Unraveling the complex trait of low temperature adaptation in the wine yeast Saccharomyces cerevisiae

1. Introducción Se cree que las uvas fueron domesticadas entre el Mar Negro e Irán durante el periodo del 7000-4000 aC. Las primeras evidencias de elaboración de vino provienen de la presencia de ácido tartárico en un tarro antiguo que data de 5400 - 5000 aC en el yacimiento neolítico de Tepe en Mesopotamia y de los restos de la extracción del zumo de uva en el yacimiento neolítico de Dikili Tash en Grecia (5000 aC). La colonización de los romanos extendió la elaboración del vino por todo el Mediterráneo; en el 500 aC el vino ya se producía en Italia, Francia, España, Portugal y el norte de África. Posteriormente también fue extendido a los Balcanes, Alemania y otras partes del norte de Europa. En 1530, los conquistadores españoles introdujeron la vid en México, Argentina, Perú y Chile. De la misma manera, en 1655 los holandeses plantaron vides en Sudáfrica (Pretorius, 2000a; Sicard and Legras, 2011). Sin embargo, no fue hasta 1860, cuando Louis Pasteur descubrió que la levadura era la responsable de la conversión del azúcar en etanol y dióxido de carbono, cuando el proceso de elaboración del vino recibió el nombre de fermentación. Con el conocimiento de que la levadura era responsable de la fermentación, los productores podrían controlar el proceso desde la viña hasta la planta embotelladora. Más tarde, en 1890, Müller - Thurgau introdujo el concepto de la inoculación de las fermentaciones con el cultivo de levaduras (Pretorius, 2000). En la actualidad la mayor parte de la producción se basa en el uso de cultivo iniciadores de levaduras seleccionadas como práctica enológica para generar vinos con características deseables y para garantizar la homogeneidad de las cosechas sucesivas. Una de las principales demandas del sector vitivinícola está asociada a resolver los problemas generados por el cambio climático. El disponer de levaduras que produzcan un menor rendimiento en etanol, o que incrementen el contenido en glicerol en los vinos pueden ser buenas estrategias para resolver este tipo de problemas. Además de las características fisiológicas mencionadas, las levaduras también deben adaptarse a las actuales prácticas enológicas. Dentro de estas tendencias se encuentra la realización de fermentaciones a baja temperatura para vinos blancos y rosados, ya que se obtienen vinos con una mayor complejidad organoléptica (Beltran et al., 2006; Molina et al., 2007; Torija et al., 2003). Esta práctica se limita a fermentaciones de vinos blancos y rosados ya que en vinos tintos es necesario el uso de temperaturas más altas (22-28 ºC) para la extracción de los compuestos fenólicos de la piel de la uva. Las bajas temperaturas aumentan no sólo la retención sino también la producción de algunos compuestos volátiles (Killian and Ough, 1979). En estas condiciones se produce una mayor cantidad de compuestos aromáticos, especialmente de ésteres que imparten aromas dulces y afrutados, a la vez que se disminuye la producción de algunos compuestos desagradables, tales como ciertos alcoholes superiores y ácido acético (Beltrán et al., 2006). Otro aspecto interesante es que las bajas temperaturas reducen notablemente el crecimiento de bacterias lácticas y acéticas, lo que facilita el control del proceso (Ribéreau-Gayon et al., 2000). A pesar de que las fermentaciones a baja temperatura presentan ventajas interesantes; esta práctica también tiene algunas desventajas principalmente relacionadas con la disminución de la tasa de crecimiento de las levaduras. La temperatura óptima de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae es alrededor de 32 ºC (Salvadó et al., 2011), por lo que la baja temperatura aumenta la fase de latencia, ralentizando el proceso fermentativo e incluso dando lugar a paradas del mismo (Bisson, 1999). Por otra parte, los factores moleculares y fisiológicos que determinan una mejor adaptación de las diferentes especies a las bajas temperaturas durante los procesos de fermentación no son del todo bien conocidos. Varios estudios han puesto de manifiesto la importancia de la composición lipídica en la respuesta adaptativa de las levaduras a las temperaturas ambientales (Beltran et al., 2008; López-Malo et al., 2013a; Redón et al., 2011; Torija et al., 2003; Tronchoni et al., 2012b). El efecto más comúnmente descrito debido a la bajada de temperatura, es un aumento en el grado de insaturación de los ácidos grasos, que se traduce en un aumento en la fluidez de membrana. Sin embargo, esta respuesta podría no ser universal para todas las levaduras. Existen otras formas de aumentar la fluidez de la membrana, como puede ser disminuir la longitud de cadena de los ácidos grasos. Este efecto ha sido descrito en fermentaciones a escala industrial (Torija et al., 2003; Beltrán et al., 2008). De la misma forma que es importante conocer los factores fisiológicos que intervienen en la adaptación a la baja temperatura, también lo es conocer cuáles son las diferencias en la expresión génica que pueden justificar una mejor o peor adaptación en ambientes fríos. Beltrán et al., (2006) realizó un análisis del transcriptoma utilizando la cepa comercial vínica de S. cerevisiae QA23 en condiciones de fermentación industriales a baja temperatura. Observaron que los genes relacionados con el ciclo celular, el crecimiento celular, el destino celular se expresaban menos en la fase de crecimiento exponencial a 13 ºC comparado con 25 ºC. Mientras que los genes cuya expresión se activaba durante la fase exponencial a 13 ºC eran esencialmente genes del metabolismo lipídico y nitrogenado y genes de transporte de nutrientes, junto con genes de respuesta a estrés ambiental previamente descrita por Gasch et al., (2000). Teniendo en cuenta estos antecendentes, el objetivo global de la tesis es el estudio de las bases moleculares y de los mecanismos fisiológicos que determinan una mayor tolerancia a la baja temperatura en levaduras vínicas. Este objetivo global se abordó en distintos objetivos parciales que corresponden con los cuatro capítulos de la presente tesis. 