Effects of petroleum hydrocarbons to tropical and temperate fish species : a toxicity and multibiomarker approach for the assessment of environmental contamination

Orientador : Dr. Antonio OstrenskyCoorientadora : Dr. Luciana Rodrigues de Souza-BastosTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Zootecnia. Defesa : 29/03/2018Inclui referênciasResumo: Plantas industriais para o refino do petróleo são normalmente instaladas à uma distância considerável do local de extração do produto bruto. Assim, os derramamentos acidentais durante o transporte, como os ocorridos nos oleodutos OSPAR e OLAPA no estado do Paraná, sul do Brasil, em 2000 e 2001, respectivamente, continuam sendo uma importante ameaça ambiental. O vazamento contínuo de tanques de armazenamento e a descarga de resíduos industriais, municipais e domésticos também são considerados fontes de contaminação do ambiente aquático por petróleo e produtos derivados. A toxicidade desses produtos é geralmente atribuída à presença de hidrocarbonetos monoaromáticos (BTEX) e policíclico aromáticos (HPA). O impacto biológico da exposição ao BTEX e HPA já foi relatado. Quando essas mudanças biológicas podem ser mensuradas, elas são denominadas de biomarcadores. Entre os biomarcadores reconhecidos, utilizados para a avaliação da contaminação ambiental em peixes, podemos destacar as enzimas de biotransformação (fase I e II), estresse oxidativo, parâmetros genotóxicos, hematológicos, endócrinos, reprodutivos, fisiológicos, histológicos e morfológicos. Além disso, outras substâncias químicas podem alterar a respostas de biomarcadores, tais como alterações naturais nas características físicas e químicas em ambientes aquáticos tropicais. Apesar dessas evidências, nenhum estudo avaliou a associação entre variações abióticas, especialmente temperatura e pH, e a contaminação de hidrocarbonetos de petróleo. O objetivo desta tese foi estabelecer diferenças na toxicidade entre diferentes produtos derivados de petróleo e identificar possíveis alterações em biomarcadores induzidas por parâmetros fisicoquímicos da água durante a exposição à hidrocarbonetos de petróleo. Nossos resultados com A. altiparanae, uma espécie nativa da Bacia do rio Paraná (bacia que se estende do sul do Brasil ao norte da Argentina e Paraguai), demonstraram que a gasolina é o composto mais tóxico em comparação aos outros produtos testados. Também avaliamos a potencial influência dos parâmetros abióticos da água (temperatura e pH), em associação com a exposição à fração solúvel em água da gasolina (WSFG), sobre biomarcadores de biotransformação (EROD e GST), estresse oxidativo (CAT e proteína carbonilada) e neurotóxicos (AChE) e respostas fisiológicas em A. altiparanae. Nossos resultados demostraram e influenciaram a temperatura e do pH em todos os biomarcadores testados. Em condições "normais" (25 ° C e pH 7), a WSFG promoveu uma alteração das respostas de metabolização energética e hematológicas, devido a uma possível condição hipóxia metabólica. Quando a temperatura e o pH da água foram alterados, um conjunto secundário de mecanismos fisiológicos foi ativado para lidar com distúrbios osmorregulatórios e ácido-base induzidos. No caso da exposição à WSFG, A. altiparanae foi capaz de manter a integridade das membranas celulares, indicando que os mecanismos reguladores mantiveram a homeostase. Usando a espécie Carassius auratus, identificamos as alterações da absorção de ureia e Mg+2 de absorção de O2 (MO2) resultantes da exposição aguda à WSFG. Assim, os resultados obtidos neste trabalho fornecem uma importante base referente à toxicidade de diferentes produtos derivados de petróleo, bem como a possível influência das características abióticas da água na resposta de biomarcadores utilizados na avaliação da poluição por hidrocarbonetos de x petróleo e os possíveis mecanismos fisiológicos que são prejudicados agudamente. Palavras-chave: Astyanax altiparanae, Carassius auratus, Fração solúvel em água, Poluição ambientalAbstract: ABSTRACT Refinery plants can be located far away from the extraction sites. Hence, accidental spills during transportation, such as those occurred from the OSPAR and OLAPA pipelines at Paraná state, South Brazil, in 2000 and 2001, respectively, remain as an important environment threat. Non-stop leakage from commercial gas station storage tanks and the discharge of industrial, municipal and domestic waste are, also, considered sources of petroleum and refined products that could reach aquatic environments. The effects of contamination on aquatic ecosystems are normally linked with their chemical characteristics, as toxicity is usually attributed to the presence of monoaromatic (BTEX) and the polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH). The biological impact of BTEX and PAH exposure has been reported over the years. When these biological changes can be analytically measured they are called biomarkers. Among all the well-known biomarkers used for the assessment of environmental contamination in fish, we can highlight the biotransformation enzymes (phase I and II), oxidative stress, genotoxic, haematological, endocrine, reproductive, physiological, histological and morphological parameters. Additionally, other parameters, only than BTEX and PAH, may alter biological responses/biomarkers, such as natural changes in physical and chemical characteristics in tropical aquatic environments. Despite those evidences, no study evaluated the association between abiotic variations, especially temperature and pH, and petroleum hydrocarbon contamination. The main goal of this thesis was to stablish the differences among petroleum and refined products toxicity and to identify possible biomarkers alterations induced by water physicochemical parameters during petroleum hydrocarbons exposure. Our results with Astyanax altiparanae, a tropical native fish species from the Paraná river Basis (massive watershed spread throughout South Brazil, North Argentina and Paraguay), demonstrated that gasoline presented the highest toxicity when compared to petroleum and other refined products. We also assessed the potential influence of water temperature and pH, in association with gasoline water-soluble fraction (WSFG) exposure, to biotransformation (EROD and GST), oxidative stress (CAT and carbonyl protein) and neurotoxic biomarkers (AChE) and physiological responses (osmoregulation, acid-base, haematological and energetic metabolism) in A. altiparanae. Our results showed the influence of temperature and pH in all tested biomarkers. In "normal" (25 °C and pH 7.0) condition, WSFG promoted an alteration in energetic metabolization, hematopoietic mechanism, due to a possible metabolic hypoxic condition. When water temperature and pH were changed, a secondary set of physiological mechanism were activated to cope with osmoregulatory and acid-base disorders, induced. In in normal or altered temperature or pH conditions, during WSFG exposure, A. altiparanae sustain the integrity of cellular membranes, indicating that the trigged regulatory mechanisms were able to maintain general homeostasis. Using the temperate species Carassius auratus we identify alterations of urea and Mg+2 excretion rate and O2 uptake (MO2) resulting from WSFG acute exposure. Thus, the results obtained in this work provides an important baseline for the toxicity of different refined petroleum products , as well the possible influence of water abiotic characteristics in the response of stablished biomarkers used for the assessment of petroleum hydrocarbon pollution and the possible physiological mechanisms that are acute impaired. xii Keywords: Astyanax altiparanae, Carassius auratus, Environmental pollution, Water-soluble fractio

