The role of low-density-lipoprotein receptor (LDLR) family members in human coronary artery endothelial cells in response to modified LDL

Erste Anzeichen der Atherosklerose kennzeichnen sich durch die endotheliale Dysfunktion in Folge von massiver Schädigung des Endothels in der Intima der Blutgefäße. Der Blutfluss und die dabei wirkenden mechanischen Scherkräfte spielen eine entscheidende Rolle in der Gefäßhomeostase und der Aufrechterhaltung der Endothelfunktion. An Abgängen, Verzweigungen und Verengungen von Blutgefäßen wirken geringere Scherkräfte und der Blutfluss verlangsamt sich, infolgedessen treten an diesen Stellen vermehrt atherosklerotische Plauqes auf. Verschiedene Krankheiten wie Diabetes, chronische Niereninsuffizienz und Übergewicht gehen mit erhöhtem Blutcholesterolspiegel einher. Patienten haben durch die Krankheit vermehrt modifizierte Lipoproteine im Blut. Modifikationsprozesse von LDL stehen mit ersten Anzeichen der Atherosklerose in Verbindung. Humane koronare arterielle Endothelzellen (HCAEC) werden häufig im Forschungsbereich der Atherosklerose, insbesondere der endothelialen Dysfunktion eingesetzt, um die Wirkung von modifizierten LDLs und die dabei resultierende Schädigung der Endothelzellen herauszufinden. HDL und das weibliche Hormon Östrogen wirken Schädigungen entgegen und werden als vasoprotektiv beschrieben. Anhand von Toxizitätstests konnte die Lipotoxizität mit steigender Konzentration an modifizierten LDL auf Endothelzellen gezeigt werden. Die Vermutung konnte bekräftigt werden, dass HDL und 17-beta Estradiol (E2) den toxischen Effekt in Zellkulturexperimenten vermindern konnten. Frühere Studien befassten sich mit der Regulation von inflammatorischen Markern und der Regulierung von Scavenger Rezeptoren, den sogenannten Fressrezeptoren. Bisher ist wenig über die Regulation von LDL Rezeptor Familienmitgliedern im vaskulären Endothelium bekannt. Das Ziel meiner Diplomarbeit war, die Rolle von LDL Rezeptor Familienmitgliedern, wie LDL Rezeptor, LRP1 und LRP2, in diesem Zusammenhang zu definieren. Hierbei sollten HCAEC mit verschiedenen modifizierten LDLs (oxidiertem, glykiertem und carbamyliertem LDL) behandelt werden. Weiters sollten geschlechtsspezifische Unterschiede erfasst werden, indem Zellen zusätzlich zu modifizierten LDL mit E2 behandelt wurden. Die Expressionsanalysen wurden unter statischen Bedingungen und unter Einwirkung von Scherkräften in Zellkartuschen (Fiber Cell™ Model) durchgeführt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der Transkriptionslevel von LDL Rezeptoren unter statischen Bedingungen und unter geringen Scherkräften verringert wird. Erhöhter Blutfluss und Scherkräfte wirken aktiv auf Rezeptoren der Endothelzellen. LRP2 mRNA konnte nur mit geringem Expressionstatus nachgewiesen werden. LRP1 konnte auf Transkriptionsebene in Zellkulturexperimenten nicht nachgewiesen werden, aber eine basale Aktivierung unter Einfluss von Scherkräften. In Zellkulturexperimenten zeigte die Inkubation von Endothelzellen mit E2 und modifizierten LDL, einen geringen Antsieg von LRP1 und LRP2 auf mRNA Ebene. Eine signifikante Steigerung der LDL Rezeptor mRNA-Expression konnte bei E2 Zugabe erkannt werden. Generell scheint die mRNA-Expression von LDL Rezeptor Familienmitgliedern unter Einwirkung von modifizierten LDLs in frühen atherosklerotischen Stadien verringert zu werden.First mark of atherosclerosis is linked to endothelial dysfunction, with a massive injury of endothelium of the vascular intima of blood vessels. Mechanical forces, as blood associated shear stress, play an important role in cardiovascular physiology. Atherosclerotic lesions can be detected in regions of low shear stress (LSS) and disturbed blood flow at curvatures and narrows of vessels and capillaries. Various diseases such as diabetes, chronic renal insufficiency, and obesity come along with elevated levels of blood cholesterol and different modified low-density- lipoproteins (LDL). The modification of lipoproteins is a key event in early atherosclerosis, which leads to endothelial dysfunction and the formation of foam cells. Human coronary artery endothelial cells (HCAEC) are used for studies of atherosclerosis, to observe the effect of modified LDL, such as oxidized, carbamylated, and glycated LDL. High-density-lipoprotein (HDL) and also the female hormone estrogen are defined to be vasoprotective and antagonize the formation of atherosclerotic lesions. Lipotoxicity on endothelial cells could be demonstrated with increasing concentration of different modified LDL. We could determine that estrogen and HDL lower the cytotoxic effect of modified LDL on endothelial cells in cell culture experiments. Previous data focused on the regulation of inflammatory sensors and upregulation of scavenger receptors. In this study the question was addressed to determine the role of LDL receptor gene family members, such as LDL receptor, LRP1 and LRP2 in HCAEC and the impact of modified LDL. More interest was also raised in sex specific differences and the impact of estrogen 17-beta estradiol (E2) in vasculature. The investigation was based on incubation of HCAEC with different modified LDL under static cell culture condition and also under subjection to shear stress. The Fiber Cell™ module is designed for cell culture experiments to study endothelial cells under shear stress. However, LDL receptor expression seemed to be downregulated on the transcript level after exposure of endothelial cells to modified LDL under static conditions and under LSS. HSS affects the activation of LDLR in vasculature. Hence, LRP2 could be detected at low-level expression on the mRNA level in both conditions. LRP1 could not be detected under static conditions, but a slight upregulation under shear stress could be detected. Moreover, estrogen induced a slight upregulation of the mRNA level of LRP1 and LRP2 under static conditions. The LDL receptor seemed to be significantly upregulated by estrogen administration, also published by Smith et al, 2004. Concluding, the vasoprotective effect of estrogen and HDL and the lower incidence of toxic effects of modified LDL on HCAEC could be shown. The expression of LDL receptor gene family members, including LDLR, LRP1, and LRP2 seemed to be downregulated in atherosclerotic events