2. Resultados y discusión CAPÍTULO 1 En este objetivo realizamos un análisis fenotípico de una colección de 27 levaduras vínicas industriales pertenecientes al género Saccharomyces en base a su temperatura de crecimiento. Con el fin de seleccionar dos levaduras que presentaran un comportamiento divergente frente a la baja temperatura. Se llevó a cabo un fenotipado de la colección de levaduras en el rango de temperatura comprendido entre 4-45 ºC tanto en medio mínimo (SD) como en mosto sintético (SM). Se seleccionaron dos cepas, P5 y P24, que presentaban un comportamiento divergente a baja temperatura (15 ºC), pero comportamientos similares a su temperatura óptima de crecimiento (28 ºC). P5 fue seleccionada como la levadura que presentaba un buen comportamiento a baja temperatura mientras que P24 fue seleccionada por presentar un crecimiento más afectado en frío. Para tener un control de que la selección se había realizado correctamente marcamos la cepa P5 con la proteína verde fluorescente (GFP) y realizamos cultivos mixtos (P5/P24) a ambas temperaturas, de manera que pudimos comprobar que a 15 ºC, la P5 se imponía de manera clara a la P24 desplazándola del cultivo, mientras que a 28 ºC los porcentajes de ambas cepas de mantenían cercanos al 50% durante todo el proceso. A continuación, con las cepas seleccionadas, llevamos a cabo fermentaciones en continúo usando la misma velocidad de crecimiento, tanto a baja temperatura como a temperatura óptima. Mediante el uso de este sistema podemos separar los efectos causados por la propia velocidad de crecimiento de cada cepa de los efectos provocados por la baja temperatura. Las células obtenidas se usaron para realizar estudios transcriptómicos y proteómicos, así como la secuenciación de los genomas de ambas cepas. En cuanto a la comparación de los transcriptomas de cada cepa por separado a baja temperatura, obtuvimos 211 y 128 genes diferencialmente expresados en frío en P5 y P24, respectivamente. Cabe destacar que la cepa con un mejor comportamiento a baja temperatura presentaba una respuesta transcripcional más fuerte, como se observa en el mayor número de genes regulados por la temperatura. Sólo 32 de estos genes eran comunes a ambas comparaciones, poniendo de manifiesto el gran carácter cepa-dependiente de la respuesta frente a la baja temperatura. Tanto en las comparaciones dentro de la misma cepa a distintas temperaturas como entre cepas a la misma temperatura, siempre surgían categorías funcionales relacionadas con el metabolismo del azufre y del aminoácido metionina. Además, los genes incluidos en estas categorías se situaban en su gran mayoría dentro de la ruta de captación de azufre, con un mayor número de genes regulados positivamente en la cepa P5. Siguiendo el mismo procedimiento realizamos un análisis proteómico mediante 2D-PAGE y posterior espectrometría de masas. El número de proteínas con una concentración diferencial a baja temperatura fue de 7 y 6 en P5 y P24 respectivamente. Estas proteínas pertenecían principalmente a la glucolisis, el proceso de traducción y respuesta frente a estrés oxidativo. Lo más interesante surgió de la comparación entre ambas cepas a 15 ºC donde, de manera similar al análisis transcriptómico, algunas de las proteínas diferenciales pertenecían a la ruta de captación de azufre. Teniendo en cuanta tanto los datos de expresión como de proteínas, decidimos suplementar a las células con tres de los compuestos finales (S- adenosil metionina, glutatión oxidado y glutatión reducido) de la ruta de captación de azufre para ver su impacto sobre las fermentaciones a baja temperatura. La adición de estos compuestos provocaba, excepto el SAM en P5, una disminución del tiempo de generación, especialmente en P24 que alcanzaba velocidades de crecimiento similares a P5. De la misma manera, testamos la capacidad de recuperación tras un choque con un agente oxidante, y observamos que la cepa P5 también presentaba una mejor recuperación, manteniéndose el comportamiento divergente frente a la baja temperatura también frente al estrés oxidativo. La actividad de esta ruta tiene mucha influencia en otros procesos celulares, muchos de ellos con gran importancia en la adaptación a la baja temperatura como la síntesis de fosfolípidos. Cambios en la composición de la membrana plasmática como respuesta adaptativa al frío han sido ampliamente descritos (Beltran et al., 2006; Henderson et al., 2013b; Redón et al., 2011; Tronchoni et al., 2012b). La fosfatidilcolina (PC) es el fosfolípido más abundante de la membrana (~30%) y es sintetizada de novo a partir de la fosfatidiletanolamina (PE) mediante 3 metilaciones que utilizan como donador de grupos metilo a la S-Adenosilmetionina (Chin and Bloch, 1988). De modo que la alta demanda de PC a baja temperatura