Untersuchungen zum Katalysemechanismus von Methyl-Coenzym M Reduktase (MCR) aus methanogenen Archaea

Die Bildung von Methan erfolgt in allen methanogenen Archeaen durch die Reduktion von Methyl-Coenzym M (CH3-S-CoM) mit Coenzym B (HS-CoB) zu CH4 und dem Heterodisulfid CoM-S-S-CoB. Diese Reaktion, die mit Umkehr der Stereokonfiguration der Methylgruppe erfolgt, wird in einem ternären Komplex-Mechanismus von Methyl-Coenzym M Reduktase (MCR) katalysiert. Das sauerstofflabile Enzym ist aus drei verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt, die in einem α2β2γ2 Hexamer angeordnet sind und zwei strukturell verknüpfte aktive Zentren ausbilden, in denen je ein Molekül des Nickelporphinoids Faktors F430 als prosthetische Gruppe wirkt. Im aktiven Enzym befindet sich F430 in der Oxidationsstufe Ni(I) und läßt sich durch seine paramagnetische Eigenschaft mittels Elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR)-Spektroskopie detektieren. Derzeit lassen sich für MCR fünf EPR-aktive und zwei EPR-inaktive (silent) Zustände definieren: die enzymatisch aktiven Zustände MCR-red1 und MCR-red2, sowie die enzymatisch inaktiven Zustände MCR-ox1, MCR-ox2, MCR-ox3, MCR-ox1-silent und MCR-silent. Von den beiden Ni(II)-Formen ohne EPR Signal (MCR-ox1-silent und MCR-silent) liegen detaillierte Kristallstrukturen vor, die zusammen mit biochemischen Eigenschaften zur Formulierung von zwei alternativen Katalysemechanismen geführt haben: Mechanismus I favorisiert einen nukleophilen Angriff von Ni(I) auf die Methylgruppe von CH3-S-CoM, was zur Bildung einer Methyl-Ni(III)F430-Zwischenstufe führt. Dagegen postuliert Mechanismus II die Entstehung eines Methylradikals aufgrund eines Angriffs von Ni(I) auf den Thioetherschwefel von CH3-S-CoM. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Methyl-Coenzym M- und Coenzym B-Substratanaloga auf die enzymatische Akivität und den Nickel-Redoxzustand von MCR untersucht, um tiefere Einblicke in den Katalysemechanismus dieses Enzyms zu erhalten. Neben Aktivitätsmessungen wurden dazu im wesentlichen EPR-spektroskopische Untersuchungen durchgeführt. Analoga des Substrats CH3-S-CoM wurden aufgrund ihrer Wirkung in drei Gruppen unterteilt: (i) Reversible Inhibitoren wie Ethyl-Coenzym M, Propyl-Coenzym M, Allyl-Coenzym M und Coenzym M (HS-CoM), in deren Gegenwart der Ni(I)-Zustand erhalten blieb. Von den vier Inhibitoren wurde nur Ethyl-Coenzym M reduziert, allerdings mit einer katalytischen Effizienz, die geringer als 1% der Effizienz mit Methyl-Coenzym M war; (ii) Irreversible Inhibitoren wie 2-Bromoethansulfonat, 3-Bromopropionat, Cyano-Coenzym M, Seleno-Coenzym M und Trifluoromethyl-Coenzym M, die nach Zugabe zu aktiver MCR das Ni(I)-EPR-Signal auslöschten und bei Anwesenheit von HS-CoB zur Induktion eines isotropen Radikalsignals führten. Die Reaktivität des Ni(I)-Zustandes gegenüber dieser Gruppe von Inhibitoren wurde in Gegenwart von HS-CoB um das 10-fache gesteigert; und (iii) Irreversible Inhibitoren wie 3-Bromopropansulfonat, 3-Iodopropansulfonat und 4-Bromobutyrat, in deren Gegenwart das EPR Signal von aktiver MCR in das MCR-BPS-Signal umgewandelt wurde. Das MCR-BPS-Signal ist denen der MCRox-Signale ähnlich und wurde wie diese in Gegenwart von 2-Bromoethansulfonat nicht ausgelöscht. Messungen des magnetischen zirkularen Dichroismus (MCD) identifizierten Nickel im MCR-ox1-Zustand als High Spin Ni(II), welches axial mit einem Thiyl-Radikal koordiniert ist. Analog dazu könnte das MCR-BPS-Signal von einem Alkyl-Ni(III)-Zustand stammen. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit beschäftigt sich mit dem MCR-red2-Zustand, der im Enzym in Gegenwart von HS-CoM und HS-CoB induziert wird und durch ein rhombisches EPR-Signal charakterisiert ist. Eine solche Induktion wurde neben HS-CoB ebenfalls für die zwei HS-CoB-Analoga HS-CoB6 und Methyl-CoB beobachtet. Durch den Einsatz von 33S-markiertem Coenzym M konnte eindeutig gezeigt werden, daß im MCR-red2-Zustand der Thioetherschwefel von HS-CoM axial mit dem Ni(I) aus F430 koordiniert ist. Das Ausmaß der MCR-red2 Induktion durch HS-CoM und HS-CoB zeigte sich in den Untersuchungen abhängig von der Temperatur. Unterhalb von 20oC wandelte sich der red2-Zustand mit sinkender Temperatur mehr und mehr in den red1-Zustand um. Oberhalb von 20oC allerdings lagen nur maximal 50% des Enzyms im red2-Zustand vor, was u. a. dafür spricht, daß sich jeweils nur eines der beiden aktiven Zentren von MCR im red2-Zustand befindet. Dies weist auf eine Halbseitenreaktivität von MCR hin, was für eine phasenversetzte Kopplung der beiden aktiven Zentren, ähnlich wie in einem Zweitaktmotor, spricht