Identification of potential bioactive peptides in sheep milk kefir through peptidomic analysis at different fermentation times

Sheep farming is an important socioeconomic activity in most Mediterranean countries, particularly Spain, where it contributes added value to rural areas. Sheep milk is used in Spain mainly for making cheese, but it can be used also for making other dairy products, such as the lactic-alcoholic fermentation product known as kefir. Dairy products have health benefits because, among other reasons, they contain molecules with biological activity. In this work, we performed a proteomics strategy to identify the peptidome, i.e., the set of peptides contained in sheep milk kefir fermented for four different periods of time, aiming to understand changes in the pattern of digestion of milk proteins, as well as to identify potential bioactive peptides. In total, we identified 1942 peptides coming from 11 different proteins, and found that the unique peptides differed qualitatively among samples and their numbers increased along the fermentation time. These changes were supported by the increase in ethanol, lactic acid, and D-galactose concentrations, as well as proteolytic activity, as the fermentation progressed. By searching in databases, we found that 78 of the identified peptides, all belonging to caseins, had potential biological activity. Of these, 62 were not previously found in any milk kefir from other animal species. This is the first peptidomic study of sheep milk kefir comprising time-course comparison

On the track for an efficient detection of Escherichia coli in water : A review on PCR-based methods

Ensuring water safety is an ongoing challenge to public health providers. Assessing the presence of fecal contamination indicators in water is essential to protect public health from diseases caused by waterborne pathogens. For this purpose, the bacteria Escherichia coli has been used as the most reliable indicator of fecal contamination in water. The methods currently in use for monitoring the microbiological safety of water are based on culturing the microorganisms. However, these methods are not the desirable solution to prevent outbreaks as they provide the results with a considerable delay, lacking on specificity and sensitivity. Moreover, viable but non-culturable microorganisms, which may be present as a result of environmental stress or water treatment processes, are not detected by culture-based methods and, thus, may result in false-negative assessments of E. coli in water samples. These limitations may place public health at significant risk, leading to substantial monetary losses in health care and, additionally, in costs related with a reduced productivity in the area affected by the outbreak, and in costs supported by the water quality control departments involved. Molecular methods, particularly polymerase chain reaction-based methods, have been studied as an alternative technology to overcome the current limitations, as they offer the possibility to reduce the assay time, to improve the detection sensitivity and specificity, and to identify multiple targets and pathogens, including new or emerging strains. The variety of techniques and applications available for PCR-based methods has increased considerably and the costs involved have been substantially reduced, which together have contributed to the potential standardization of these techniques. However, they still require further refinement in order to be standardized and applied to the variety of environmental waters and their specific characteristics. The PCR-based methods under development for monitoring the presence of E. coli in water are here discussed. Special emphasis is given to methodologies that avoid pre-enrichment during the water sample preparation process so that the assay time is reduced and the required legislated sensitivity is achieved. The advantages and limitations of these methods are also reviewed, contributing to a more comprehensive overview toward a more conscious research in identifying E. coli in water.Diana Mendes (SFRH/BDE/33752/2009) was recipient of a fellowship from the Fundacao para a Ciencia e a Tecnologia (FCT, Portugal) and Frilabo, Lda. The authors thank Tatiana Aguiar (Centre of Biological Engineering) for English proofreading, the financial support from the Project "Desenvolvimento de um kit de detecao e quantificacao de E. coli e bacterias coliformes em aguas", Ref. 2009/5787, Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 - O Novo Norte), QREN, FEDER, the FCT Strategic Project PEst-OE/EQB/LA0023/2013 and the Project "Biolnd-Biotechnology and Bioengineering for improved Industrial and processes", REF. NORTE-07-0124-FEDER-000028 Co-funded by the Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 - O Novo Norte), QREN, FEDER

Advanced glycoxidation and lipoxidation end products (AGEs and ALEs): an overview of their mechanisms of formation

Advanced lipoxidation end products (ALEs) and advanced glycation end products (AGEs) have a pathogenetic role in the development and progression of different oxidative-based diseases including diabetes, atherosclerosis, and neurological disorders. AGEs and ALEs represent a quite complex class of compounds that are formed by different mechanisms, by heterogeneous precursors and that can be formed either exogenously or endogenously. There is a wide interest in AGEs and ALEs involving different aspects of research which are essentially focused on set-up and application of analytical strategies (1) to identify, characterize, and quantify AGEs and ALEs in different pathophysiological conditions ; (2) to elucidate the molecular basis of their biological effects ; and (3) to discover compounds able to inhibit AGEs/ALEs damaging effects not only as biological tools aimed at validating AGEs/ALEs as drug target, but also as promising drugs. All the above-mentioned research stages require a clear picture of the chemical formation of AGEs/ALEs but this is not simple, due to the complex and heterogeneous pathways, involving different precursors and mechanisms. In view of this intricate scenario, the aim of the present review is to group the main AGEs and ALEs and to describe, for each of them, the precursors and mechanisms of formation