podría dar como lugar un incremento en la demanda de SAM y por tanto una mayor activación transcripcional de la ruta de captación de azufre. Otra posible explicación sería que el mayor estrés oxidativo al que se ven sometidas las células a baja temperatura (Ballester-Tomás et al., 2015; Paget et al., 2014; Zhang et al., 2003) haga necesario producir una mayor cantidad de glutatión que ayudaría a mantener el equilibrio redox de la célula. Complementariamente a los análisis transcriptómico y proteómico, se secuenciaron los genomas de ambas cepas y se compararon con la cepa de referencia S288c. Se encontraron 6446 SNPs entre ambas cepas vínicas, un número notablemente pequeño, pero lógico debido a que son cepas que se encuentran filogenéticamente muy próximas. Muchos de los polimorfismos entre ambas cepas se encontraban nuevamente en genes relacionados con la ruta de captación de azufre. CAPÍTULO 2 En base a los resultados obtenidos en el primer capítulo, decidimos estudiar en más detalle la posible correlación entre la respuesta frente a estrés oxidativo y la respuesta frente a la baja temperatura. Para ello realizamos un estudio del comportamiento a baja temperatura (12 y 15 ºC) y frente a distintos oxidantes (H2O2, menadiona, terbutilo y cumeno hidroperóxido) empleando 40 levaduras del género Saccharomyces pertenecientes a diversos procesos y orígenes geográficos. Analizamos el área bajo la curva (AUC) de crecimiento de las distintas levaduras en las diversas condiciones y realizamos un agrupamiento jerárquico de las mismas. El resultado más significativo fue el fuerte agrupamiento que se producía entre las condiciones de baja temperatura y el comportamiento de la población frente al peróxido de hidrógeno. Poniendo de manifiesto la posible existencia de un mecanismo de respuesta común. A continuación, seleccionamos 40 mutantes homocigotos, de la colección de la levadura de laboratorio BY4743, en genes relacionados con la respuesta a estrés oxidativo para realizar un muestreo frente a baja temperatura. Se analizaron diversos parámetros de crecimiento tanto en medio YPD como en mosto sintético (SM) y aquellos mutantes que presentaban un fenotipo más afectado a baja temperatura, pero no a 28 ºC, fueron seleccionados para posteriores estudios. Se seleccionaron 10 genes (TSA1, MUP1, GPX1, GLR1, GRX1, TRX2, TRX3, URM1, SRX1 y AHP1), pertenecientes a diversas rutas metabólicas relacionadas con la respuesta frente a estrés oxidativo, para construir mutantes en el fondo genético de las levaduras vínicas seleccionadas en el capítulo anterior por su comportamiento divergente frente a la baja temperatura. La eliminación de prácticamente cualquiera de los 10 genes en la cepa P24 daba como resultado un fenotipo afectado a baja temperatura. Sin embargo, este efecto fue más acusado en los mutantes para los genes MUP1 y URM1. En el caso de P5, los mutantes que presentaban un mayor retraso en la fermentación a baja temperatura fueron MUP1 y AHP1, aunque este último se encontraba muy afectado también a temperatura óptima, con lo cual no se trataba de un efecto debido a la temperatura. Nuestros resultados corroboran que existe una alta correlación entre la respuesta fisiológica a la baja temperatura y el estrés oxidativo, más concretamente frente al peróxido de hidrógeno. Una posible explicación a este hecho podría ser que el frío provoca una situación de mayor estrés oxidativo, debido a que se produce un desequilibrio redox, que debe ser corregido mediante la regulación dinámica del ratio NAD(P)+/NAD(P)H (Ballester-Tomás et al., 2015; Paget et al., 2014). Nuestro análisis de los mutantes en genes de estrés oxidativo a baja temperatura mostró la importancia de los genes MUP1 y URM1 durante las fermentaciones en mosto sintético. MUP1 codifica para una permeasa de alta afinidad de metionina, implicada también en la captación de cisteína (Kosugi et al., 2001). De nuevo, observamos la importancia de la ruta de captación de azufre a baja temperatura, de modo que el mutante para este transpotador en P5 presentaba un fenotipo muy afectado. URM1 codifica para un modificador post-traduccional de otras proteínas y que también está implicado en la señalización por nutrientes (Goehring et al., 2003). Para esclarecer la posible función de este gen en la adaptación a baja temperatura es necesario realizar más análisis en un futuro. CAPÍTULO 3 Dado que la adaptación a la baja temperatura en levaduras, como una gran parte de los caracteres de interés industrial, está bajo el control de múltiples genes (QTLs), decidimos realizar un mapeo para localizar los genes o regiones genéticas implicadas en esta adaptación. Para ello construimos una población híbrida entre las cepas seleccionadas en el capítulo 1 (P5 y P24) y la sometimos a 13 rondas de esporulación e hibridación con el fin de generar una población final que presentara un genoma mosaico; disminuyendo así el ligamiento entre QTLs cercanos. Para estar seguros de que la recombinación se estaba produciendo de manera efectiva, secuenciamos 6 SNPs situados a lo largo del cromosoma III y reconstruimos los haplotipos de 30 individuos de la población F6. Fuimos capaces de encontrar 27 haplotipos diferentes, comprobando así que el proceso de recombinación estaba ocurriendo de manera eficaz. Una vez conseguida esta población mosaico fue sometida a un proceso de selección en YPD y SM tanto a 15 como a 28 ºC, tras lo cual, todas poblaciones seleccionadas, así como la