Rastreamento da mutação R337H TP53, diagnóstico precoce do tumor de córtex adrenal e histórico de câncer em famílias do Estado do Paraná

Orientador : Prof. Dr. Roberto PontaroloCo-orientador : Prof. Dr. Bonald C. FigueiredoTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 06/06/2011Bibliografia: fls. 101-110Área de concentração: Análises ClínicasResumo: Introdução. A incidência do tumor de córtex adrenal (TCA) é marcadamente alta no Estado do Paraná, onde mais de 95% dos pacientes herdaram a mutação germinativa R337H TP53 de um dos pais. O desconhecimento da existência da mutação impede uma ação preventiva contra o TCA avançado, assim como a falta de dados sobre o risco para outros tipos de câncer em crianças e adultos dificulta o planejamento epidemiológico e o aconselhamento genético. O presente trabalho foi proposto com o objetivo de esclarecer estes questionamentos. Métodos: Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa em seres humanos do Hospital de Clínicas da UFPR, do Hospital Pequeno Príncipe e pela CONEP em 2005 e em 2009 (com novos objetivos). Foram coletadas amostras de sangue periférico para a identificação da mutação R337H TP53 por meio da técnica de PCRRFLP. A confirmação da mutação foi feita por meio do sequenciamento do exon 10 do gene TP53 e pelo achado da mesma mutação em outras pessoas da família. O acompanhamento ambulatorial das crianças com a mutação R337H se baseou nos exames periódicos médicos, em ecografias abdominais e concentrações plasmáticas de hormônios adrenocorticais. Os resultados preliminares de heredogramas das famílias com a mutação R337H revelaram casos de carcinoma de plexo coroide (CPC) com a mutação, o que motivou a pesquisa para esclarecer se há incidência aumentada de CPC no Paraná. Resultados: De dezembro de 2005 a março de 2010, 171.649 RN, de um total de 180.000, participaram do rastreamento da mutação R337H TP53. Foram identificados 461 RN (0,27%) com a mutação. Dezenove casos de TCA foram diagnosticados no grupo de RN (n=13) ou no grupo de parentes abaixo de 15 anos de idade (n=6) durante esta coorte. Além disso, 34 casos de TCA foram revelados (31 crianças e 3 adultos) no histórico sobre câncer das famílias avaliadas (n=343 famílias). Das crianças que participaram do protocolo de vigilância ambulatorial, oito (2,4%) desenvolveram o TCA. Das crianças restantes portadoras da mutação e que não participaram do protocolo de vigilância, nove (2,5%) desenvolveram o TCA. As crianças com diagnóstico de TCA a partir do protocolo de vigilância ambulatorial apresentaram média de tamanho de tumores estatisticamente menor (apenas no estadio I) do que as que não participaram do protocolo (7 casos nos estadios II ou III, incluindo um óbito). Em 63,3% (14/22) dos pacientes com CPC foi identificada a mutação R337H. Ao contrário, dos 100% de LOH identificado em casos de TCA, o mesmo percentual não aconteceu nos casos de CPC. Conclusões. Este estudo demonstra a viabilidade do rastreamento neonatal para a detecção da mutação R337H e tratamento precoce de crianças com TCA, o que sugere que tal procedimento deveria ser incluído no Programa de Triagem Neonatal existente nos Estados brasileiros com uma frequência da mutação semelhante à da população do Paraná (1/371). Esta mutação é responsável por mais de 60% dos casos de CPC, sugerindo uma incidência pelo menos duas vezes maior desta neoplasia no Estado do Paraná do que em outras regiões onde não ocorre a mutação R337H.Abstract: Introduction. The incidence of adrenocortical tumor (ACT) is remarkably high in Parana State (Southern Brazil), where over 95% of patients inherited the germline R337H TP53 mutation from a parent. Lack of knowledge about the mutation prevents a preventive action against advanced ACT. Likewise, lack of data on the risk for other types of cancer in children hamper the epidemiological monitoring and genetic counsling. This study was proposed to clarify these questions. Methods. This study was approved by the Ethics Committee for Research in Humans from the Hospital de Clínicas from UFPR, from the Pequeno Príncipe Hospital, and by CONEP in 2005 and 2009 (with new goals). Peripheral blood samples were collected for DNA analysis of the R337H mutation of the TP53 gene using the PCR-RFLP assay. Confirmation of the mutation was performed by sequencing of the TP53 exon 10 and by the identification of the same mutation in other family members. Outpatient Children with the R337H mutation was based on periodic medical examination, abdominal ultrasound and plasma concentrations of adrenocortical hormones. Preliminary analysis of the pedigrees of the families revealed cases of choroid plexus carcinoma (CPC) with the mutation and encouraged further study to verify whether there is increased incidence of CPC in Paraná state. Results. From December 2005 to March 2010, 171.649 newborns from a total of 180.000 were recruited for the screening of the R337H TP53 mutation. We identified 461 infants (0.27%) with this mutation. Nineteen cases of ACT were diagnosed in the group of newborns (n = 13) or in the group of relatives under 15 years of age (n = 6) in this cohort. In addition, 34 cases of ACT (31 children and 3 adults) were identified through the family history of cancer (n=353 families). Of the newborns who have participated of the surveillance program, eight (2.4%) developed TCA. Of the remaining newborns with the mutation who were not in the surveillance program, nine (2.5%) developed ACT. Children diagnosed with ACT through the surveillance program presented tumors with average size statistically smaller (only stage I) than those who did not attend the surveillance program (7 cases in stages II or III, including one deceased child). In 63.3% (14/22) of the patients with CPC was identified the germline R337H mutation. Unlike the ACT with 100% LOH, a lower percentage of LOH was found in CPC. Conclusions. This study demonstrates the feasibility of the neonatal screening to detect and treat precociously the ACT from children with the R337H mutation, suggesting that the neonatal screening for the R337H mutation should be included in the neonatal screening program in the Brazilian states with a similar frequency of mutation found in Paraná state (1/371). This mutation is responsible for more than 60% of the CPC cases in children, suggesting an incidence at least twice higher in Paraná than in other regions without the mutation R337H

