ETUDE DE LA DEACETYLASE HDAC6 : UNE ENZYME MULTIFONCTIONNELLE

HDAC6 is a multifunctional enzyme with two tandem catalytic domains and an ubiquitin binding domain. Mainly cytoplasmic, HDAC6 is associated with microtubules, and deacetylates tubulin on lysine 40. Furthermore, cellular management of misfolded proteins and aggresomes is modulated by HDAC6 action. This protein also regulates the acetylation of various proteins, like histones or HSP90, and is involved in several cellular processes. First of all, my work describes additional functions of HDAC6 in stress response. I show that HDAC6 controls HSPs genes activation and the cellular recovery process within the context of cellular stress response. Then the discovery of SE14 domain in the human HDAC6 is an original aspect of this study. This domain is a key element in the human HDAC6 retention in the cytoplasm. Moreover in vitro and in vivo experiences have shown that integrity of both deacetylation domains is required for HDAC6 activity. Finally, this work shows that HDAC6 is involved in osteoclast differentiation. Indeed HDAC6 interacts with mDIA2 and is probably involved in the rearrangement of the cytosqueletton during osteoclast maturation.L'histone déacétylase HDAC6 est une enzyme multifonctionnelle possédant deux domaines déacétylases en tandem et un domaine fixant l'ubiquitine. Localisée exclusivement dans le cytoplasme, cette protéine peut déacétyler les microtubules acétylés et participer à la prise en charge des protéines ubiquitinées lors de la formation d'agrésomes. Elle possède également une activité sur d'autres substrats comme les histones ou HSP90, et elle contribue à divers processus cellulaires. Le travail présenté dans cette thèse décrit un rôle supplémentaire de cette déacétylase dans la réponse après un stress. Il vise à comprendre comment HDAC6 participe dans les mécanismes d'activation des gènes HSPs, et dans les processus de récupération cellulaire à la suite d'un choc thermique. La découverte d'un nouveau domaine nommé SE14 chez la protéine HDAC6 humaine, présente un dispositif supplémentaire de régulation nucléocytoplasmique pour cette protéine. Ce domaine permet la rétention dans le cytoplasme de cette protéine en renforçant le mécanisme d'export nucléaire. A coté de ce contrôle, le fonctionnement des deux domaines déacétylases est analysé. Des expériences in vitro et in vivo confirment l'importance de l'arrangement spatial des deux domaines dans la réaction de déacétylation. Finalement, ce travail montre que la protéine HDAC6 intervient lors de la différenciation ostéoclastique. Par son activité catalytique sur les microtubules acétylés et grâce à son interaction avec l'effecteur mDIA2, cette déacétylase est impliquée dans la maturation des ostéoclastes

Two catalytic domains are required for protein deacetylation.

International audienceHistone deacetylase (HDAC)-6 was recently identified as a dual substrate, possibly multisubstrate, deacetylase that can act both on acetylated histone tails and on alpha-tubulin acetylated on Lys40. HDAC-6 is unique among deacetylases in having two hdac domains, and we have used this enzyme as a useful model to dissect the structural requirements for the deacetylation reaction. In this report, we show that both hdac domains are required for the intact deacetylase activity of HDAC-6 in vitro and in vivo. The spatial arrangement of these two domains in HDAC-6 is essential and alteration of the linker region between the two domains severely affects the catalytic activity. Artificial chimeric HDACs, made by replacing the hdac domains in HDAC-6 with corresponding domains from other class II HDACs, show de novo deacetylase activity. Taken together, our results demonstrate for the first time that the spatial arrangement of hdac domains is critical for in vivo deacetylation reaction and may provide a useful model for the development of novel HDAC inhibitors

Interactome of the yeast RNA polymerase III transcription machinery constitutes several chromatin modifiers and regulators of the genes transcribed by RNA polymerase II

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De l'utilisation de matrices en ToF-SIMS tandem MS pour la caractérisation d'OLEDs