población sin seleccionar, fueron secuenciadas. A continuación las frecuencias alélicas de las poblaciones fueron comparadas con las de la población sin seleccionar con el fin de encontrar genes o regiones en los cuales se produjera un aumento en la frecuencia alélica y por tanto una fijación de esa variante durante el proceso de selección. Localizamos 4 regiones del genoma en las cuales se producía un cambio en la frecuencia alélica cuando la población era seleccionada en mosto sintético a baja temperatura. Tres de ellas se situaban en las regiones subteloméricas de los cromosomas XIII, XV y XVI y una cuarta localizada en el brazo derecho del cromosoma XIV. En la selección en YPD, solo localizamos un pico que era coincidente con el localizado en SM en el cromosoma XVI. Las regiones subteloméricas son muy difíciles de secuenciar y ensamblar debido a su gran variación, presencia de duplicaciones y zonas con muchas repeticiones con homología entre los distintos cromosomas. Este hecho hace que las regiones cercanas a los telómeros estén incompletas en la mayoría de los proyectos de secuenciación y, por tanto, se dificulta la localización de los genes responsables de un fenotipo localizados en estas zonas. Para validar la importancia de estas regiones en ambas cepas seguimos la estrategia de hemicigosis recíproca (RH), en la cual se utilizan derivados haploides de las cepas parentales, a los cuales se les elimina una de las copias del gen o región en cuestión y se hibrida con el otro derivado haploide sin ninguna deleción. En este caso se eliminaron las tres regiones subteloméricas detectadas tanto en el derivado haploide de P5 como de P24, y se analizaron los fenotipos de los híbridos en una fermentación a baja temperatura. La falta de la zona subtelomérica del cromosoma XVI de P5 causaba un retraso muy importante en la fermentación a baja temperatura pero también a 28 ºC, aunque no de manera tan dramática. La falta de esta misma región perteneciente a la cepa P24 mejoraba el proceso, denotando la presencia en esta región de la cepa P5 de genes con una gran importancia para la fermentación alcohólica a ambas temperaturas. De la misma forma, la falta de la región subtelomérica del cromosoma XIII de P24 daba como resultado un fenotipo afectado a ambas temperaturas. Sin embargo, la falta de esta misma zona de P5 mejoraba el proceso. La única de las regiones subteloméricas detectadas que presentaba una dependencia de la baja temperatura fue la perteneciente al cromosoma XV en la cepa P5, cuya ausencia retrasaba el proceso fermentativo, mientras que la falta de la misma perteneciente a P24 mejoraba el proceso. La región del cromosoma XIV fue la única que no estaba situada en la zona subtelomérica, y para tratar de identificar los genes responsables del fenotipo, se realizaron análisis de RH con los cuatro genes más cercanos al QTL (AGA1, PET494, COQ2 y FPK1). AGA1 es una aglutinina implicada en el proceso de reproducción sexual y su deleción no tenía ningún efecto a baja temperatura. Sin embargo, el análisis de las cepas hemicigotas para cualquiera de los otros genes generaba claras diferencias durante la fermentación a 15 ºC. PET494 y COQ2 son proteínas mitocondriales cuya deleción tanto en P5 como en P24 afecta al proceso fermentativo a ambas temperaturas, pero especialmente a 15 ºC. PET494 es un activador traduccional de una de las subunidades (COX3) de la citocromo c oxidasa (Naithani et al., 2003) mientras que COQ2 es una transferasa que cataliza el segundo paso de la síntesis de la ubiquinona (Ashbysb et al., 1992). La falta de ambos genes hace que la mitocondria funcione de manera incorrecta y las células no puedan respirar. Varios autores han descrito que la falta de mitocondrias funcionales genera fenotipos más sensibles al estrés oxidativo (Grant et al., 1997), de modo que el estrés generado a baja temperatura junto con esta deficiencia podría ser un efecto aditivo, que la levadura no es capaz de contrarrestar. En cuanto al gen FPK1, codifica para una “Ser/Thr protein kinasa” que fosforila varias translocasas de lípidos y, por tanto, interviene en el mantenimiento de la asimetría de la membrana plasmática. La eliminación del alelo del alelo de la cepa P24 no tenía efecto en la cepa hemicigota, sin embargo, la deleción del alelo proveniente de P5 provocaba un retraso de ~340 horas en la fermentación a baja temperatura. Al comparar las secuencias de ambos genes observamos que la cepa P24 presentaba una sustitución aminoacídica (R520K) en este gen, que podría ser el responsable del fenotipo inferior de este alelo. También realizamos análisis de RH construyendo híbridos entre los derivados haploides de las cepas vínicas y los mutantes para los genes situados en las regiones subtelómericas de la cepa de laboratorio BY4741. La capacidad fermentativa de los híbridos generados, los cuales sólo mantenían la copia vínica de cada uno de los genes analizados, fue testada tanto a 15 como a 28 ºC. En el cromosoma XIII, los genes cuya hemicigosis producía haploinsuficiencia en el híbrido de ambas cepas vínicas fueron YMR316C-A, DIA1 y ADH6. YMR316C-A y DIA1 son proteínas de función desconocida, cuyas ORFs se superponen. ADH6 es una alcohol deshidrogenasa. En la región subtelomérica del cromosoma XV, sólo dos genes pudieron ser analizados debido a que los otros genes contenidos en esta región eran esenciales. La hemicigosis de la proteína de función desconocida, YOL159C, afectó severam