Profiling of reactive sugar degradation products in foods and peritoneal dialysis fluids

Kohlenhydrate gehören zu den Grundstoffen der menschlichen Ernährung und nehmen als Energieträger eine wichtige Stellung im Bereich der Nahrungsmittel und Arzneimittel ein. Da besonders Mono- und Disaccharide süß schmeckende Eigenschaften besitzen, tragen sie erheblich zum Genusswert eines Lebensmittels bei. Glucose-Fructose-Sirup (HFCS) ist ein weit verbreitetes Süßungsmittel, das überwiegend aus den Monomeren Glucose und Fructose besteht. Da HFCS aus preisgünstiger Maisstärke gewonnen werden kann, flüssig und unter sauren Bedingungen stabil ist, hat er sich zu einer interessanten Alternative zu der üblicherweise eingesetzten Saccharose entwickelt. Während des Herstellungsprozesses wird HFCS auf Grund technologischer Erfordernisse einer thermischen Behandlung ausgesetzt. Infolgedessen kommt es jedoch zu chemischen Abbaureaktionen von Glucose und Fructose, in deren Verlauf reaktive � -Dicarbonylverbindungen gebildet werden. Auf Grund ihrer hohen Reaktivität führen diese Zuckerabbauprodukte (GDPs) nach Aufnahme zu Protein- und DNS-Modifikationen, wodurch die funktionellen Eigenschaften dieser Biomoleküle beeinträchtigt werden. Ferner können � -Dicarbonyle Signaltransduktionswege stören und auf Zellen zytotoxisch wirken. In Tierstudien mit Ratten zeigen diese Strukturen mutagene sowie kanzerogene Eigenschaften. Es fehlen bisher umfassende Studien, die das gesamte Profil der Hauptabbauprodukte mit � -Dicarbonylstruktur in HFCS und weiteren Lebensmitteln untersuchen. Erst auf Basis solcher Studien ist es dann möglich, weiterführende Untersuchungen hinsichtlich der Reaktivität der GDPs durchzuführen und Auswirkungen dieser Verbindungen auf Biomoleküle in vitro sowie in vivo zu untersuchen. Daher war es Ziel des ersten Teils dieser Dissertation eine Profilanalyse reaktiver GDPs in HFCS durchzuführen. Hierbei wurden � -Dicarbonyle selektiv mit o-Phenylendiamin (OPD) zu ihren entsprechenden Chinoxalinderivaten umgesetzt. Anschließend erfolgte die Analyse der Chinoxaline durch eine speziell dafür entwickelte Ultrahochleistungsflüssigchromatographie mit kombinierter Diodenarray-/tandemmassenspektrometrischer Detektion (UHPLC-DADMS/MS). Anhand charakteristischer UV/Vis-Spektren war es möglich Signale, die durch Chinoxaline hervorgerufen wurden, zu identifizieren. Folglich besaßen diese Verbindungen vor der Derivatisierung mit OPD eine � -Dicarbonylstruktur. Durch massenspektrometrische Untersuchungen wurden das Molekulargewicht sowie die Produktionenspektren der Zielmoleküle analysiert. Der Vergleich der chromatographischen und spektroskopischen Eigenschaften der Analyten mit den Charakteristika unabhängig synthetisierter Referenzsubstanzen, erlaubte die Anwesenheit folgender � -Dicarbonylverbindungen in HFCS Proben zweifelsfrei zu belegen: 3-Desoxy-D-erythro-hexos-2-ulose (3-Desoxyglucoson, 3-DG), D-lyxo-Hexos-2-ulose (Glucoson), 3-Desoxy-D-threo-hexos-2-ulose (3-Desoxygalactoson, 3-DGal), 1-Desoxy-D-erythro-hexos-2,3-ulose (1-Desoxyglucoson, 1-DG), 3,4-Didesoxyglucoson-3-en (3,4-DGE), Methylglyoxal (MGO) und Glyoxal. Im Folgenden wurden die Gehalte der einzelnen GDPs in 14 verschiedenen HFCS-Proben bestimmt. Hierfür wurde zunächst eine effiziente Derivatisierungsmethode entwickelt, die eine vollständige Umsetzung aller � -Dicarbonyle zu ihren Chinoxalinderivaten gewährleistete. Die Präsenz von Diethylentriaminpentaessigsäure während des Derivatisierungsprozesses stellte sicher, dass die Analyten nicht de novo gebildet wurden. Eine Ausnahme dabei war Glyoxal, dessen de novo Bildung von der Zuckerkonzentration der Matrix abhing und deshalb nicht quantifiziert werden konnte. Anschließend erfolgte eine umfangreiche Validierung der Methode, um eine verlässliche Quantifizierung von 3-DG, Glucoson, 3-DGal, 1-DG, 3,4-DGE und MGO gewährleisten zu können. Abhängig von der � -Dicarbonylstruktur und dessen Konzentration betrugen die Wiederfindungsraten 89,2% bis 105,8% mit Variationskoeffizienten von 1,9% bis 6,5 %. Die Qualität der linearen Kalibriermodelle wurde überprüft, indem sowohl das Bestimmtheitsmaß (R2) als auch der Linearitätstest nach Mandel durchgeführt wurde. Alle Regressionsmodelle erfüllten den Test auf Linearität mit einem Signifikanzniveau von p<0,05 und wiesen ein R2 � 0,9990 auf. Schließlich wurden die � -Dicarbonylprofile der HFCS-Proben analysiert. 3-DG wurde dabei als das Hauptabbauprodukt mit einer Konzentration von bis zu 730 � g/mL in HFCS identifiziert. In absteigenden Konzentrationen konnten Glucoson (32-402 � g/mL), 3-DGal (10-61 � g/mL), 1-DG (nicht detektierbar-26 � g/mL), 3,4-DGE (2-14 � g/mL) und MGO (1-11 � g/mL) detektiert werden. Die Gesamtkonzentration von � -Dicarbonylverbindungen in den einzelnen Sirupen schwankte zwischen 293 und 1130 � g/mL. Außerdem wurden signifikante Unterschiede zwischen den Gesamtgehalten von Proben unterschiedlicher Hersteller festgestellt. Diese Tatsache ließ vermuten, dass der Herstellungsprozess einen großen Einfluss auf die Gesamtbelastung der HFCS-Proben mit � -Dicarbonylen ausübte. Da im ersten Teil der vorliegenden Arbeit eine hohe Belastung von HFCS mit � -Dicarbonylverbindungen festgestellt wurde, wurde im zweiten Abschnitt HFCS-haltige Lebensmittel auf die Kontamination mit GDPs untersucht. Hierfür wurden kohlensäurehaltige Erfrischungsgetränke (KEG) eingesetzt, die weltweit eine wichtige Rolle in der Ernährung