Mécanisme d'intégration des signaux RTK-dépendants par la protéine d'échafaudage CNK au sein de la voie de signalsiation RAS/MAPK chez la drosophile

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal

Identification des activateurs potentiels de la protéine kinase ZPK

Les protéines kinases sont principalement impliquées dans la transmission des signaux de la membrane jusqu'au noyau. Notre laboratoire s'intéresse à ces mécanismes et en particulier à l'un de ses membres nommé ZPK (zipper protein kinase). Cette dernière est une sérine/thréonine kinase appartenant à la famille des MLKs (mixed-lineage kinases). Des travaux antérieurs ont suggéré l'implication de la protéine ZPK dans la régulation des processus de prolifération et de différenciation cellulaire. La caractérisation de ses mécanismes d'action au sein des voies de signalisation reste encore inexploré. Nous savons cependant que la protéine kinase ZPK est impliquée dans l'activation de la voie des JNKs (c-jun N-terminal kinases). Nous avons donc tenté d'éclaircir ces mécanismes en identifiant les agents susceptibles de stimuler l'activité de ZPK par la réalisation d'études d'activation. Ces analyses ont été effectuées en mesurant directement ou indirectement les modulations de son activité (endogène ou transfectée), suite à des stimulations, à l'aide d'essais kinases in vitro. L'identification précise de ces activateurs n'a pu être établi, principalement en raison de la difficulté à mesurer directement l'activité intrinsèque de ZPK. Cependant, la méthode indirecte du"pull down" a permis de suggérer l'implication de ZPK dans la voie des JNKs suite à des stimulations. Par la suite, nous avons voulu vérifier l'existence d'une relation entre la localisation de ZPK et sa capacité d'activer la voie des JNKs. Les résultats semblent suggérer une telle corrélation sans toutefois nous permettre de la confirmer avec certitude

Identification des activateurs potentiels de la protéine kinase ZPK

Les protéines kinases sont principalement impliquées dans la transmission des signaux de la membrane jusqu'au noyau. Notre laboratoire s'intéresse à ces mécanismes et en particulier à l'un de ses membres nommé ZPK (zipper protein kinase). Cette dernière est une sérine/thréonine kinase appartenant à la famille des MLKs (mixed-lineage kinases). Des travaux antérieurs ont suggéré l'implication de la protéine ZPK dans la régulation des processus de prolifération et de différenciation cellulaire. La caractérisation de ses mécanismes d'action au sein des voies de signalisation reste encore inexploré. Nous savons cependant que la protéine kinase ZPK est impliquée dans l'activation de la voie des JNKs (c-jun N-terminal kinases). Nous avons donc tenté d'éclaircir ces mécanismes en identifiant les agents susceptibles de stimuler l'activité de ZPK par la réalisation d'études d'activation. Ces analyses ont été effectuées en mesurant directement ou indirectement les modulations de son activité (endogène ou transfectée), suite à des stimulations, à l'aide d'essais kinases in vitro. L'identification précise de ces activateurs n'a pu être établi, principalement en raison de la difficulté à mesurer directement l'activité intrinsèque de ZPK. Cependant, la méthode indirecte du"pull down" a permis de suggérer l'implication de ZPK dans la voie des JNKs suite à des stimulations. Par la suite, nous avons voulu vérifier l'existence d'une relation entre la localisation de ZPK et sa capacité d'activer la voie des JNKs. Les résultats semblent suggérer une telle corrélation sans toutefois nous permettre de la confirmer avec certitude

A KSR/CNK complex mediated by HYP, a novel SAM domain-containing protein, regulates RAS-dependent RAF activation in Drosophila