Correlation between Low Temperature Adaptation and Oxidative Stress in Saccharomyces cerevisiae

Many factors, such as must composition, juice clarification, fermentation temperature, or inoculated yeast strain, strongly affect the alcoholic fermentation and aromatic profile of wine. As fermentation temperature is effectively controlled by the wine industry, low-temperature fermentation (10–15°C) is becoming more prevalent in order to produce white and “rosé” wines with more pronounced aromatic profiles. Elucidating the response to cold in Saccharomyces cerevisiae is of paramount importance for the selection or genetic improvement of wine strains. Previous research has shown the strong implication of oxidative stress response in adaptation to low temperature during the fermentation process. Here we aimed first to quantify the correlation between recovery after shock with different oxidants and cold, and then to detect the key genes involved in cold adaptation that belong to sulfur assimilation, peroxiredoxins, glutathione-glutaredoxins, and thioredoxins pathways. To do so, we analyzed the growth of knockouts from the EUROSCARF collection S. cerevisiae BY4743 strain at low and optimal temperatures. The growth rate of these knockouts, compared with the control, enabled us to identify the genes involved, which were also deleted and validated as key genes in the background of two commercial wine strains with a divergent phenotype in their low-temperature growth. We identified three genes, AHP1, MUP1, and URM1, whose deletion strongly impaired low-temperature growth.This work has been financially supported from the Spanish Government through MINECO and FEDER funds (AGL2013-47300-C3-3-R and PCIN-2015-143 grants) and from Generalitat Valenciana through PROMETEOII/2014/042 grant, awarded to JG. This study has been carried out in the context of the European Project ERA-IB “YeastTempTation” EG also thanks the Spanish government for an FPI grant BES-2011-044498.Peer reviewe