vieler Menschen spielen. Meist sind KEG mit kalorischen Süßungsmitteln wie HFCS oder Saccharose versetzt, wenngleich es regionale Unterschiede gibt. Während in den Vereinigten Staaten von Amerika kalorische KEG nahezu vollständig mit HFCS gesüßt sind, ist die Verwendung des Sirups in der Europäischen Union auf Grund von limitierter Produktion und Einfuhr eingeschränkt. Daher enthalten KEG entweder eine Mischung aus HFCS und Saccharose, meist sind diese jedoch nur mit Saccharose gesüßt. Im Rahmen dieser Studie wurden insgesamt 25 KEG auf die Belastung mit � -Dicarbonylen untersucht. Dabei enthielten 14 Proben ausschließlich HFCS, fünf Proben beide Süßungsmittel und elf KEG nur Saccharose. Die Identifizierung der GDPs beruhte auf der Analyse der entsprechenden Chinoxalinderivate, die durch Vorsäulenderivatisierung mit OPD generiert wurden. Schließlich wurden mittels UHPLC-DAD-MS/MS die chromatographischen sowie spektroskopischen Eigenschaften der Analyten mit den Charakteristika von Referenzsubstanzen verglichen. Auf diese Weise wurden 3-DG, Glucoson, 3-DGal, 1-DG, 3,4-DGE, MGO und Glyoxal in den KEG Proben zweifelsfrei identifiziert. Da weitere Inhaltsstoffe der KEG mit der chromatographischen Trennung der Chinoxalinderivate interferierten, wurde eine auf Festphasenextraktion basierende Methode entwickelt, die eine effiziente Abtrennung aller störenden Matrixbestandteile erlaubte. Im Anschluss daran wurde die Methode zur Profilanalyse der GDPs in KEG einer umfangreichen Validierung unterzogen, um die Gehalte der einzelnen Analyten in allen Proben präzise und richtig bestimmen zu können. Glyoxal wurde auch hier auf Grund einer deutlichen de novo Bildung von der Quantifizierung ausgeschlossen. Die Wiederfindungsraten der � -Dicarbonyle reichten in Abhängigkeit des Analyten und dessen Konzentration von 85,6% bis 103,1 %, mit Variationskoeffizienten zwischen 0,8% und 3,6 %. Die Kalibriermodelle wurden durch das Bestimmtheitsmaß (R2 � 0,9991) und den Linearitätstest nach Mandel, den alle Modelle erfüllten (p<0,5), charakterisiert. Die Gesamtgehalte der � -Dicarbonyle in den kommerziell erhältlichen KEG erreichten Werte zwischen 0,3 und 116 � g/mL, mit 3-DG (� 87 � g/mL) als Hauptabbauprodukt, gefolgt von Glucoson (� 21 � g/mL), 3-DGal (� 8 � g/mL), 1-DG (� 3 � g/mL), 3,4-DGE (� 0,9 � g/mL) und MGO (� 0,6 � g/mL). Zusätzlich konnte festgestellt werden, dass KEG, die HFCS enthielten, signifikant höhere Gesamtkonzentrationen enthielten als Proben, die mit einer Kombination aus HFCS und Saccharose oder ausschließlich mit Saccharose gesüßt waren. Dies ließ darauf schließen, dass die Verwendung von HFCS zu einer signifikant höheren Kontamination der KEG mit GDPs führte. Im dritten Teil der Dissertation lag der Fokus auf polysaccharidbasierten Peritonealdialyselösungen (PD-Lösungen). Die Peritonealdialyse (PD) ist ein Blutreinigungsverfahren, das alternativ zur Hämodialyse eingesetzt werden kann. Dabei wird dem Patienten eine osmotisch wirksame Lösung, die PD-Lösung, für eine definierte Verweilzeit in die Bauchhöhle gegeben. Als osmotisch wirksames Agens dient meist Glucose oder Polyglucose. Während der Dialysezeit wird ein osmotischer Druckgradient zwischen dem Bauchfell und den dort verlaufenden Kapillaren aufgebaut, wodurch dem Metabolismus harnpflichtige Stoffe und überschüssiges Wasser entzogen werden. Das Bauchfell (Peritoneum) fungiert dabei als semi-permeable Membran. Diese Behandlungsmethode ist jedoch zeitlich begrenzt, da das Bauchfell mit zunehmender PD-Applikation seine Filtrationseigenschaften verliert. Es ist bereits fundiert beschrieben, dass GDPs, die während der Hitzesterilisation der PD-Lösungen aus dem osmotischen Agens entstehen, erheblich zur Bioinkompatibilität der PD-Lösungen beitragen. Gründe hierfür liegen im Auslösen von fibrotischen sowie zytotoxischen Effekten in humanen peritonealen Mesothelzellen und der Akkumulation von sogenannten „advanced glycation end products“ (AGEs) im Bauchraum. Glucosehaltige PD-Lösungen wurden im Hinblick auf GDPs bereits umfangreichen Studien unterzogen. Es waren bisher jedoch kaum Daten über den Abbau von Polyglucose in PD-Lösungen oder polysaccharidspezifischen GDPs in solchen PD-Lösungen bekannt. Aus diesem Grund wurden polyglucosehaltige PD-Lösungen einer systematischen Profilanalyse von GDPs unterzogen. Hierfür wurden die Abbauprodukte mit OPD umgesetzt und die entstandenen Derivate mittels UHPLC-DAD-MS/MS analysiert. Um eine effiziente Trennung der derivatisierten GDPs zu erreichen, wurden zwei verschiedene UHPLC-DAD-MS/MS-Methoden entwickelt. Diese erlaubten eine sichere Zuordnung der UV/Vis-Spektren, Molekülmassen und Produktionenspektren zu den jeweiligen Signalen. Anhand der UV/Vis-Spektren konnten vier verschiedene Chinoxaline sowie zwei weitere Strukturen mit unbekannten Chromophoren und damit unbekannten Präkursoren identifiziert werden. Mittels hochauflösender Massenspektrometrie wurden die Summenformeln der Derivate ermittelt, von denen sich Strukturformeln ableiten ließen. Zur Evaluation dieser Strukturvorschläge erfolgte die Darstellung der Verbindungen, die durch UHPLC-DAD-MS/MS, NMR-Experimente und hochauflösender Massenspektrometrie charakterisiert wurden. Der Vergleich der chromatographischen sowie spektroskopischen Eigenschaften der Referenzsubstanzen und der Analyten ließ den zweifelsfreien Nachweis folgender � -Dicarbonylverbindungen zu: 3-DG, 3-DGal sowie 4-Desoxyglucoson (4-DG) und 3,4-Didesoxypentoson (3,4-DDPS). 