Prevalencia do alelo TP53 R337H no estado do Parana

Orientador : Bonald C. FigueiredoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 2006Inclui bibliografiaResumo: A incidência de Tumor de Córtex Adrenal (TCA) pediátrico no Estado do Paraná é de 12 a 18 vezes maior do que em qualquer outro lugar do mundo e a principal causa é a mutação no gene TP53 R337H, localizada no cromossomo 17p13.1. Um grande número de famílias podem ser portadoras desta mutação no Paraná. A estimativa preliminar da prevalência desta mutação na população do Paraná era de 1/1500, baseada em um estudo recente (30 famílias/41 crianças com TCA). O conhecimento da prevalência exata desse gene na população é o primeiro passo para esclarecer sua distribuição geográfica e racial, assim como facilitar outros estudos para esclarecer o que pode ou não contribuir para a formação do TCA e outros tipos de câncer. Os objetivos deste estudo são estimar a prevalência desta mutação entre os recém-nascidos (RNs), verificar a distribuição nas diferentes regiões e grupos étnicos do Paraná e investigar a evidência de mutação de novo. Instituições de 235 cidades foram convidadas e aceitaram participar deste estudo, atingindo-se um total de 30098 RNs investigados. A coleta de sangue foi realizada de maneira escalonada entre dezembro/2005 a novembro/2006, até atingir aproximadamente 65% dos nascidosvivos/ mês. O percentual de mães que aceitaram fazer o teste nos seus RNs e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) foi próximo de 100%. Todos os RNs foram identificados por código de barras e aqueles que apresentaram a mutação no primeiro teste de triagem (testando-se o DNA de três RNs simultaneamente) foram submetidos a uma segunda punção lateral do calcâneo para teste confirmatório (com amostras individuais). As amostras foram analisadas por PCR-RFLP (Reação em Cadeia da Polimerase - Polimorfismo de Fragmentos de DNA obtidos por Enzimas de Restrição), usando-se a enzima HhA I que corta o produto amplificado do TP53 selvagem (reconhecendo a seqüência CGCG ). O alelo com a mutação (contendo a seqüência CACG) é identificado pela presença de uma banda não digerida de 447pb. Após a confirmação da mutação, os pais dos RNs foram questionados em relação à cor da pele e etnia. A mutação foi identificada em 64 RNs (64/30098), gerando uma prevalência média de 2,12/1000. A prevalência foi estimada com maior precisão em 7 regionais de saúde do Estado (1,52 a 3,9/1000), com diferença estatisticamente significativa em algumas delas em relação à prevalência média do Estado. O percentual de distribuição dos grupos raciais na família do RN segregando o alelo TP53 R337H variou de 62,5% (brancos) a 12,5% (morenos), 12,5% (negros) e 12,5% (índios). Entre o grupo de pele branca, a descendência mais freqüente foi de italianos (35,7%), portugueses (14,4%), brasileiros (14,4%), alemães (7,1%), poloneses (7,1%), espanhóis (7,1%), libaneses (7,1%) e franceses (7,1%). Nenhuma descendência japonesa, chinesa ou outra raça oriental foi encontrada. Os resultados obtidos nesse estudo permitiram encontrar uma prevalência da mutação TP53 R337H três vezes maior do que a previamente estimada, o que sugere que a penetrância do TCA é menor que a previamente calculada. Contudo, várias famílias apresentaram histórico de outros tipos de câncer, especialmente câncer de mama, o que deve ser investigado posteriormente. Devido ao número limitado de famílias investigadas, ainda é inviável estimar a prevalência em grupos raciais / étnicos ou a predominância da mutação em várias regiões do Estado. Este é o