RAF is a critical effector of the small GTPase RAS in normal and malignant cells. Despite intense scrutiny, the mechanism regulating RAF activation remains partially understood. Here, we show that the scaffold KSR (kinase suppressor of RAS), a RAF homolog known to assemble RAF/MEK/ERK complexes, induces RAF activation in Drosophila by a mechanism mediated by its kinase-like domain, but which is independent of its scaffolding property or putative kinase activity. Interestingly, we found that KSR is recruited to RAF prior to signal activation by the RAF-binding protein CNK (connector enhancer of KSR) in association with a novel SAM (sterile α motif) domain-containing protein, named Hyphen (HYP). Moreover, our data suggest that the interaction of KSR to CNK/HYP stimulates the RAS-dependent RAF-activating property of KSR. Together, these findings identify a novel protein complex that controls RAF activation and suggest that KSR does not only act as a scaffold for the MAPK (mitogen-activated protein kinase) module, but may also function as a RAF activator. By analogy to catalytically impaired, but conformationally active B-RAF oncogenic mutants, we discuss the possibility that KSR represents a natural allosteric inducer of RAF catalytic function

KSR is a scaffold required for activation of the ERK/MAPK module

Mechanisms that regulate signal propagation through the ERK/MAPK pathway are still poorly understood. Several proteins are suspected to play critical roles in this process. One of these is Kinase Suppressor of Ras (KSR), a component previously identified in RAS-dependent genetic screens in Drosophila and Caenorhabditis elegans. Here, we show that KSR functions upstream of MEK within the ERK/MAPK module. In agreement with this, we found that KSR facilitates the phosphorylation of MEK by RAF. We further show that KSR associates independently with RAF and MEK, and that these interactions lead to the formation of a RAF/MEK complex, thereby positioning RAF in close proximity to its substrate MEK. These findings suggest that KSR functions as a scaffold that assembles the RAF/MEK functional pair

Bimodal regulation of RAF by CNK in Drosophila

Connector enhancer of KSR (CNK) is a multidomain-containing protein previously identified as a positive regulator of the RAS/MAPK pathway in Drosophila. Using transfection experiments and an RNAi-based rescue assay in Drosophila S2 cells, we demonstrate that CNK has antagonistic properties with respect to RAF activity. We show that CNK’s N-terminal region contains two domains (SAM and CRIC) that are essential for RAF function. Unexpectedly, we also report that the C-terminal region of CNK contains a short bipartite element that strongly inhibits RAF catalytic function. Interestingly, CNK’s opposite properties appear to prevent signaling leakage from RAF to MEK in the absence of upstream signals, but then transforms into a potent RAF activator upon signal activation. Together, these findings suggest that CNK not only participates in the elusive RAF activation process, but might also contribute to the switch-like behavior of the MAPK module

Increase in neuroendocrine cells in the duodenal mucosa of patients with refractory celiac disease

OBJECTIVES: Several immune-mediated gastrointestinal disorders, including celiac disease (CD), are associated with neuroendocrine cell hyperplasia. However, neuroendocrine cells have never been explored in refractory CD (RCD). METHODS: Serial duodenal sections from 17 patients with RCD (6 type 1 and 11 type 2), 16 uncomplicated CD patients before and after gluten-free diet, 14 patients with potential CD, 27 patients with non-CD villous atrophy, i.e., common variable immunodeficiency (n=12), Whipple's disease (n=10) and giardiasis (n=5), and 16 healthy subjects were processed for the immunohistochemical detection of chromogranin A (CgA), serotonin, and somatostatin. Mucosal tryptophan hydroxylase (TpH)-1 and serotonin-selective reuptake transporter (SERT) transcripts were measured by quantitative reverse transcription-PCR. Serum CgA and 24-h urine 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA) were assessed. Biopsies from treated CD patients were cultured with serotonin or peptic tryptic digest of gliadin (PT-gliadin), and interferon (IFN)-γ was detected by ELISA in culture supernatants. RESULTS: Epithelial cells positive for CgA and serotonin, but not somatostatin, were significantly increased in RCD. Raised mucosal transcripts of TpH-1, but not SERT, were found in RCD. On biopsies from treated CD patients, serotonin upregulated IFN-γ production at levels comparable to those induced by PT-gliadin. Serum CgA, but not urine 5-HIAA, was increased in RCD. No significant difference was found between RCD type 1 and type 2 in terms of neuroendocrine cells, mucosal TpH-1 transcripts, and serum CgA. CONCLUSIONS: Serotonin-producing neuroendocrine cells are increased in RCD mucosa. IFN-γ upregulation induced by serotonin suggests that this monoamine may have a role in sustaining the local inflammatory response in CD