4-DG und 3,4-DDPS wurden dabei zum ersten Mal in PD-Lösungen nachgewiesen. Ferner konnte auch 5-Hydroxymethylfurfural (5-HMF), ein bereits für glucosebasierte PD-Lösungen bekanntes GDP, in den untersuchten Lösungen detektiert werden. Dies erfolgte zum ersten Mal über ein Reaktionsprodukt aus OPD und 5-HMF, dem (5-(1H-Benzo[d]imidazol-2-yl)furan-2-yl)methanol. Ein weiteres Reaktionsprodukt aus OPD und einem bislang unbekannten GDP wurde als 1,4-bis (1H-Benzo[d]imidazol-2-yl)3,4-dihydroxybutan-1-on identifiziert. Dabei handelte es sich jedoch nicht um ein GDP, dessen Bildung durch Hitzeeinwirkung induziert wurde, sondern um eine bereits im Rohstoff vorhandene Kontamination. Die Quantifizierung der GDPs erfolgte für 5-HMF, 3-DG, 3-DGal und 4-DG durch Analyse der Derivate mittels UHPLC-DAD, das Chinoxalinderivat von 3,4-DDPS wurde mittels UHPLC-MS/MS erfasst. Die beiden entwickelten chromatographischen Methoden wurden vor der Quantifizierung der Analyten umfangreich validiert, wobei 3,4-DDPS über das Standardadditionsverfahren quantifiziert wurde. Die Wiederfindungsraten betrugen in Abhängigkeit der Analyten und deren Konzentration 98,4% bis 103,0 %, mit Variationskoeffizienten � 3,5 %. Die Linearität aller Regressionsmodelle war ebenfalls gegeben (R2 � 0,9997). Im Folgenden fanden diese Methoden Anwendung mit dem Ziel, die Gehalte der GDPs in kommerziell erhältlichen polysaccharidbasierten PD-Lösungen zu bestimmen. 4-DG konnte mit einer Konzentration von 14-20 � M als Hauptabbauprodukt identifiziert werden. 3-DGal (15-16 � M), 3-DG (6-7 � M), 3,4-DDPS (0,2-0,3 � M) und 5-HMF (0,2-0,3 � M) wurden in geringeren Konzentrationen nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit belegen, dass reaktive � -Dicarbonylverbindungen sowohl in Lebensmitteln, wie HFCS und KEG, als auch in Arzneimitteln, wie polysaccharidbasierten PD-Lösungen, in nennenswerten Konzentrationen vorkommen. Die entwickelten analytischen Methoden ermöglichen einerseits die Identifizierung bisher unbekannter Verbindungen und andererseits auch deren verlässliche Quantifizierung. Diese Daten sind nun Ausgangspunkt für weiterführende Studien, die die Bioaktivität der unterschiedlichen GDPs in ihren vorhandenen Konzentrationen untersuchen. Außerdem zeigt diese Arbeit auf, dass � -Dicarbonylverbindungen in unterschiedlichen Matrices auftreten und daher unterschiedliche Eintragswege der GDPs in den menschlichen Metabolismus existieren. Vor diesem Hintergrund, sollten Studien angestrebt werden, die mögliche physiologische Effekte der � -Dicarbonyle in Abhängigkeit der Aufnahmewege untersuchen. Auf Grund der Kenntnis, welche GDPs in welchen Konzentrationen auftreten, bildet die vorliegende Arbeit für weiterführende Studien eine wertvolle Grundlage.Carbohydrates represent one of the most important components of human nutrition. As a major and rapidly available energy source, carbohydrates play a prominent role in food and medicinal products. Commonly, monosaccharides as well as disaccharides are used to improve flavour, since they are sweet to the taste. Sucrose and high-fructose corn syrup (HFCS) are two examples for commercial sweeteners, which are often used in food and beverages. HFCS is produced from corn starch by hydrolysis and partial enzymatic isomerization from glucose to fructose. Recently, HFCS has become a very successful alternative to sucrose, because of several advantages compared to table sugar. As the raw material for HFCS is corn starch, it is cheaper than sucrose. Additionally, liquid HFCS is much easier to handle than crystalline sucrose and is stable under acidic conditions, whereas sucrose inverts to the monosaccharides glucose and fructose. This might have a negative impact on product properties, since the formulation of the product is attuned to the sort of sweetener. Due to thermal treatment sugars are considerably degraded during the processing steps, leading to the formation of reactive � -dicarbonyl compounds. These � -dicarbonyls show cytotoxic and mutagenic as well as carcinogenic properties. Studies, however, which monitor the overall profile of � -dicarbonyls in HFCS and HFCS-containing food, are still missing. With detailed knowledge of the molecular structures and concentrations of these compounds, it will be possible to monitor the physiological effects of resorbed � -dicarbonyls in detail. Therefore, in the first part of this thesis, a targeted screening was performed to evaluate the major degradation products with � -dicarbonyl structure in various HFCS samples. For this purpose, � -dicarbonyl compounds were selectively converted to their corresponding quinoxaline derivatives by trapping with o-phenylenediamine. Afterwards analysis of the quinoxalines was carried out by ultra-high performance liquid chromatography with hyphenated diode array-tandem mass spectrometry (UHPLC-DAD-MS/MS) detection. Quinoxalines were identified by their characteristic UV/Vis spectra. Thus, these molecules must be derived from � -dicarbonyls. Using the synthesized standards as references, 3-deoxy-D-erythro-hexos- 2-ulose (3-deoxyglucosone, 3-DG), D-lyxo-hexos-2-ulose (glucosone), 3-deoxy-D-threo-hexos- 2-ulose (3-deoxygalactosone, 3-DGal), 1-deoxy-D-erythro-hexos-2,3-ulose (1-deoxyglucosone, 1-DG), (E)-3,4-dideoxyglucosone-3-ene as well as (Z)-3,4-dideoxyglucosone-3-ene (3,4-DGE), methylglyoxal (MGO), and glyoxal were identified by