Untersuchungen zum Katalysemechanismus von Methyl-Coenzym M Reduktase (MCR) aus methanogenen Archaea

Die Bildung von Methan erfolgt in allen methanogenen Archeaen durch die Reduktion von Methyl-Coenzym M (CH3-S-CoM) mit Coenzym B (HS-CoB) zu CH4 und dem Heterodisulfid CoM-S-S-CoB. Diese Reaktion, die mit Umkehr der Stereokonfiguration der Methylgruppe erfolgt, wird in einem ternären Komplex-Mechanismus von Methyl-Coenzym M Reduktase (MCR) katalysiert. Das sauerstofflabile Enzym ist aus drei verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt, die in einem α2β2γ2 Hexamer angeordnet sind und zwei strukturell verknüpfte aktive Zentren ausbilden, in denen je ein Molekül des Nickelporphinoids Faktors F430 als prosthetische Gruppe wirkt. Im aktiven Enzym befindet sich F430 in der Oxidationsstufe Ni(I) und läßt sich durch seine paramagnetische Eigenschaft mittels Elektronenparamagnetischer Resonanz (EPR)-Spektroskopie detektieren. Derzeit lassen sich für MCR fünf EPR-aktive und zwei EPR-inaktive (silent) Zustände definieren: die enzymatisch aktiven Zustände MCR-red1 und MCR-red2, sowie die enzymatisch inaktiven Zustände MCR-ox1, MCR-ox2, MCR-ox3, MCR-ox1-silent und MCR-silent. Von den beiden Ni(II)-Formen ohne EPR Signal (MCR-ox1-silent und MCR-silent) liegen detaillierte Kristallstrukturen vor, die zusammen mit biochemischen Eigenschaften zur Formulierung von zwei alternativen Katalysemechanismen geführt haben: Mechanismus I favorisiert einen nukleophilen Angriff von Ni(I) auf die Methylgruppe von CH3-S-CoM, was zur Bildung einer Methyl-Ni(III)F430-Zwischenstufe führt. Dagegen postuliert Mechanismus II die Entstehung eines Methylradikals aufgrund eines Angriffs von Ni(I) auf den Thioetherschwefel von CH3-S-CoM. In der vorliegenden Arbeit wurde die Wirkung von Methyl-Coenzym M- und Coenzym B-Substratanaloga auf die enzymatische Akivität und den Nickel-Redoxzustand von MCR untersucht, um tiefere Einblicke in den Katalysemechanismus dieses Enzyms zu erhalten. Neben Aktivitätsmessungen wurden dazu im wesentlichen EPR-spektroskopische Untersuchungen durchgeführt. Analoga des Substrats CH3-S-CoM wurden aufgrund ihrer Wirkung in drei Gruppen unterteilt: (i) Reversible Inhibitoren wie Ethyl-Coenzym M, Propyl-Coenzym M, Allyl-Coenzym M und Coenzym M (HS-CoM), in deren Gegenwart der Ni(I)-Zustand erhalten blieb. Von den vier Inhibitoren wurde nur Ethyl-Coenzym M reduziert, allerdings mit einer katalytischen Effizienz, die geringer als 1% der Effizienz mit Methyl-Coenzym M war; (ii) Irreversible Inhibitoren wie 2-Bromoethansulfonat, 3-Bromopropionat, Cyano-Coenzym M, Seleno-Coenzym M und Trifluoromethyl-Coenzym M, die nach Zugabe zu aktiver MCR das Ni(I)-EPR-Signal auslöschten und bei Anwesenheit von HS-CoB zur Induktion eines isotropen Radikalsignals führten. Die Reaktivität des Ni(I)-Zustandes gegenüber dieser Gruppe von Inhibitoren wurde in Gegenwart von HS-CoB um das 10-fache gesteigert; und (iii) Irreversible Inhibitoren wie 3-Bromopropansulfonat, 3-Iodopropansulfonat und 4-Bromobutyrat, in deren Gegenwart das EPR Signal von aktiver MCR in das MCR-BPS-Signal umgewandelt wurde. Das MCR-BPS-Signal ist denen der MCRox-Signale ähnlich und wurde wie diese in Gegenwart von 2-Bromoethansulfonat nicht ausgelöscht. Messungen des magnetischen zirkularen Dichroismus (MCD) identifizierten Nickel im MCR-ox1-Zustand als High Spin Ni(II), welches axial mit einem Thiyl-Radikal koordiniert ist. Analog dazu könnte das MCR-BPS-Signal von einem Alkyl-Ni(III)-Zustand stammen. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit beschäftigt sich mit dem MCR-red2-Zustand, der im Enzym in Gegenwart von HS-CoM und HS-CoB induziert wird und durch ein rhombisches EPR-Signal charakterisiert ist. Eine solche Induktion wurde neben HS-CoB ebenfalls für die zwei HS-CoB-Analoga HS-CoB6 und Methyl-CoB beobachtet. Durch den Einsatz von 33S-markiertem Coenzym M konnte eindeutig gezeigt werden, daß im MCR-red2-Zustand der Thioetherschwefel von HS-CoM axial mit dem Ni(I) aus F430 koordiniert ist. Das Ausmaß der MCR-red2 Induktion durch HS-CoM und HS-CoB zeigte sich in den Untersuchungen abhängig von der Temperatur. Unterhalb von 20oC wandelte sich der red2-Zustand mit sinkender Temperatur mehr und mehr in den red1-Zustand um. Oberhalb von 20oC allerdings lagen nur maximal 50% des Enzyms im red2-Zustand vor, was u. a. dafür spricht, daß sich jeweils nur eines der beiden aktiven Zentren von MCR im red2-Zustand befindet. Dies weist auf eine Halbseitenreaktivität von MCR hin, was für eine phasenversetzte Kopplung der beiden aktiven Zentren, ähnlich wie in einem Zweitaktmotor, spricht

Two sub-states of the red2 state of methyl-coenzyme M reductase revealed by high-field EPR spectroscopy

Methyl-coenzyme M reductase (MCR) catalyzes the formation of methane from methyl-coenzyme M and coenzyme B in methanogenic archaea. The enzyme has two structurally interlinked active sites embedded in an α2β2γ2 subunit structure. Each active site has the nickel porphyrinoid F430 as a prosthetic group. In the active state, F430 contains the transition metal in the Ni(I) oxidation state. The active enzyme exhibits an axial Ni(I)-based continuous wave (CW) electron paramagnetic resonance (EPR) signal, called red1a in the absence of substrates or red1c in the presence of coenzyme M. Addition of coenzyme B to the MCR-red1 state can partially and reversibly convert it into the MCR-red2 form, which shows a rhombic Ni(I)-based EPR signal (at X-band microwave frequencies of approximately 9.4GHz). In this report we present evidence from high-field/high-frequency CW EPR spectroscopy (W-band, microwave frequency of approximately 94GHz) that the red2 state consists of two substates that could not be resolved by EPR spectroscopy at X-band frequencies. At W-band it becomes apparent that upon addition of coenzyme B to MCR in the red1c state, two red2 EPR signals are induced, not one as was previously believed. The first signal is the well-characterized (ortho)rhombic EPR signal, thus far called red2, while the second previously unidentified signal is axial. We have named the two substates MCR-red2r and MCR-red2a after their rhombic and axial signals, respectivel