International audienceLe ToF-SIMS (Time of Flight Secondary Ion Mass Spectrometry), technique prisée pour l'analyse de surfaces, a récemment fait l'objet de développements permettant la réalisation de mesures en tandem MS. Lors de la mesure, certains fragments peuvent être sélectionné afin d'être refragmenté, ceci offrant la possibilité d'identifier la nature et la structure des ions ainsi étudiés, en particulier dans les hautes masses. Cependant, les ions présentant des masses élevées ne présentent pas toujours les meilleurs taux d'ionisation et sont sujet à fragmentation avant leur détection. Il est donc important d'augmenter leur taux d'ionisation. Différentes méthodologies existent, mais la moins exploitée en ToF-SIMS est le dépôt de matrices comme en MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization). Cette méthodologie a déjà fait ces preuves sur des échantillons biologiques, mais n'a pas été explorée pour des OLEDs (Organic Light Emitting Devices). Pour ce travail, différents matériaux d'OLEDs ont été étudiés : Alq3, Ir(mppy)3, HATCN, F4TCNQ, NPB STTB et TCTA. Trois matrices fréquemment utilisées en MALDI ont été choisies pour cette étude : l'acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA), acide 2,3-dihydrobenzoïque (DHB), et la N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochlorure (NEDC). Elles ont été sprayées en utilisant un mélange 50/50% v/v d'eau et d'acétonitrile avec différentes épaisseurs. Ces surfaces ont été analysées à l'aide d'un PHI Nanotof 2 en acquérant des spectres, des images (voir Figure 1) et des profils. Les résultats montrent qu'il existe une épaisseur optimale pour le dépôt de matrices, mais surtout que le sprayage du solvant seul est parfois plus performant que les matrices pour augmenter le taux d'ionisation. Cela ouvre la voie à l'utilisation de molécules plus simples et volatiles comme matrices en ToF-SIMS

Optimisation de dépôt de matrices pour faciliter la caractérisation d'OLEDs en ToF-SIMS tandem MS.

International audienceLa technique de ToF-SIMS (time-of-flight secondary ion mass spectrometry) est excellente pour étudier la nature chimique de surfaces et d'interfaces. Elle a récemment fait l'objet de développements lui permettant de réaliser des mesures en tandem MS. Ceci permet de sélectionner des ions d'intérêt pour les refragmenter ouvrant de larges possibilités quant à l'identification de la nature et de la structure des fragments mesurés dans les hautes masses. Toutefois ceux-ci présentent généralement de faibles taux d'ionisation, ainsi l'augmentation de ce taux devient un enjeu majeur. Pour ce faire, le dépôt de matrices communément utilisée en MALDI (matrix assisted laser desorption ionization) est une méthodologie qui a déjà fait ses preuves pour des analyses d'échantillons biologiques en ToF-SIMS. Elle n'a pas encore été explorée pour des OLEDs. Ce travail cherche à optimiser l'utilisation de telles matrices pour caractériser des OLEDs par ToF-SIMS dans le but de mieux comprendre les phénomènes de dégradations de tels dispositifs pour augmenter leur durée de vie. Trois différentes matrices ont été sélectionnées pour ce travail : l'acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA), acide 2,3-dihydrobenzoïque (DHB), et la N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochlorure (NEDC). Ces matrices ont été déposées par sprayage en utilisant comme solvant un mélange 50% v/v d'eau et d'acétonitrile. Les différentes épaisseurs de dépôts ont été évaluées par ToF-SIMS sur un PHI NanoTOF 2 par l'acquisition de spectres de masse, de profiles en profondeur et d'images, et ce pour plusieurs matériaux d'OLEDs : Alq3, Ir(mppy)3, HATCN, F4TCNQ, NPB STTB et TCTA. Les résultats ont permis de montrer que l'on peut améliorer le taux d'ionisation en sprayant uniquement le solvant, les matrices n'étant pas toujours les plus performantes. Ceci ouvre la voie à l'utilisation de molécules plus simples, et volatiles pour augmenter le taux d'ionisation lors de mesures en ToF-SIMS

Optimization of matrix spraying on OLEDs to increase the ionization in ToFSIMS for tandem MS applications.

International audienceIntroductionToF-SIMS is an excellent tool for surface chemical characterization, and has been recently adapted to perform tandem MS measurements. Therefore the ionization of heavier fragments becomes crucial, especially when analyzing biological or polymer samples. The use of matrices is one way to increase the ionization, hence the intensity, of the fragments of interest. The applicability of matrices commonly used for MALDI has already been demonstrated as efficient for biological samples, but their use for OLED materials has never been reported. The goal is to optimize the use of matrices for OLED materials in ToF-SIMS measurements, which will help to better understand the ageing of these devices with a view to increasing device lifetime.MethodsAlq3 surfaces and six other typical OLED materials - Ir(mppy)3, HATCN, F4TCNQ, NPB, STTB and TCTA - were sprayed with four different matrices: α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), 2,3- dihydrobenzoic acid (DHB), N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride (NEDC), and the solvent used for spraying a mixture of water and acetonitrile 50% v/v. Three different passes of spraying were made: 6 passes, 2 passes, 1 passes and no passes. The surfaces were analyzed in ToF-SIMS using a PHI nanoTOF 2, by acquiring spectra, profiles and large area images.Preliminary dataFirstly, the characteristic fragments of the different matrices studied were identified to make sure they do not interfere with the main fragments of the molecules of interest. Then the intensity of the ions of those molecule were thoroughly investigated. It appears that there is an optimum of matrix concentration around two passes of spraying for all the matrices as well as the solvent sprayed samples. The behavior of the intensity of the molecules differs between positive and negative modes. For the molecules that are more easily identified in the positive mode (Alq3, Ir(mppy)3, NPB, STTB and TCTA), the intensities of their fragments are at the highest when only the solvent is sprayed. For these molecules, no clear pattern of intensities was found in the negative mode. F4TCNQ and HATCN are more easily identified in the negative mode. In the same manner, for these two molecules the spraying of the solvent appears as the best solution to obtain higher intensities for the characteristic ions. Looking at the images and the profiles acquired, the surfaces undergo significant changes in topography and crystallinity when sprayed with matrices (see Figure 1). These changes are less visible on the samples sprayed with only the solvent. Therefore, the solvent gives the best results both in terms of ionization enhancement and in terms of minimal sample modification. Mass spectrometry related innovationsThe use of MALDI matrices, or just the solvent, can be interesting in some cases to enhance ionization during TOF-SIMS analysis of OLED materials

