais elevadas (54 a 57 °C) para a atividade enzimática. Paralelamente conduziram-se fermentações para produção de celulases empregando diferentes substratos, tanto substratos comerciais (carboximetilcelulose, SERVACEL® e AVICEL®) como bagaços de cana-de-açúcar pré¿tratados com diferentes intensidades. O bagaço de cana submetido a um pré-tratamento leve (12 kgf/cm²; 188,5°C) foi o que melhor induziu o micro-organismo em estudo a produzir as maiores atividades celulolíticas em comparação aos demais substratos estudados, registrando valores máximos de CMCase de 134,42 U/L em 240 horas de fermentação, 10,82 U/L de FPase em 192 horas, 27,72 U/L de celobiase em 96 horas e 3,48 U/L de b-glicosidase em 240 horas. Com o avanço da biotecnologia e da biologia molecular, a identificação de genes presentes num determinado micro-organismo já se tornou essencial. Em face disto, foi realizado o sequenciamento 454 do genoma do Acremonium strictum e dois genes de celulases foram identificados, sendo um gene de endoglucanase da família 74a e um gene de b-glicosidase. Estas enzimas foram isoladas, sequenciadas e clonadas em E.coli através do vetor pGEM-T Easy de forma que futuros trabalhos possam abordar os produtos de expressão destas enzimas em Saccharomyces cerevisiae visando à produção de bioetanol de segunda geraçãoAbstract: Ethanol has increasingly attracted the attention of researchers, companies and governments due to the increase in oil prices and prospects of depletion of nonrenewable fossil fuels, as well as environmental concerns related to emissions of substances that compromise the environment. Excessively ambitious goals for the increased consumption of ethanol in the for the years ahead requires a substantial increase in ethanol production and, accordingly, encourages research and development of technologies that allow the use of new raw materials for ethanol production, such as lignocellulosic biomass. However the expansion of this technology is limited due to the high cost of enzymes, thus indicating the importance of searching for new sources of enzymes able to contribute to this process. In the face of this, the present work intended to study the lignocellulolytic properties of wild microorganisms isolated from various regions of Brazil as well as conducting a genetic study aimed at producing bioethanol. Initially a selection of strains that were capable of producing cellulases was carried out. Than, the the selected strain, named AAJ6 and molecularly identified as Acremonium strictum, was shown to be a potential producer of cellulases. Subsequently, studies were performed for recovery, purification and characterization of the enzymes produced by this microorganism. Precipitation with 60% acetone was the method that led to improved recovery percentages, about 80%, for the endoglucanases (CMCase), 65% for filter paper activity (FPase) and 25% for cellobiase. With regard to purification, choromatographic column with Q-Sepharose resin was selected as the most efficient for the purification of the cellulase enzyme complex produced by Acremonium strictum. As enzymatic characterization, the temperature and pH ranges studied did not differ significantly (p<0.05) compared to the activity of endoglucanase (CMCase). As for the cellobiase and FPase activity, the optimum temperature range was 54 to 57 °C and optimum pH was 4.7. For the b-glucosidase, only temperature was significant, favoring higher temperatures (54 to 57 °C) for enzyme activity. Parallel fermentations were conducted for cellulase production using different cellulosic substrates (carboxymethylcellulose, SERVACEL® and AVICEL ®) and sugarcane bagasse pretreated with different intensities. Bagasse that underwent t mild pretreatment (12 kgf/cm², 188.5 °C) was the best inducer for microorganism under study, and led to the highest cellulolytic activities, being the maximum values 134.42 U/L U/L for CMCase after 240 hours of fermentation, 10.82 U/L for FPase after 192 hours, 27.72 U/L for cellobiase after 96 hours and 3.48 U/L for b-glucosidase after 240 hours. At the current stage of biotechnology and molecular biology, the identification of genes present in a given micro-organism has become essential. In view of this, the 454 sequencing of the genome of Acremonium strictum was carried out and two cellulase genes were identified, being an endoglucanase of the family 74a gene and b-glucosidase gene. These enzymes were isolated, sequenced and cloned into E. coli using the pGEM-T Easy vector so that future work can address the expression products of these enzymes in Saccharomyces cerevisiae in order to produce second generation bioethanolDoutoradoEngenharia de AlimentosDoutora em Engenharia de Alimento