Coordination and binding geometry of methyl-coenzyme M in the red1m state of methyl-coenzyme M reductase

Methane formation in methanogenic Archaea is catalyzed by methyl-coenzyme M reductase (MCR) and takes place via the reduction of methyl-coenzyme M (CH3-S-CoM) with coenzyme B (HS-CoB) to methane and the heterodisulfide CoM-S-S-CoB. MCR harbors the nickel porphyrinoid coenzyme F430 as a prosthetic group, which has to be in the Ni(I) oxidation state for the enzyme to be active. To date no intermediates in the catalytic cycle of MCRred1 (red for reduced Ni) have been identified. Here, we report a detailed characterization of MCRred1m ("m” for methyl-coenzyme M), which is the complex of MCRred1a ("a” for absence of substrate) with CH3-S-CoM. Using continuous-wave and pulse electron paramagnetic resonance spectroscopy in combination with selective isotope labeling (13C and 2H) of CH3-S-CoM, it is shown that CH3-S-CoM binds in the active site of MCR such that its thioether sulfur is weakly coordinated to the Ni(I) of F430. The complex is stable until the addition of the second substrate, HS-CoB. Results from EPR spectroscopy, along with quantum mechanical calculations, are used to characterize the electronic and geometric structure of this complex, which can be regarded as the first intermediate in the catalytic mechanis

More Than 200 Genes Required for Methane Formation from H2 and CO2 and Energy Conservation Are Present in Methanothermobacter marburgensis and Methanothermobacter thermautotrophicus

The hydrogenotrophic methanogens Methanothermobacter marburgensis and Methanothermobacter thermautotrophicus can easily be mass cultured. They have therefore been used almost exclusively to study the biochemistry of methanogenesis from H2 and CO2, and the genomes of these two model organisms have been sequenced. The close relationship of the two organisms is reflected in their genomic architecture and coding potential. Within the 1,607 protein coding sequences (CDS) in common, we identified approximately 200 CDS required for the synthesis of the enzymes, coenzymes, and prosthetic groups involved in CO2 reduction to methane and in coupling this process with the phosphorylation of ADP. Approximately 20 additional genes, such as those for the biosynthesis of F430 and methanofuran and for the posttranslational modifications of the two methyl-coenzyme M reductases, remain to be identified

An ancient pathway combining carbon dioxide fixation with the generation and utilization of a sodium ion gradient for ATP synthesis

Synthesis of acetate from carbon dioxide and molecular hydrogen is considered to be the first carbon assimilation pathway on earth. It combines carbon dioxide fixation into acetyl-CoA with the production of ATP via an energized cell membrane. How the pathway is coupled with the net synthesis of ATP has been an enigma. The anaerobic, acetogenic bacterium Acetobacterium woodii uses an ancient version of this pathway without cytochromes and quinones. It generates a sodium ion potential across the cell membrane by the sodium-motive ferredoxin:NAD oxidoreductase (Rnf). The genome sequence of A. woodii solves the enigma: it uncovers Rnf as the only ion-motive enzyme coupled to the pathway and unravels a metabolism designed to produce reduced ferredoxin and overcome energetic barriers by virtue of electron-bifurcating, soluble enzymes

Binding of coenzyme B induces a major conformational change in the active site of methyl-coenzyme M reductas

Methyl-coenzyme M reductase (MCR) is the key enzyme in methane formation by methanogenic Archaea. It converts the thioether methyl-coenzyme M and the thiol coenzyme B into methane and the heterodisulfide of coenzyme M and coenzyme B. The catalytic mechanism of MCR and the role of its prosthetic group, the nickel hydrocorphin coenzyme F(430), is still disputed, and no intermediates have been observed so far by fast spectroscopic techniques when the enzyme was incubated with the natural substrates. In the presence of the competitive inhibitor coenzyme M instead of methyl-coenzyme M, addition of coenzyme B to the active Ni(I) state MCR(red1) induces two new species called MCR(red2a) and MCR(red2r) which have been characterized by pulse EPR spectroscopy. Here we show that the two MCR(red2) signals can also be induced by the S-methyl- and the S-trifluoromethyl analogs of coenzyme B. (19)F-ENDOR data for MCR(red2a) and MCR(red2r) induced by S-CF(3)-coenzyme B show that, upon binding of the coenzyme B analog, the end of the 7-thioheptanoyl chain of coenzyme B moves closer to the nickel center of F(430) by more than 2 A as compared to its position in both, the Ni(I) MCR(red1) form and the X-ray structure of the inactive Ni(II) MCR(ox1-silent) form. The finding that the protein is able to undergo a conformational change upon binding of the second substrate helps to explain the dramatic change in the coordination environment induced in the transition from MCR(red1) to MCR(red2) forms and opens the possibility that nickel coordination geometries other than square planar, tetragonal pyramidal, or elongated octahedral might occur in intermediates of the catalytic cycle