De l'utilisation de matrices en ToF-SIMS tandem MS pour la caractérisation d'OLEDs

International audienceLe ToF-SIMS (Time of Flight Secondary Ion Mass Spectrometry), technique prisée pour l'analyse de surfaces, a récemment fait l'objet de développements permettant la réalisation de mesures en tandem MS. Lors de la mesure, certains fragments peuvent être sélectionné afin d'être refragmenté, ceci offrant la possibilité d'identifier la nature et la structure des ions ainsi étudiés, en particulier dans les hautes masses. Cependant, les ions présentant des masses élevées ne présentent pas toujours les meilleurs taux d'ionisation et sont sujet à fragmentation avant leur détection. Il est donc important d'augmenter leur taux d'ionisation. Différentes méthodologies existent, mais la moins exploitée en ToF-SIMS est le dépôt de matrices comme en MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization). Cette méthodologie a déjà fait ces preuves sur des échantillons biologiques, mais n'a pas été explorée pour des OLEDs (Organic Light Emitting Devices). Pour ce travail, différents matériaux d'OLEDs ont été étudiés : Alq3, Ir(mppy)3, HATCN, F4TCNQ, NPB STTB et TCTA. Trois matrices fréquemment utilisées en MALDI ont été choisies pour cette étude : l'acide α-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA), acide 2,3-dihydrobenzoïque (DHB), et la N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochlorure (NEDC). Elles ont été sprayées en utilisant un mélange 50/50% v/v d'eau et d'acétonitrile avec différentes épaisseurs. Ces surfaces ont été analysées à l'aide d'un PHI Nanotof 2 en acquérant des spectres, des images (voir Figure 1) et des profils. Les résultats montrent qu'il existe une épaisseur optimale pour le dépôt de matrices, mais surtout que le sprayage du solvant seul est parfois plus performant que les matrices pour augmenter le taux d'ionisation. Cela ouvre la voie à l'utilisation de molécules plus simples et volatiles comme matrices en ToF-SIMS

From polymer/metal hybrid materials' interface analysis to ToF-SIMS tandem MS measurement optimization.

International audienceTo address the ongoing problem of climate change, the transport industry is seeking ways to reduce energy consumption, hence decreasing pollution emissions. At the same time, the biomedical industry is looking for more biocompatible materials, in order to design new implants or prosthesis. To tackle these two different issues, the use of hybrid materials, especially hybrid polymer-metal assemblies, is gaining more and more popularity. Nonetheless, assembling such different materials remains a challenge. From the three assembling techniques, only welding offers satisfying results. Amongst the high variety of welding techniques, laser welding is catching more and more attention. Indeed, the laser welding process is quick. It does not require any surface preparation, and can be easily automated, which further increases its speed. It also presents a high design freedom in size but also in form. Even if laser welding is a promising technique, the root causes of adhesion are still not completely understood. This work aimed at addressing this question by analyzing two combinations of materials: polyamide-6.6/aluminum, and polyamide-6.6/titanium, by combining XPS and ToF-SIMS measurements [1].ToF-SIMS is an excellent tool for surface chemical characterization, and has been recently adapted to perform tandem MS measurements [2,3]. Therefore the ionization of heavier fragments becomes crucial, especially when analyzing biological or polymeric samples. The use of matrices is one way to increase the total ion yield, as well as the ionization, hence the intensity, of the fragments of interest. The applicability of matrices commonly used for MALDI has already been demonstrated as efficient for biological samples [4], but their use for OLED materials has never been reported. The goal is to optimize the use of matrices for OLED materials in ToF-SIMS measurements, which will help to better understand the ageing of these devices and so possibly help to increase their time of life. Therefore several classical matrices are tested on references of the different OLED layers, in order to find the best fitting matrix

ATAD3B is a human embryonic stem cell specific mitochondrial protein, re-expressed in cancer cells, that functions as dominant negative for the ubiquitous ATAD3A

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