primeiro estudo que utiliza um teste de DNA para avaliar a relação entre gene e câncer em RNs.Abstract: The incidence of childhood adrenocortical tumor (ACT) in State of Paraná is 12-18 times higher than in northern Brazil or other countries and the main reason is the TP53 R337H mutation located at chromosome 17p13.1. A large number of families were expected to carrier this mutation in Paraná. The preliminary estimation of prevalence for this mutation in the population of Paraná was 1/1500 based on a recent study (30 families/41 children with ACT). Knowledge of the accurate prevalence of this gene in the population is the first step towards clarification of the geographical and racial distribution and adress the question whether it may or not contribute to formation of ACT and other types of cancer. The goals of this study were to estimate the prevalence of this mutation among newborns, verify whether the distribution is homogeneous among different regions and racial groups of Paraná and investigate evidence of de novo mutation. Institutions from 235 cities were invited and have accepted to participate in this study, reaching 30098 tested newborns. The blood samples were collected between December/2005 and November/2006, until reaching 65% of the newborns/month in Paraná state. The percentage of mothers who accepted to do the test was close to 100% and they had to sign the informed consent form (ICF). All newborns were coded and those presenting the mutation in the first screening test (containing a DNA pool of three newborns) were submitted to a second heal-prick blood test (for individual samples). Samples were screened by PCR-RFLP (Polimerase Chain Reaction - Restriction Length Polymorphism) analysis, using the restriction enzyme HhA I to cut the wild type amplified product (cutting site CGCG) into two fragments of 193 and 254 bp. The mutated allele (cutting site CACG) is identified by the presence of the undigested band size (447pb). After confirmation of the mutation, the newborn parents were inquired about skin color and etnia of the parental side segregating the mutation. Sixty-four newborns (64/30098) were found with the mutation giving rise to a mean prevalence of 2.12/1000. The prevalence range among the geographical regions of the state, denominated "Health Regionals", was more accurately estimated for 7 of them (1.52 to 3.9/1000) resulting in a statistically significant difference in relation to mean prevalence for the state. The percentage of the racial group in the family of mother or of father segregating the TP53 R337H allele varied from 62.5% (white), to 12.5% (brown), 12.5% (black) and 12.5% (indians). Among the white skin group, the most frequently reported descendants were Italian (35.7%), Portuguese (14.4%), Brazilian (14.4%), German (7.1%), Polish (7.1%), Spanish (7.1%), Libanese (7.1%) and French (7.1%). No descendant of Japanese, Chinese or other oriental were found. The mean prevalence of the TP53 R337H mutation in State of Paraná is three times higher than previously estimated, which suggests that the penetrance for ACT is lower than previously reported. However, family history for other types of cancer were also found, specially breast cancer, which suggest risk for other types of cancer that must be further investigated. Given the limited number of families investigated so far, it is still unable to estimate prevalence of racial group/etnia or the predominance of the mutation in the several regions of the state. This was the first study using a DNA test to study a cancer related gene in newborns

