Inflammation and Cancer: Role of Annexin A1 and FPR2/ALX in Proliferation and Metastasis in Human Laryngeal Squamous Cell Carcinoma

The anti-inflammatory protein annexin A1 (ANXA1) has been associated with cancer progression and metastasis, suggesting its role in regulating tumor cell proliferation. We investigated the mechanism of ANXA1 interaction with formylated peptide receptor 2 (FPR2/ALX) in control, peritumoral and tumor larynx tissue samples from 20 patients, to quantitate the neutrophils and mast cells, and to evaluate the protein expression and co-localization of ANXA1/FPR2 in these inflammatory cells and laryngeal squamous cells by immunocytochemistry. in addition, we performed in vitro experiments to further investigate the functional role of ANXA1/FPR2 in the proliferation and metastasis of Hep-2 cells, a cell line from larynx epidermoid carcinoma, after treatment with ANXA1(2-26) (annexin A1 N-terminal-derived peptide), Boc2 (antagonist of FPR) and/or dexamethasone. Under these treatments, the level of Hep-2 cell proliferation, pro-inflammatory cytokines, ANXA1/FPR2 co-localization, and the prostaglandin signalling were analyzed using ELISA, immunocytochemistry and real-time PCR. An influx of neutrophils and degranulated mast cells was detected in tumor samples. in these inflammatory cells of peritumoral and tumor samples, ANXA1/FPR2 expression was markedly exacerbated, however, in laryngeal carcinoma cells, this expression was downregulated. ANXA1(2-26) treatment reduced the proliferation of the Hep-2 cells, an effect that was blocked by Boc2, and up-regulated ANXA1/FPR2 expression. ANXA1(2-26) treatment also reduced the levels of pro-inflammatory cytokines and affected the expression of metalloproteinases and EP receptors, which are involved in the prostaglandin signalling. Overall, this study identified potential roles for the molecular mechanism of the ANXA1/FPR2 interaction in laryngeal cancer, including its relationship with the prostaglandin pathway, providing promising starting points for future research. ANXA1 may contribute to the regulation of tumor growth and metastasis through paracrine mechanisms that are mediated by FPR2/ALX. These data may lead to new biological targets for therapeutic intervention in human laryngeal cancer.Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Fed Univ São Paulo UNIFESP, Paulista Sch Med EPM, São Paulo, BrazilFac Med FAMERP, Dept Mol Biol, Sao Jose Do Rio Preto, SP, BrazilFac Med FAMERP, Dept Otorhinolaringol, Sao Jose Do Rio Preto, SP, BrazilFac Med FAMERP, Dept Pathol, Sao Jose Do Rio Preto, SP, BrazilSão Paulo State Univ UNESP, Dept Biol & Zoot, Ilha Solteira, SP, BrazilUniv São Paulo, Inst Biosci, Dept Genet & Evolutionary Biol, São Paulo, BrazilSão Paulo State Univ UNESP, Dept Biol, Inst Biociencias Letras & Ciencias Exatas IBILCE, Saa Jose Do Rio Preto, SP, BrazilFed Univ São Paulo UNIFESP, Paulista Sch Med EPM, São Paulo, BrazilFAPESP: 2008/08187-4FAPESP: 2008/01655-2CNPq: 302768/2010-6Web of Scienc

Mechanisms of action of anti-inflammatory annexin A1 and receptor for formylated peptides FPR2/ALX in human larynx squamous cell carcinoma: in vivo and in vitro studies

Introdução: Varias evidencias demonstram que o desenvolvimento e a progressao do cancer dependem das interacoes entre as celulas tumorais e inflamatorias. A proteina anti-inflamatoria anexina 1 (ANXA1) tem sido associada com a regulacao da migracao/invasao das celulas tumorais e, recentes estudos tem sugerido que a sua acao regulatoria pode ser mediada por meio dos receptores para peptideos formilados (nFPRs). OBJETIVOS: Em funcao da importancia no entendimento da acao anti-inflamatoria/antiproliferativa da ANXA1 na interacao cancer/inflamacao, o objetivo das nossas investigacoes foi avaliar, in vivo e in vitro, as celulas tumorais e inflamatorias e, o mecanismo de acao da ANXA1 e do receptor FPR2/ALX no carcinoma epidermoide de laringe humano. MATERIAIS E METODOS: Nas amostras de tecidos laringeo controle, peritumoral e tumoral, obtidas de 20 pacientes portadores de carcinoma epidermoide de laringe, analisamos histopatologica e quantitativamente os mastocitos (MCs) e neutrofilos (Nøs). A heterogeneidade dos MCs foi analisada pela expressao das peptidases triptase e quimase por analises imuno-histoquimicas, enquanto a co-localizacao da ANXA1/FPR2 foi investigada nas celulas inflamatorias e tumorais, por meio de reacoes imunocitoquimicas ultraestruturais. As celulas Hep-2 (linhagem humana originalmente descrita como procedente de carcinoma epidermoide de laringe) foram preservadas no meio de cultura MEM (controle) ou tratadas com peptideo ANXA12-26, ANXA12-26 + antagonista Boc2, Dexametasona (Dexa), Dexa + Boc2, e somente Boc2, nos tempos de 6, 24, 48, 72, 96 e 120 horas. Nessas condicoes, analisamos a morfologia e o indice de proliferacao pela microscopia de luz, as citocinas IL-6, IL-8 e MCP-1 pelo analisador Multiplex Magpix, a expressao da ANXA1 e FPR2/ALX pelas reacoes de Western blotting e imunocitoquimica ultraestrutural. Ainda, a expressao dos genes EP3, EP4, MMP2 e MMP9 foi analisada por RT-PCR. RESULTADOS: No estroma laringeo tumoral observamos influxo de Nøs e, ainda, MCs em processo de desgranulacao, triptase positivos (MCT) nas amostras controles e tumorais e, triptase/quimase positivos (MCTC) nas peritumorais, condicoes que caracterizam um microambiente inflamatorioBV UNIFESP: Teses e dissertaçõe