Is It Feasible to Use CMV-Specific T-Cell Adoptive Transfer as Treatment Against Infection in SOT Recipients?

During the last decade, many studies have demonstrated the role of CMV specific T-cell immune response on controlling CMV replication and dissemination. In fact, it is well established that transplanted patients lacking CMV-specific T-cell immunity have an increased occurrence of CMV replication episodes and CMV-related complications. In this context, the use of adoptive transfer of CMV-specific T-cells has been widely investigated and applied to Hematopoietic Stem Cell Transplant patients and may be useful as a therapeutic alternative, to reconstitute the CMV specific T-cell response and to control CMV viremia in patients receiving a transplantation. However, only few authors have explored the use of T-cell adoptive transfer in SOT recipients. We propose a novel review in which we provide an overview of the impact of using CMV-specific T-cell adoptive transfer on the control of CMV infection in SOT recipients, the different approaches to stimulate, isolate and expand CMV-specific T-cells developed over the years and a discussion of the possible use of CMV adoptive cellular therapy in this SOT population. Given the timeliness and importance of this topic, we believe that such an analysis will provide important insights into CMV infection and its treatment/prevention.This study was supported by the Spanish Ministry of Science, Innovation and University, Instituto de Salud Carlos III Grant/Award Numbers: PI17CIII-00014 (MPY110/18); DTS18CIII/00006 (MPY127/19); PI20-009 (MPY303/20). This work was supported by Plan Nacional de I + D+i 2013‐2016 and Instituto de Salud Carlos III, Subdirección General de Redes y Centros de Investigación Cooperativa, Ministry of Science, Innovation and University, Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI RD16/0016/0009), co-financed by European Development Regional Fund ‘A way to achieve Europe’. EG-R is supported by the Sara Borrell Program (CD18CIII/00007), Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. FM is supported by the PFIS Program (F18III/00013), Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. MN is supported by the FPU program (FPU19/05927), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades.S

Functional analysis of lipid metabolism genes in wine yeasts during alcoholic fermentation at low temperature

11 pages, 1 table, 6 figures.Wine produced by low-temperature fermentation is mostly considered to have improved sensory qualities. However few commercial wine strains available on the market are well-adapted to ferment at low temperature (10 – 15°C). The lipid metabolism of Saccharomyces cerevisiae plays a central role in low temperature adaptation. One strategy to modify lipid composition is to alter transcriptional activity by deleting or overexpressing the key genes of lipid metabolism. In a previous study, we identified the genes of the phospholipid, sterol and sphingolipid pathways, which impacted on growth capacity at low temperature. In the present study, we aimed to determine the influence of these genes on fermentation performance and growth during low-temperature wine fermentations. We analyzed the phenotype during fermentation at the low and optimal temperature of the lipid mutant and overexpressing strains in the background of a derivative commercial wine strain. The increase in the gene dosage of some of these lipid genes, e.g., PSD1, LCB3, DPL1 and OLE1, improved fermentation activity during low-temperature fermentations, thus confirming their positive role during wine yeast adaptation to cold. Genes whose overexpression improved fermentation activity at 12°C were overexpressed by chromosomal integration into commercial wine yeast QA23. Fermentations in synthetic and natural grape must were carried out by this new set of overexpressing strains. The strains overexpressing OLE1 and DPL1 were able to finish fermentation before commercial wine yeast QA23. Only the OLE1 gene overexpression produced a specific aroma profile in the wines produced with natural grape must.This work has been financially supported by grants AGL2010-22001-C02-01 and PROMETEOII/2014/042 from the Spanish government and the Generalitat Valenciana, respectively, awarded to JMG. MLM wishes to thank the Spanish government for her FPI grant.Peer reviewe

Genome-wide identification of genes involved in growth and fermentation activity at low temperature in Saccharomyces cerevisiae

Fermentation at low temperatures is one of the most popular current winemaking practices because of its reported positive impact on the aromatic profile of wines. However, low temperature is an additional hurdle to develop Saccharomyces cerevisiae wine yeasts, which are already stressed by high osmotic pressure, low pH and poor availability of nitrogen sources in grape must. Understanding the mechanisms of adaptation of S. cerevisiae to fermentation at low temperature would help to design strategies for process management, and to select and improve wine yeast strains specifically adapted to this winemaking practice. The problem has been addressed by several approaches in recent years, including transcriptomic and other high-throughput strategies. In this work we used a genome-wide screening of S. cerevisiae diploid mutant strain collections to identify genes that potentially contribute to adaptation to low temperature fermentation conditions. Candidate genes, impaired for growth at low temperatures (12 °C and 18 °C), but not at a permissive temperature (28 °C), were deleted in an industrial homozygous genetic background, wine yeast strain FX10, in both heterozygosis and homozygosis. Some candidate genes were required for growth at low temperatures only in the laboratory yeast genetic background, but not in FX10 (namely the genes involved in aromatic amino acid biosynthesis). Other genes related to ribosome biosynthesis (SNU66 and PAP2) were required for low-temperature fermentation of synthetic must (SM) in the industrial genetic background. This result coincides with our previous findings about translation efficiency with the fitness of different wine yeast strains at low temperature.Funding from the Spanish Government trough MINECO and FEDER funds: MINECO AGL2012-32064 and AGL2015-63629-R grants, INIA RM2012-00007-00-00 grant, MINECO RTC-2014-2186-2 and MINECO PCIN-2015-143 grants is acknowledged.Peer reviewe