Impact of Early Postnatal Androgen Exposure on Voice Development

Background: the impact of early postnatal androgen exposure on female laryngeal tissue may depend on certain characteristics of this exposure. We assessed the impact of the dose, duration, and timing of early androgen exposure on the vocal development of female subjects who had been treated for adrenocortical tumor (ACT) in childhood.Methods: the long-term effects of androgen exposure on the fundamental vocal frequency (F0), vocal pitch, and final height and the presence of virilizing signs were examined in 9 adult (age, 18.4 to 33.5 years) and 10 adolescent (13.6 to 17.8 years) female ACT patients. We also compared the current values with values obtained 0.9 years to 7.4 years after these subjects had undergone ACT surgery, a period during which they had shown normal androgen levels.Results: of the 19 subjects, 17 (89%) had been diagnosed with ACT before 4 years of age, 1 (5%) at 8.16 years, and 1 (5%) at 10.75 years. Androgen exposure (2 to 30 months) was sufficiently strong to cause pubic hair growth in all subjects and clitoromegaly in 74% (14/19) of the subjects, but did not reduce their height from the target value. Although androgen exposure induced a remarkable reduction in F0 (132 Hz) and moderate pitch virilization in 1 subject and partial F0 virilization, resulting in F0 of 165 and 169 Hz, in 2 subjects, the majority had normal F0 ranging from 189 to 245 Hz.Conclusions: Female laryngeal tissue is less sensitive to androgen exposure between birth and adrenarche than during other periods. Differential larynx sensitivity to androgen exposure in childhood and F0 irreversibility in adulthood are age-, concentration-, duration-, and timing-dependent events that may also be affected by exposure to inhibitory or stimulatory hormones. Further studies are required to better characterize each of these factors.Brazilian State of Parana Secretary of Science, Technology and Higher Education (SETI)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Raul Carneiro Hospital Association for Childhood Protection (AHPIRC)American Lebanese Syrian Associated Charities (ALSAC)SETIAHPIRCALSACInst Pesquisa Pele Pequeno Principe, Curitiba, Parana, BrazilHosp Pequeno Principe, Curitiba, Parana, BrazilFac Pequeno Principe, Curitiba, Parana, BrazilInst Voz Maringa, Maringa, Parana, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Fonoaudiol, São Paulo, BrazilClin Voz, Curitiba, Parana, BrazilIrmandade Santa Casa Misericordia São Paulo, São Paulo, BrazilUniv Fed Parana, Dept Saude Comunitaria, BR-80060000 Curitiba, Parana, BrazilUniversidade Federal de São Paulo, Dept Fonoaudiol, São Paulo, BrazilWeb of Scienc

Increased Incidence of Choroid Plexus Carcinoma Due to the Germline TP53 R337H Mutation in Southern Brazil

International audienceBACKGROUND: Choroid plexus carcinomas (CPC) are rare tumors predominantly found in children. Given the high frequency of the germline R337H mutation in the TP53 gene in southern Brazil, we have evaluated the frequency of the R337H mutation in families with CPC in children. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: The present series included 29 patients that were admitted to the same institution from 1992 to 2010, including 22 children with CPC (0.08-13.6 years of age at diagnosis) and 7 children with papilloma of the choroid plexus (Pp; 0.5-9.8 years of age). Surgical resection was possible in 28 children. Blood and/or tumor DNA was extracted and analyzed using PCR-RFLP and results were confirmed by sequencing 240 bp of the TP53 exon 10. The patients, all parents, and some relatives submitted samples for blood DNA analysis. In addition, we have also examined the presence of the mutation in DNA from paraffin-embedded tumor samples to evaluate loss of heterozygosity. We found 63.3% (14/22) of the CPC patients positive for the germline R337H mutation; CPC samples were either heterozygous (n = 7), lost only the wild-type (n = 4), or only the R337H copy (n = 2). One CPC sample was not available. All Pp cases (7/7, 100%) were negative for R337H. Cure (>5 years survival free of disease) was observed in 18.1% of the CPC cases with the R337H mutation (2/11), 71.4% of the Pp (5/7), and 25% of CPC cases negative for the R337H mutation (2/8). Family history of cancer (with 2 or more cancer cases) was exclusively identified on the parental side segregating the R337H mutation, and 50% (7/14) of them were compatible with Li-Fraumeni-like syndrome. SIGNIFICANCE: Our results show for the first time that the R337H TP53 mutation is responsible for 63% of the CPC cases in children, suggesting a higher incidence of CPC in southern Brazil