Toxicidade do óleo diesel para o peixe Astyanax Altiparanae

Resumo: A intensificação das atividades humanas, tanto urbanas quanto industriais, vem ocasionando o aumento dos aportes dos mais diferentes tipos de contaminantes químicos nos ambientes aquáticos continentais. Nesse contexto, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), constituintes do etróleo que apresentam maior potencial tóxico, e os hidrocarbonetos voláteis (BTEX) são exemplos de substâncias que podem afetar os corpos de água, prejudicando o funcionamento desses ecossistemas e comprometendo os serviços ambientais associados. O estado do Paraná, localizado na região Sul do Brasil, apresenta histórico de acidentes envolvendo derramamentos de óleo combustível que atingiram ambientes aquáticos. Apesar disso, pouco se sabe sobre os efeitos tóxicos desses compostos sobre a ictiofauna nativa. Por esse motivo, o objetivo do presente trabalho foi realizar uma revisão bibliográfica (capítulo 1) sobre os efeitos do petróleo e seus subprodutos em peixes e avaliar a resposta toxicológica e histopatológica de uma espécie de peixe endêmica da região (Astyanax altiparanae) exposta, em laboratório, ao óleo diesel, a fração solúvel em água do óleo diesel (FSD) (capítulo 2 e 3) e a amônia (capítulo 4). Na revisão, foram abordados vários fatores que interferem na toxicidade do petróleo e seus derivados no ambiente aquático e porque as ferramentas histopatológicas vêm ganhando espaço em uma área que possui grande variedade de biomarcadores que podem demonstrar os efeitos de contaminantes ambientais. Nos capítulos 2 e 3 foi demostrado que apesar da grande resistência dos exemplares de A. altiparanae frente às altas concentrações do óleo diesel e da FSD, os resultados sugerem uma maior toxicidade do óleo diesel. Além disso, o índice de Impacto nas Brânquias (IIBr) calculado para cada alteração histopatológica revelou que na exposição aguda houve uma relação direta entre a concentração de diesel e FSD e a indução de necrose, descamação do epitélio e hipertrofia celular. Para as demais alterações, o IIBr não apresentou qualquer relação com as concentrações do diesel e da FSD a que os peixes foram expostos. Após a exposição subcrônica o IIBr calculado para as diferentes alterações não apresentou uma relação dose/efeito com as concentrações de diesel e FSD. Frente ao teste de sensibilidade à amônia, a espécie A. altiparanae apresentou-se muito sensível ao composto. Entretanto, embora várias alterações histopatológicas tenham sido identificadas, o IIBr calculado para cada alteração demostrou que apenas o descolamento epitelial apresentou uma relação direta com as concentrações de amônia testadas. O IIBr total calculado para cada concentração não apresentou qualquer relação com o aumento das concentrações de amônia. Os resultados obtidos no presente trabalho evidenciam que apesar dos efeitos tóxicos causados pelo óleo diesel, FSD e pela amônia, à espécie A. altiparanae as alterações histopatológicas avaliadas pelo IIBr não apresentaram-se como um indicador satisfatório de exposição a contaminantes ambientais