Improved antimicrobial activity of immobilised essential oil components against representative spoilage wine microorganisms

[EN] Wine, as a fermented drink, is considered a microbiologically safe beverage, but the growth of spoilage microorganisms can cause economic damage. As a new preservative process, the application of immobilised essential oil components (EOCs) is proposed in this study. EOCs were attached to the surface of three different commercial supports (silica particles, cellulose particles and cellulosic membrane) to avoid the disadvantages of using these compounds in their free form, such as volatility, low water solubility and intense aroma. The results showed that the treatment of spoilage microorganisms with antimicrobial particles (silica and cellulose) significantly reduced the viability and growth capacity of the target microorganisms. The covalent attachment of EOCs to particles led to a significant reduction in both the MIC values and viability compared with most free compounds. The enhanced antimicrobial activity of EOCs after their anchorage to a support was confirmed, resulting in MIC values of 10-90 fold lower than those of the free bioactive compounds. In addition, the filtration of microorganism suspensions through EOC-functionalised membranes showed remarkably antimicrobial activity.Authors gratefully acknowledge the financial support from the Ministerio de Economia y Competitividad and FEDER-EU (Projects AGL2015-70235-C2-1-R and AGL2016-77505-C3-1-R, granted to JMB and JMG, respectively). The authors also thank the Electron Microscopy Service at the UPV for support. Authors thank Antonio Ruiz for technical assistance.García-Ríos, E.; Ruiz Rico, M.; Guillamón Navarro, JM.; Pérez-Esteve, É.; Barat Baviera, JM. (2018). Improved antimicrobial activity of immobilised essential oil components against representative spoilage wine microorganisms. Food Control. 94:177-186. https://doi.org/10.1016/j.foodcont.2018.07.005S1771869

Differential proteomic analysis by SWATH-MS unravels the most dominant mechanisms underlying yeast adaptation to non-optimal temperatures under anaerobic conditions

Elucidation of temperature tolerance mechanisms in yeast is essential for enhancing cellular robustness of strains, providing more economically and sustainable processes. We investigated the differential responses of three distinct Saccharomyces cerevisiae strains, an industrial wine strain, ADY5, a laboratory strain, CEN.PK113-7D and an industrial bioethanol strain, Ethanol Red, grown at sub- and supra-optimal temperatures under chemostat conditions. We employed anaerobic conditions, mimicking the industrial processes. The proteomic profile of these strains in all conditions was performed by sequential window acquisition of all theoretical spectra-mass spectrometry (SWATH-MS), allowing the quantification of 997 proteins, data available via ProteomeXchange (PXD016567). Our analysis demonstrated that temperature responses differ between the strains; however, we also found some common responsive proteins, revealing that the response to temperature involves general stress and specific mechanisms. Overall, sub-optimal temperature conditions involved a higher remodeling of the proteome. The proteomic data evidenced that the cold response involves strong repression of translation-related proteins as well as induction of amino acid metabolism, together with components related to protein folding and degradation while, the high temperature response mainly recruits amino acid metabolism. Our study provides a global and thorough insight into how growth temperature affects the yeast proteome, which can be a step forward in the comprehension and improvement of yeast thermotolerance.Financial support is acknowledged to Project ERA-IB “YeastTempTation” (ERA-IB-2-6/0001/2014), and FCT for the strategic funding of UIDB/04469/2020 unit and COMPETE 2020 (POCI-01-0145-FEDER-006684), and BioTecNorte operation (NORTE-01-0145-FEDER-000004). Lallemand Ibéria, SA is acknowledged for the supply of yeast strains. Te proteomic analysis was carried out in the SCSIE University of Valencia Proteomics Unit, a member of the ISCIII ProteoRed Proteomics Platform. Authors thank to Luz Valero, researcher of the Proteomic unit, for her valuable support.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Selection and subsequent physiological characterization of industrial Saccharomyces cerevisiae strains during continuous growth at sub- and- supra optimal temperatures