Prevalencia do alelo TP53 R337H no estado do Parana

Orientador : Bonald C. FigueiredoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Defesa: Curitiba, 2006Inclui bibliografiaResumo: A incidência de Tumor de Córtex Adrenal (TCA) pediátrico no Estado do Paraná é de 12 a 18 vezes maior do que em qualquer outro lugar do mundo e a principal causa é a mutação no gene TP53 R337H, localizada no cromossomo 17p13.1. Um grande número de famílias podem ser portadoras desta mutação no Paraná. A estimativa preliminar da prevalência desta mutação na população do Paraná era de 1/1500, baseada em um estudo recente (30 famílias/41 crianças com TCA). O conhecimento da prevalência exata desse gene na população é o primeiro passo para esclarecer sua distribuição geográfica e racial, assim como facilitar outros estudos para esclarecer o que pode ou não contribuir para a formação do TCA e outros tipos de câncer. Os objetivos deste estudo são estimar a prevalência desta mutação entre os recém-nascidos (RNs), verificar a distribuição nas diferentes regiões e grupos étnicos do Paraná e investigar a evidência de mutação de novo. Instituições de 235 cidades foram convidadas e aceitaram participar deste estudo, atingindo-se um total de 30098 RNs investigados. A coleta de sangue foi realizada de maneira escalonada entre dezembro/2005 a novembro/2006, até atingir aproximadamente 65% dos nascidosvivos/ mês. O percentual de mães que aceitaram fazer o teste nos seus RNs e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) foi próximo de 100%. Todos os RNs foram identificados por código de barras e aqueles que apresentaram a mutação no primeiro teste de triagem (testando-se o DNA de três RNs simultaneamente) foram submetidos a uma segunda punção lateral do calcâneo para teste confirmatório (com amostras individuais). As amostras foram analisadas por PCR-RFLP (Reação em Cadeia da Polimerase - Polimorfismo de Fragmentos de DNA obtidos por Enzimas de Restrição), usando-se a enzima HhA I que corta o produto amplificado do TP53 selvagem (reconhecendo a seqüência CGCG ). O alelo com a mutação (contendo a seqüência CACG) é identificado pela presença de uma banda não digerida de 447pb. Após a confirmação da mutação, os pais dos RNs foram questionados em relação à cor da pele e etnia. A mutação foi identificada em 64 RNs (64/30098), gerando uma prevalência média de 2,12/1000. A prevalência foi estimada com maior precisão em 7 regionais de saúde do Estado (1,52 a 3,9/1000), com diferença estatisticamente significativa em algumas delas em relação à prevalência média do Estado. O percentual de distribuição dos grupos raciais na família do RN segregando o alelo TP53 R337H variou de 62,5% (brancos) a 12,5% (morenos), 12,5% (negros) e 12,5% (índios). Entre o grupo de pele branca, a descendência mais freqüente foi de italianos (35,7%), portugueses (14,4%), brasileiros (14,4%), alemães (7,1%), poloneses (7,1%), espanhóis (7,1%), libaneses (7,1%) e franceses (7,1%). Nenhuma descendência japonesa, chinesa ou outra raça oriental foi encontrada. Os resultados obtidos nesse estudo permitiram encontrar uma prevalência da mutação TP53 R337H três vezes maior do que a previamente estimada, o que sugere que a penetrância do TCA é menor que a previamente calculada. Contudo, várias famílias apresentaram histórico de outros tipos de câncer, especialmente câncer de mama, o que deve ser investigado posteriormente. Devido ao número limitado de famílias investigadas, ainda é inviável estimar a prevalência em grupos raciais / étnicos ou a predominância da mutação em várias regiões do Estado. Este é o primeiro estudo que utiliza um teste de DNA para avaliar a relação entre gene e câncer em RNs.Abstract: The incidence of childhood adrenocortical tumor (ACT) in State of Paraná is 12-18 times higher than in northern Brazil or other countries and the main reason is the TP53 R337H mutation located at chromosome 17p13.1. A large number of families were expected to carrier this mutation in Paraná. The preliminary estimation of prevalence for this mutation in the population of Paraná was 1/1500 based on a