Ferulic acid and derivatives: molecules with potential application in the pharmaceutical field

Ferulic acid is a phenolic acid widely distributed in the plant kingdom. It presents a wide range of potential therapeutic effects useful in the treatments of cancer, diabetes, lung and cardiovascular diseases, as well as hepatic, neuro and photoprotective effects and antimicrobial and anti-inflammatory activities. Overall, the pharmaceutical potential of ferulic acid can be attributed to its ability to scavenge free radicals. However, recent studies have revealed that ferulic acid presents pharmacological properties beyond those related to its antioxidant activity, such as the ability to competitively inhibit HMG-CoA reductase and activate glucokinase, contributing to reduce hypercholesterolemia and hyperglycemia, respectively. The present review addresses ferulic acid dietary sources, the pharmacokinetic profile, antioxidant action mechanisms and therapeutic effects in the treatment and prevention of various diseases, in order to provide a basis for understanding its mechanisms of action as well as its pharmaceutical potential.O ácido ferúlico é um ácido fenólico amplamente distribuído no reino vegetal. Ele apresenta uma ampla gama de potenciais efeitos terapêuticos utéis no tratamento do câncer, diabetes, doenças pulmonares e cardiovasculares, bem como efeitos hepáticos, neuro e fotoprotetores, atividades antimicrobianas e anti-inflamatórias. O potencial farmacêutico do ácido ferúlico pode ser atribuído à sua capacidade em sequestrar radicais livres. No entanto, estudos recentes revelaram que o ácido ferúlico apresenta propriedades farmacológicas, além da sua atividade antioxidante, como a capacidade de inibir competitivamente a HMG-CoA redutase e ativar a glucoquinase, contribuindo para reduzir a hipercolesterolemia e hiperglicemia, respectivamente. A presente revisão aborda as fontes dietéticas de ácido ferúlico, o perfil farmacocinético, os mecanismos de ação como antioxidante e efeitos terapêuticos no tratamento e prevenção de várias doenças, de modo a proporcionar uma base para a compreensão dos seus mecanismos de ação, bem como os seus potenciais farmacêuticos

Relação entre o nitrogênio total e não-protéico na cianobactéria Aphanothece microscopica Nägeli

A Aphanothece microscopica Nägeli é uma cianobactéria que vem sendo estudada NO sentido de associar o tratamento de efluente com a produção de proteína unicelular. Estudos relatam que esse microorganismo apresenta elevado teor de proteína com alto valor biológico, podendo ser utilizado como complemento na dieta alimentar. Deve ser salientado, em relação à quantificação de proteína, o fato de multiplicar-se o conteúdo de nitrogênio total pelo fator 6,25. Isso gera a necessidade de um estudo das frações nitrogenadas encontradas nessa biomassa, visando à quantificação de proteína em termos reais. Assim, o trabalho tem como objetivo determinar o teor de nitrogênio total e não-protéico da cianobactéria Aphanothece microscopica Nägeli nas diferentes fases de crescimento quando cultivada NO efluente da parboilização do -1 arroz e NO meio sintético BG 11. Foram realizados experimentos com inóculo de 300 mg.L na fase exponencial de crescimento. NO meio sintético, AS condições de cultivo foram: 30°C, aeração constante, fotoperíodo de 12 horas e 2 klux de luminosidade. Para o efluente da parboilização do arroz, AS condições de cultivo foram: ausência de luminosidade, 30°C, razão C/N 50, pH 8,0 e aeração constante. AS amostras foram coletadas nas diferentes fases de crescimento e submetidas às determinações de nitrogênio total, nitrogênio não-protéico e nitrogênio amoniacal intracelular. Os resultados demonstram que o nitrogênio total reduz da fase logarítmica para a fase estacionária independente do meio. O nitrogênio não-protéico perfaz importante percentual do nitrogênio total, sendo o íon amônio um dos principais componentes do nitrogênio intracelular presentes na Aphanothece microscopica Nägeli. PALAVRAS-CHAVES: Cianobactéria, Aphanothece, nitrogenados, fases de crescimento, efluente da parboilização do arro

Avaliação da cor da cianobactéria - aphanothece microscopica nägeli - em diferentes condiçõesde secagem