their chromatographic and spectroscopic properties. Monitoring of enhanced mass spectra as well as MS/MS product ion spectra allowed unequivocal peak identification and verification. Complete derivatization of all identified � -dicarbonyls without any de novo formation was ensured by adding the complexing agent diethylene triamine pentaacetic acid to the derivatization reagent and adjusting the derivatization procedure. De novo formation of glyoxal, however, was not suppressed under these conditions, but was rather influenced by the sugar concentration than by metal catalysis. Thus, glyoxal had to be excluded from the quantification process. For quantification of 3-DG, glucosone, 3-DGal, 1-DG, 3,4-DGE, and MGO in HFCS matrix, the UHPLC-DAD-MS/MS method was fully validated. Recovery rates ranged from 89.2% to 105.8 %, with a relative standard deviation between 1.9% to 6.5 %, depending on the analyte and its concentration. Linearity of calibration was checked by the test of linearity according to Mandel (level of significance p<0.05) and by the coefficient of determination (R2 � 0.9990). All calibration models fulfilled these criteria. Subsequently, the � -dicarbonyl profiles of 14 commercial HFCS samples were analyzed. 3-DG was identified as the major degradation product with concentrations up to 730 � g/mL, followed by glucosone (32- 402 � g/mL), 3-DGal (10-61 � g/mL), 1-DG (not detectable-26 � g/mL), 3,4-DGE (2-14 � g/mL), and MGO (1-11 � g/mL). Total � -dicarbonyl levels ranged from 293 � g/mL to 1,130 � g/mL. Significant differences in � -dicarbonyl load between samples of various manufacturers were detected, indicating that the production process influenced the formation of � -dicarbonyls in HFCS matrix. Since the above mentioned experiments showed a considerable � -dicarbonyl load in HFCS, sugar-sweetened carbonated soft drinks, which represent typical HFCS or sucrose-containing consumer products, were tested for reactive degradation products in the second part of this work. Carbonated soft drinks contain HFCS or sucrose or both sweeteners, depending on the region where these products are distributed. Particularly in the USA, carbonated soft drinks are sweetened with HFCS. In the European Union, however, production and importing of HFCS are limited due to an administrative order. Consequently, carbonated soft drinks, which are available in the European Union, mostly contain sucrose. To few products a combination of HFCS and sucrose is added. In this study 25 carbonated soft drink samples were analyzed in all, 14 samples solely contained HFCS, 5 samples contained both sweetener, and 11 samples just sucrose. Identification of the � -dicarbonyls was carried out after conversion to the quinoxalines with o-phenylenediamine by UHPLC-DAD-MS/MS as described above. Thus, 3-DG, glucosone, 3-DGal, 1-DG, (E)-3,4-DGE, (Z)-3,4-DGE, MGO, and glyoxal could be identified in carbonated soft drinks. Since several ingredients of soft drinks interfered with the chromatographic separation, a solid phase extraction method was developed to remove all interfering compounds efficiently. In the following, the method was fully validated (recovery rates 85.6-103.1 %; relative standard deviation 0.8-3.6 %; linearity of calibration according to Mandel p<0.05; R2 � 0.9991) and all identified � -dicarbonyls were quantified with the exception of glyoxal. During the derivatization process de novo formation of glyoxal occurred, so that it had to be excluded from the quantification. Total � -dicarbonyl concentrations in commercially available carbonated soft drinks ranged from 0.3-116 � g/mL, with the concentration significantly higher in products sweetened with HFCS compared to samples that contained HFCS and sucrose, or sucrose alone. This means that the total amount of � -dicarbonyls depends on the applied sweetener. Similar to HFCS, the predominant degradation product was 3-DG (� 87 � g/mL), whereas the remaining � -dicarbonyls were detected in lower concentrations (glucosone: � 21 � g/mL; 3-DGal: � 8 � g/mL; 1-DG: � 3 � g/mL; 3,4-DGE: � 0.9 � g/mL; MGO: � 0.6 � g/mL). The final part of this thesis was focused on reactive degradation products in peritoneal dialysis fluids, which contained polyglucose as an osmotic agent. Peritoneal dialysis (PD) is a gentle process for removing metabolites of toxicological concern and excess fluid from the metabolism of patients suffering from renal failure. A highly osmotic solution, mostly containing glucose or polyglucose as well as buffers and electrolytes, is applied to the patient’s abdominal cavity and remains there for a defined time. Diffusion and osmosis drive compounds, which are obligatory excreted by urine, and excessive water through the peritoneum that acts as a semi-permeable membrane. Application of PD, however, is limited, since the peritoneal membrane loses its filtration capacity due to the bioincompatible PD fluids. It is well-established that degradation products with � -dicarbonyl structure, which are formed during heat sterilization of these fluids, impair long-term application due to fibrosis or apoptosis in human mesothelial cells, as well as due to accumulation of so-called advanced glycation end products (AGEs) in the peritoneal cavity. Glucose-based PD fluids have already been extensively tested for reactive degradation products. Polyglucose containing fluids, however, were hardly investigated. For this reason