recent study (30 families/41 children with ACT). Knowledge of the accurate prevalence of this gene in the population is the first step towards clarification of the geographical and racial distribution and adress the question whether it may or not contribute to formation of ACT and other types of cancer. The goals of this study were to estimate the prevalence of this mutation among newborns, verify whether the distribution is homogeneous among different regions and racial groups of Paraná and investigate evidence of de novo mutation. Institutions from 235 cities were invited and have accepted to participate in this study, reaching 30098 tested newborns. The blood samples were collected between December/2005 and November/2006, until reaching 65% of the newborns/month in Paraná state. The percentage of mothers who accepted to do the test was close to 100% and they had to sign the informed consent form (ICF). All newborns were coded and those presenting the mutation in the first screening test (containing a DNA pool of three newborns) were submitted to a second heal-prick blood test (for individual samples). Samples were screened by PCR-RFLP (Polimerase Chain Reaction - Restriction Length Polymorphism) analysis, using the restriction enzyme HhA I to cut the wild type amplified product (cutting site CGCG) into two fragments of 193 and 254 bp. The mutated allele (cutting site CACG) is identified by the presence of the undigested band size (447pb). After confirmation of the mutation, the newborn parents were inquired about skin color and etnia of the parental side segregating the mutation. Sixty-four newborns (64/30098) were found with the mutation giving rise to a mean prevalence of 2.12/1000. The prevalence range among the geographical regions of the state, denominated "Health Regionals", was more accurately estimated for 7 of them (1.52 to 3.9/1000) resulting in a statistically significant difference in relation to mean prevalence for the state. The percentage of the racial group in the family of mother or of father segregating the TP53 R337H allele varied from 62.5% (white), to 12.5% (brown), 12.5% (black) and 12.5% (indians). Among the white skin group, the most frequently reported descendants were Italian (35.7%), Portuguese (14.4%), Brazilian (14.4%), German (7.1%), Polish (7.1%), Spanish (7.1%), Libanese (7.1%) and French (7.1%). No descendant of Japanese, Chinese or other oriental were found. The mean prevalence of the TP53 R337H mutation in State of Paraná is three times higher than previously estimated, which suggests that the penetrance for ACT is lower than previously reported. However, family history for other types of cancer were also found, specially breast cancer, which suggest risk for other types of cancer that must be further investigated. Given the limited number of families investigated so far, it is still unable to estimate prevalence of racial group/etnia or the predominance of the mutation in the several regions of the state. This was the first study using a DNA test to study a cancer related gene in newborns

Survival and history of cancer in the families of children with CPC or Pp negative for the R337H mutation.

<p>CSR, Complete surgical removal; Ct, Chemotherapy;</p><p>*Parental side with higher number of cancer cases;</p><p>**>5 years free of disease.</p

Typical pedigrees.

<p>The pedigrees of families with the germline <i>TP53</i> R337H mutation illustrate three different patterns of allele combinations shown in the digital photos of the gel, with loss of the wt allele in A (lane 1: DNA ladder; lane 2: PCR product from CPC DNA treated with <i>HhaI</i> and lane 3 with PCR product from the patient's blood DNA treated with <i>HhaI</i>), loss of the R337H copy in B (lane 1: DNA ladder; lane 2: PCR product from CPC DNA treated with <i>HhaI</i> and lane 3 with PCR product from the father's blood DNA treated with <i>HhaI</i>), and without any loss shown in C (lane 1: DNA ladder; lane 2: PCR product from CPC DNA treated with <i>HhaI</i> and lane 3 with PCR product from the patient's blood DNA treated with <i>HhaI</i>).</p