O processamento térmico é considerado um dos mais importantes métodos de preservação de alimentos. A secagem pode ser descrita como um método de preservação em que a umidade e a atividade de água são reduzidas, minimizando a deterioração bioquímica e microbiológica. No entanto, durante o processamento o material pode ser exposto a temperaturas que causam efeitos adversos na qualidade, principalmente no que se refere a alterações na cor. É reportado que muitas reações podem afetar a cor durante o processamento térmico de materiais biológicos. A degradação de pigmentos como carotenóides e clorofilas é considerado o principal mecanismo de degradação da cor de tais produtos. Nesse sentido, o trabalho teve por objetivos avaliar a influência da operação de secagem na cor e no conteúdo de clorofila a da biomassa da cianobactéria Aphanothece microscopica Nägeli cultivada no efluente da parboilização do arroz. A biomassa foi produzida em reator cilíndrico descontínuo, nas condições de ausência de luminosidade, 100 mgL-1 de inóculo, 30ºC, pH 8,0, razão C/N 50 e tempo de detenção hidráulica de 72 h. A biomassa foi separada do efluente por centrifugação e seca nas temperaturas de 40, 50 e 60ºC e espessuras de 3, 5 e 7 mm, em um secador descontínuo de bandejas. As determinações de cor foram feitas em colorímetro Minolta série CR 300 e a clorofila a determinada espectrofotometricamente. Os resultados demonstram a influência da operação de secagem na cor e no conteúdo de clorofila a da biomassa. Palavras-chave: cianobactéria, secagem, clorofila a, cor

Low-frequency ultrasound with short application time improves cellulase activity and reducing sugars release

In this study, we investigated the effect of ultrasound (US) on the activity of commercial cellulase (Celluclast (R) 1.5 L) in the absence and in the presence of a cellulosic substrate (Avicel (R), 2% w.v(-1)) using a central composite rotatable design. Sonication time (10 to 330 s), US intensity (120.6 to 263.7 W cm(-2)), and reaction temperature (25 to 50 degrees C) were varied using a horn-type ultrasound reactor, and endoglucanase (CMCase) and total cellulase (FPase) activities were determined. US intensity had a positive effect on enzyme activity. Under optimal conditions (170 s, 180.8 W cm(-2), and 25 degrees C), CMCase activity was 13% higher than that of the control. In the presence of substrate, CMCase activity increased by 33.87% and K-M reduced by 23% in relation to that of the control. The theoretical yield of cellulose was 42.08%. Cellulase activity can be improved by US treatment to maximize productivity gains and reduce costs in second-generation ethanol production, by the action of a low-frequency ultrasound with a short ultrasonication time of applicationCNPQ - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoFAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa Do Estado De São Paulo444422/2014-504602-3/2016; 11932-7/201

Increase of reducing sugars release by enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse intensified by ultrasonic treatment

The purpose of this study was to evaluate the effect of ultrasonic treatment on the activity of commercial cellulases and on the efficiency of the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse. The influence of ultrasound on the hydrolysis of sugarcane bagasse (2% w v(-1)) was assessed using commercial enzymes (Celluclase (R) 1.5 L and Cellic (R) CTec2) in a central composite rotatable design (CCRD) to determine the effect of ultrasound intensity, time and temperature of reaction medium. The enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse was enhanced by the application of ultrasound, leading to an 89.37% higher concentration of reducing sugars in comparison with the control (unsonicated sample) under the optimal conditions validated for Celluclast 1.5 L (150.7 W cm(-2), 330 s, 25 degrees C). A high concentration of reducing sugars (91.81% higher than the control) and a 66.31% theoretical cellulose yield were obtained using the enzyme cocktail Cellic CTec2 under optimal conditions (150.7 W cm(-2), 75 s, 30 degrees C). Ultrasonication under appropriate conditions led to favorable results: increased catalytic activity of cellulases and increased degree of hydrolysis of the lignocellulosic substrate. These results evidence the potential of ultrasonic treatment in improving the performance of enzyme cocktails used for the hydrolysis of sugarcane bagasse122481489CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal e Nível SuperiorCNPQ - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoFAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa Do Estado De São Paulonão tem444422/2014-504602-3/2016; 11932-7/201