Role of the receptor for formylated peptides in the anti-inflammatory action of annexin 1 and its N-terminal peptide in experimental model of peritonitis

Objetivos: Analisar o papel da proteína endógena anexina 1 (ANXA1), sua ativação gênica e expressão protéica nos mastócitos e nos neutrófilos, durante um modelo experimental de peritonite. Além disso, investigar a interação funcional do receptor para peptídeos formilados (FPR) com a proteína ANXA1 e o seu peptídeo mimético Ac2-26. Métodos: Camundongos selvagens (ANXA1+/+) e deficientes (ANXA1-/-) para ANXA1 e, selvagens (FPR+/+) e deficientes (FPR-/-) para o receptor FPR foram induzidos (i.p.) à inflamação, por 1 e 4 horas, com 1,5mg/kg de carragenina. O tratamento com o peptídeo Ac2-26 (100μg/kg) foi realizado (i.v.) quinze minutos antes do estímulo inflamatório. Como controle para a família de receptores FPR, os animais FPR+/+ receberam (i.v.) 10μg/kg do antagonista Boc2 (inibidor dos receptores FPR). Os mastócitos e os neutrófilos foram analisados histológica e quantitativamente no mesentério e no lavado peritoneal. A ativação gênica da ANXA1 foi monitorada nos animais ANXA1-/-, através da atividade enzimática da b-galactosidase, produzida pelo gene repórter LacZ. A reação imunocitoquímica ultra-estrutural (dupla marcação) detectou a expressão da ANXA1 (anticorpo LCS3) e do receptor FPR (anticorpo FPRb) nos neutrófilos peritoneais dos camundongos FPR+/+. Resultados: O estímulo inflamatório, após 1 hora, não foi significativo, enquanto após 4 horas, observamos numerosos mastócitos desgranulados e neutrófilos migrados. A resposta inflamatória foi mais exacerbada nos camundongos ANXA1-/-. O efeito da administração do peptídeo Ac2-26 exerceu uma significante ação inibitória na desgranulação dos mastócitos e na migração dos neutrófilos. A ação inibitória do peptídeo foi suprimida após o tratamento com o antagonista Boc2, avaliado pelo aumento da ativação e transmigração das células inflamatórias. A ativação gênica da ANXA1 foi acentuada após 1 e 4 horas do processo inflamatório. Nas análises imunocitoquímicas, verificamos uma intensa imunorreatividade da ANXA1 após 4 horas do processo inflamatório e do tratamento com o peptídeo, além disso, mostramos, pela primeira vez na literatura, a co-localização ultra-estrutural do receptor FPR com a ANXA1, na membrana plasmática dos neutrófilos. Conclusões: A exacerbação do processo inflamatório na ausência da ANXA1, sua intensa ativação gênica e expressão protéica durante a resposta inflamatória aguda mostraram que a proteína endógena ANXA1 apresenta um importante papel regulatório na ativação dos mastócitos e na diapedese dos neutrófilos. Além disso, embora o receptor FPR tenha sido co-localizado ultraestruturalmente com a proteína ANXA1, este receptor parece não estar envolvido na mediação do peptídeo Ac2-26 (porção N-terminal da ANXA1) nas células inflamatórias estudas, efeito obtido pelo pré-tratamento farmacológico nos animais deficientes para o FPR. Este fato sugere que distintos mecanismos de ação podem estar relacionados com a proteína inteira ou com o seu sítio ativo antiinflamatório, peptídeo N-terminal. Os achados experimentais poderão promover um avanço no desenvolvimento de novas terapias baseadas nas ações antiinflamatórias da anexina 1..BV UNIFESP: Teses e dissertaçõe