Supplementary material related to this article can be found, in the online version, at doi:https://doi.org/10.1016/j.btre.2020.e00462.A phenotypic screening of 12 industrial yeast strains and the well-studied laboratory strain CEN.PK113-7D at cultivation temperatures between 12°C and 40°C revealed significant differences in maximum growth rates and temperature tolerance. From those 12, two strains, one performing best at 12°C and the other at 40°C, plus the laboratory strain, were selected for further physiological characterization in well-controlled bioreactors. The strains were grown in anaerobic chemostats, at a fixed specific growth rate of 0.03h1 and sequential batch cultures at 12°C, 30°C, and 39°C. We observed significant differences in biomass and ethanol yields on glucose, biomass protein and storage carbohydrate contents, and biomass yields on ATP between strains and cultivation temperatures. Increased temperature tolerance coincided with higher energetic efficiency of cell growth, indicating that temperature intolerance is a result of energy wasting processes, such as increased turnover of cellular components (e.g. proteins) due to temperature induced damage.We would like to thank Judith Cohen and Kristen H. David for technical assistance with the chemostat fermentations and José Ma Heras (Lallemand Ibéria, SA) for kindly providing the industrial strains. This research was carried out within the ERA-IB project “YeastTempTation” (ERA-IB-2-6/0001/2014) and partially supported by the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) through strategic funding UID/BIO/04469/2020 and BioTecNorte (NORTE-01-0145-FEDER-000004).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Improving the Cryotolerance of Wine Yeast by Interspecific Hybridization in the Genus Saccharomyces

Fermentations carried out at low temperatures (10–15°C) enhance the production and retention of flavor volatiles, but also increase the chances of slowing or arresting the process. Notwithstanding, as Saccharomyces cerevisiae is the main species responsible for alcoholic fermentation, other species of the genus Saccharomyces, such as cryophilic species Saccharomyces eubayanus, Saccharomyces kudriavzevii and Saccharomyces uvarum, are better adapted to low-temperature fermentations during winemaking. In this work, a Saccharomyces cerevisiae × S. uvarum hybrid was constructed to improve the enological features of a wine S. cerevisiae strain at low temperature. Fermentations of white grape musts were performed, and the phenotypic differences between parental and hybrid strains under different temperature conditions were examined. This work demonstrates that hybridization constitutes an effective approach to obtain yeast strains with desirable physiological features, like low-temperature fermentation capacity, which genetically depend on the expression of numerous genes (polygenic character). As this interspecific hybridization approach is not considered a GMO, the genetically improved strains can be quickly transferred to the wine industry

Discordance Between SARS-CoV-2-specific Cell-mediated and Antibody Responses Elicited by mRNA-1273 Vaccine in Kidney and Liver Transplant Recipients

Background: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2-specific cell-mediated immunity (SARS-CoV-2-CMI) elicited by mRNA-based vaccines in solid organ transplant (SOT) recipients and its correlation with antibody responses remain poorly characterized. Methods: We included 44 (28 kidney, 14 liver, and 2 double organ) recipients who received the full series of the mRNA-1273 vaccine. SARS-CoV-2-CMI was evaluated at baseline, before the second dose, and at 2 wk after completion of vaccination by an ELISpot-based interferon-γ FluoroSpot assay using overlapping peptides covering the S1 domain. SARS-CoV-2 immunoglobulin G seroconversion and serum neutralizing activity against the spike protein were assessed at the same points by commercial ELISA and an angiotensin-converting enzyme-2/spike antibody inhibition method, respectively. Postvaccination SARS-CoV-2-CMI was compared with 28 healthcare workers who received the BNT162b2 vaccine. Results: Positive SARS-CoV-2-CMI increased from 6.8% at baseline to 23.3% after the first mRNA-1273 dose and 59.5% after the completion of vaccination (P < 0.0001). Lower rates were observed for immunoglobulin G seroconversion (2.3%, 18.6%, and 57.1%, respectively) and neutralizing activity (2.3%, 11.6%, and 31.0%). There was a modest correlation between neutralizing titers and the magnitude of SARS-CoV-2-CMI (Spearman's rho: 0.375; P = 0.015). Fifteen recipients (35.7%) mounted SARS-CoV-2-CMI without detectable neutralizing activity, whereas 3 (7.1%) did the opposite, yielding poor categorical agreement (Kappa statistic: 0.201). Rates of positive SARS-CoV-2-CMI among SOT recipients were significantly decreased compared with nontransplant controls (82.1% and 100.0% after the first dose and completion of vaccination, respectively; P < 0.0001). Kidney transplantation, the use of tacrolimus and prednisone, and the number of immunosuppressive agents were associated with lower cell-mediated responses. Results remained unchanged when 3 recipients with prevaccination SARS-CoV-2-CMI were excluded. Conclusions: Two-thirds of SOT recipients mounted SARS-CoV-2-CMI following vaccination with mRNA-1273. Notable discordance was observed between vaccine-induced cell-mediated and neutralizing humoral immunities. Future studies should determine whether these patients with incomplete responses are effectively protected.This work was supported by the Instituto de Salud Carlos III, Spanish Ministry of Science and Innovation (COVID-19 Research Call COV20/00181) and cofinanced by the European Development Regional Fund “A way to achieve Europe.” M.F.R. holds a research contract “Miguel Servet” (CP18/00073) and R.L.G. a research contract “Rio Hortega” (CM19/00120), both from the Instituto de Salud Carlos III, Spanish Ministry of Science and InnovationS