Development and evaluation of molecular assays for microbial water quality assessment

Zusammenfassung in deutscher SpracheAlternative DNA-basierter molekulare Methoden ermöglichen eine schnellere und spezifischere Analyse in der Wasserqualitätsbewertung mit erhöhtem Probendurchsatz im Vergleich zu zeitintensiven Kultivierungsverfahren. Die Verwendung der real-time (RT-PCR) in Kombination mit der Behandlung von Propidium Monoazide (PMA), zur Differenzierung von DNA aus lebenden und toten Bakterienzellen, wurde für alle in der Trinkwasserverordnung (TVO, BGBl. II Nr. 304/2001) definierten mikrobiellen Parameter (E .coli, coliforme, Enterococcus spp., P. aeruginosa und Keimzahlbestimmung (KBE)) etabliert. In der Entwicklungsphase wurde das Potential der Lebend/Tot Differenzierung, durch Verwendung von 10 µM PMA anhand der signifikanten (3log10) oder kompletten Unterdrückung von DNA aus hitze-getöteten E. coli und P. aeruginosa Zellen in einer Probe mit abundanter Wassermikroflora demonstriert. Das Anwendungspotenzial der PMA-RT-PCR wurde in einer Evaluierung zu Referenzverfahren und RT-PCR ohne PMA mit einer Vielzahl an Trinkwasserproben und Prozesswasserproben getestet und resultierte in einer hohen Spezifität für die Detektion von E. coli, Enterococcus spp., P. aeruginosa, jedoch zeigte sich die Limitation der Sensitivität und der Detektion von coliformen Keimen und der KBE. Zudem wurde die KBE und deren Kultivierungsparameter, definiert in EN ISO 6222:1999 und EPA, auf die Bakterienökologie durch 16S rRNA Sequenzanalyse betrachtet. Eine signifikante Auswirkung auf das präsente Bakterienspektrum konnte durch die Kultivierungsparameter beobachtet werden, wobei signifikante Effekte durch den Parameter der Temperatur (p< 0.01) statistisch bewertet werden konnten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die KBE Bestimmung bezugnehmend auf deren Aussage des Qualitätszustands einer einzeln analysierten Wasserprobe überdacht werden sollte. Kultivierungsmethoden als standardisierte Verfahren sind derzeit in der Wasserqualitätsbewertung noch nicht durch molekulare Methoden zu ersetzen. Gelingt es die Sensitivität zu verbessern, birgt sich eine gute Verwertungschance in der PMA-RT-PCR Methode durch die hohe Spezifität und die Gewährleistung der schnelleren Aussage um ein rasches Eingreifen im Kontaminationsfall zu ermöglichen.Alternative DNA-based molecular assay enable a rapid, specific and high-throughput analysis in water quality assessment in comparison to laborious cultivation-based techniques. Real-time (RT)-PCR in combination with the treatment of propidium monoazide (PMA) was developed for the detection of microbial parameters specified by the Austrian Drinking Water Regulation (BGBl. II Nr. 304/2001), i.e. E. coli, coliforms, Enterococcus spp., P. aeruginosa and heterotrophic plate count (HPC). The PMA treatment was included into RT-PCR analysis to allow for discrimination between DNA targets from living and dead organism, which is prerequisite for quality assessment, as only viable cells are determined by standardized techniques and may pose a health risks. In the proof of principle study the live/dead discrimination potential of PMA-RT-PCR was demonstrated. Treatment with 10 µM PMA resulted in the significant (3 log10) or complete suppression of false positive signals arising from heat-killed E. coli and P. aeruginosa from samples with an abundant background water microflora. The application potential of PMA-RT-PCR in comparison to conventional reference methods and RT-PCR without PMA was approved in an extended evaluation with a set of drinking and process water samples. Best performance due to high specificity of PMA-RT-PCR was achieved for E. coli, Enterococcus spp. and P. aeruginosa. Challenges remained in the sensitivity and the establishment of molecular assays for the detection of coliforms and total bacterial count. Further the HPC used as quality parameter was assessed in detail for the composition of culturable HPC community under different cultivation conditions, outlined in EN ISO 6222:1999 and EPA, by 16S rRNA gene sequence analysis. HPC communities revealed significant differences in microbial composition accordingly to cultivation parameter applied, with significant effects of temperature (p< 0.01). Summarizing the findings, the significance of HPC in water quality assessment should be reconsidered for isolated assessment of a single water sample. At present cultivation-based methods for water quality assessment cannot be replaced by molecular assays, but given the careful optimization for improving sensitivity and refinements in PMA-RT-PCR, molecular assays represent a promising and valuable detection method due to the high specificity and rapid analysis, to allow immediate actions in case of a determined contamination.13