Methyl-Coenzyme M Reductase from Methanogenic Archaea: Isotope Effects on Label Exchange and Ethane Formation with the Homologous Substrate Ethyl-Coenzyme M

Ethyl-coenzyme M (CH₃CH₂-S-CH₂CH₂-SO₃^–, Et-S-CoM) serves as a homologous substrate for the enzyme methyl-coenzyme M reductase (MCR) resulting in the product ethane instead of methane. The catalytic reaction proceeds via an intermediate that already contains all six C–H bonds of the product. Because product release occurs after a second, rate-limiting step, many cycles of intermediate formation and reconversion to substrate occur before a substantial amount of ethane is released. In deuterated buffer, the intermediate becomes labeled, and C–H activation in the back reaction rapidly leads to labeled Et-S-CoM, which enables intermediate formation to be detected. Here, we present a comprehensive analysis of this pre-equilibrium. ²H- and ¹³C-labeled isotopologues of Et-S-CoM were used as the substrates, and the time course of each isotopologue was followed by NMR spectroscopy. A kinetic simulation including kinetic isotope effects allowed determination of the primary and α- and β-secondary isotope effects for intermediate formation and for the C–H/C–D bond activation in the ethane-containing intermediate. The values obtained are in accordance with those found for the native substrate Me-S-CoM (see preceding publication, Scheller, S.; Goenrich, M.; Thauer, R. K.; Jaun, B. J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, DOI: 10.1021/ja406485z10.1021/ja406485z) and thus imply the same catalytic mechanism for both substrates. The experiment by Floss and co-workers, demonstrating a net inversion of configuration to chiral ethane with CH₃CDT-S-CoM as the substrate, is compatible with the observed rapid isotope exchange if the isotope effects measured here are taken into account

Methyl-Coenzyme M Reductase from Methanogenic Archaea: Isotope Effects on the Formation and Anaerobic Oxidation of Methane

The nickel enzyme methyl-coenzyme M reductase (MCR) catalyzes two important transformations in the global carbon cycle: methane formation and its reverse, the anaerobic oxidation of methane. MCR uses the methyl thioether methyl-coenzyme M (CH₃-S-CH₂CH₂-SO₃^–, Me-S-CoM) and the thiol coenzyme B (CoB-SH) as substrates and converts them reversibly to methane and the corresponding heterodisulfide (CoB-S-S-CoM). The catalytic mechanism is still unknown. Here, we present isotope effects for this reaction in both directions, catalyzed by the enzyme isolated from Methanothermobacter marburgensis. For methane formation, a carbon isotope effect (¹²CH₃-S-CoM/¹³CH₃-S-CoM) of 1.04 ± 0.01 was measured, showing that breaking of the C–S bond in the substrate Me-S-CoM is the rate-limiting step. A secondary isotope effect of 1.19 ± 0.01 per D in the methyl group of CD₃-S-CoM indicates a geometric change of the methyl group from tetrahedral to trigonal planar upon going to the transition state of the rate-limiting step. This finding is consistent with an almost free methyl radical in the highest transition state. Methane activation proceeds with a primary isotope effect of 2.44 ± 0.22 for the C–H vs C–D bond breakage and a secondary isotope effect corresponding to 1.17 ± 0.05 per D. These values are consistent with isotope effects reported for oxidative cleavage/reductive coupling occurring at transition metal centers during C–H activation but are also in the range expected for the radical substitution mechanism proposed by Siegbahn et al. The isotope effects presented here constitute boundary conditions for any suggested or calculated mechanism