Effect of different heterotrophic plate count methods on the composition of culturable microbial community

<p>Heterotrophic plate counts (HPC) are routinely determined within the scope of water quality<br>assessment. However, variable HPC methods with different cultivation conditions are applied.<br>These variabilities can have a significant effect on the outcome of the analysis, particularly with<br>regard to the composition of culturable microbial community. This was demonstrated by testing<br>commonly used low and high incubation temperatures (22 and 37°C) as well as high and low<br>nutrient media (yeast extract agar and R2A). The culturable microbial community composition was<br>investigated by 16S rRNA gene sequencing and additional statistical analysis (ANOVA permutation<br>test on CCA and PERMANOVA). Lower temperature(22°C) showed the abundance of naturally<br>occurring Pseudomonadaceae and Aeromonadaceae, whereas at high temperature (37°C)<br>numerous Enterobacteriaceae and Bacilli were identified. The highest biodiversity was detected at<br>lower temperature, especially on R2A medium. The most significant effect of tested cultivation<br>conditions was assigned to temperature (p < 0.01), although media also affected the abundance of<br>certain detected bacteria (as seen in the number of operational taxonomic units). These results<br>endorse the supposition that different temperatures (low and high) should be included into HPC<br>measurement, whereas the selection of media should take into account the monitored water<br>source itself. Accordingly it can be inferred that the HPC method is more suitable for continuous<br>monitoring of water quality than for single assessments.</p

Individual images of Xenopus laevis tadpoles

<b>Methods</b><br><br>Pictures of animals were acquired during the course of experimental work in the laboratory of Hans Straka at the Ludwig-Maximilians-Universität Munich. Details on methods of these experiments are available in publications from the laboratory (see references). All pictures were taken under MS-222 anesthesia of the animal.<br> <br> <i>Images:</i> All images were acquired using a camera (Moticam 580) on an Olympus SHX16 dissection scope using both a white and a black background and from a ventral and a dorsal view (illumination by a ZLED CLS 6000). Due to the size of the animals, multiple overlapping images were collected and stitched in Adobe Photoshop using the File > Automate > Photomerge function. A scale bar was added in ImageJ. For all images with a white background and a dorsal view, a mask was created in Photoshop.<br>  <br> The white dorsal views of the animals were assembled in an overview and are available in 'Xenopus laevis: overview over late tadpole stages' (see references). Schematics are available in 'Schemes of Xenopus laevis tadpoles' (see references)<br><br>Version 2: addition of stage 55 image.<br><a href="https://figshare.com/articles/Schemes_of_Xenopus_laevis_tadpoles/3841173" target="_blank"></a

Profiling of Multiphosphorylated Peptides in Kefir and Their Release During Simulated Gastrointestinal Digestion

Casein phosphopeptides are multiphosphorylated milk peptides, which can have anticariogenic activity and improve mineral absorption by binding bivalent metal ions. The present study investigated phosphopeptides in kefir because fermentation may lead to their enhanced release from milk proteins. After selective enrichment by hydroxyapatite extraction, phosphopeptides and their phosphorylation degree were identified by matrix-assisted desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) before and after enzymatic dephosphorylation. Peptide structures were determined by ultrahigh-performance liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (UHPLC–ESI–MS/MS) revealing 27 phosphopeptides in kefir, including nine peptides containing the motif pSpSpSEE, which binds minerals most efficiently. The majority (18) of phosphopeptides were derived from β-casein, but only three were derived from the most abundant milk protein αs1-casein. After simulated gastrointestinal digestion, MALDI-TOF-MS analysis detected eight putative phosphopeptides in kefir, four of which were assigned by UHPLC–ESI–MS/MS to αs2-casein124–133, αs2-casein137–146, β-casein30–40, and κ-casein147–161. These results indicate that kefir is a good dietary source of multiphosphorylated peptides