Metabolic fuel use after feeding in the zebrafish (Danio rerio): A respirometric analysis

We used respirometric theory and a new respirometry apparatus to assess, for the first time, the sequential oxidation of the major metabolic fuels during the post-prandial period (10 h) in adult zebrafish fed with commercial pellets (51% protein, 2.12% ration). Compared with a fasted group, fed fish presented peak increases of oxygen consumption (78%), and carbon dioxide (80%) and nitrogen excretion rates (338%) at 7-8 h, and rates remained elevated at 10 h. The respiratory quotient increased slightly (0.89 to 0.97) whereas the nitrogen quotient increased greatly (0.072 to 0.140), representing peak amino acid/protein usage (52%) at this time. After 48-h fasting, endogenous carbohydrate and lipid were the major fuels, but in the first few hours after feeding, carbohydrate oxidation increased greatly, fueling the first part of the post-prandial specific dynamic action, whereas increased protein/amino acid usage predominated from 6 h onwards. Excess dietary protein/amino acids were preferentially metabolized for energy production. © 2019. Published by The Company of Biologists Lt

Monitoring fish communities through environmental DNA metabarcoding in the fish pass system of the second largest hydropower plant in the world

The Itaipu Hydroelectric Power Plant is the second largest in the world in power generation. The artificial barrier created by its dam imposes an obstacle for fish migration. Thus, in 2002, a fish pass system, named Piracema Channel, was built to allow fish to access areas upstream of the reservoir. We tested the potential of environmental DNA metabarcoding to monitor the impact of both the dam and associated fish pass system in the Paraná River fish communities and to compare it with traditional monitoring methods. Using a fragment of the 12S gene, we characterized richness and community composition based on amplicon sequence variants, operational taxonomic units, and zero-radius OTUs. We combined GenBank and in-house data for taxonomic assignment. We found that different bioinformatics approaches showed similar results. Also, we found a decrease in fish diversity from 2019 to 2020 probably due to the recent extreme drought experienced in southeastern Brazil. The highest alpha diversity was recorded in the mouth of the fish pass system, located in a protected valley with the highest environmental heterogeneity. Despite the clear indication that the reference databases need to be continuously improved, our results demonstrate the analytical efficiency of the metabarcoding to monitor fish species

Toxicidade do óleo diesel para o peixe Astyanax Altiparanae

Resumo: A intensificação das atividades humanas, tanto urbanas quanto industriais, vem ocasionando o aumento dos aportes dos mais diferentes tipos de contaminantes químicos nos ambientes aquáticos continentais. Nesse contexto, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs), constituintes do etróleo que apresentam maior potencial tóxico, e os hidrocarbonetos voláteis (BTEX) são exemplos de substâncias que podem afetar os corpos de água, prejudicando o funcionamento desses ecossistemas e comprometendo os serviços ambientais associados. O estado do Paraná, localizado na região Sul do Brasil, apresenta histórico de acidentes envolvendo derramamentos de óleo combustível que atingiram ambientes aquáticos. Apesar disso, pouco se sabe sobre os efeitos tóxicos desses compostos sobre a ictiofauna nativa. Por esse motivo, o objetivo do presente trabalho foi realizar uma revisão bibliográfica (capítulo 1) sobre os efeitos do petróleo e seus subprodutos em peixes e avaliar a resposta toxicológica e histopatológica de uma espécie de peixe endêmica da região (Astyanax altiparanae) exposta, em laboratório, ao óleo diesel, a fração solúvel em água do óleo diesel (FSD) (capítulo 2 e 3) e a amônia (capítulo 4). Na revisão, foram abordados vários fatores que interferem na toxicidade do petróleo e seus derivados no ambiente aquático e porque as ferramentas histopatológicas vêm ganhando espaço em uma área que possui grande variedade de biomarcadores que podem demonstrar os efeitos de contaminantes ambientais. Nos capítulos 2 e 3 foi demostrado que apesar da grande resistência dos exemplares de A. altiparanae frente às altas concentrações do óleo diesel e da FSD, os resultados sugerem uma maior toxicidade do óleo diesel. Além disso, o índice de Impacto nas Brânquias (IIBr) calculado para cada alteração histopatológica revelou que na exposição aguda houve uma relação direta entre a concentração de diesel e FSD e a indução de necrose, descamação do epitélio e hipertrofia celular. Para as demais alterações, o IIBr não apresentou qualquer relação com as concentrações do diesel e da FSD a que os peixes foram expostos. Após a exposição subcrônica o IIBr calculado para as diferentes alterações não apresentou uma relação dose/efeito com as concentrações de diesel e FSD. Frente ao teste de sensibilidade à amônia, a espécie A. altiparanae apresentou-se muito sensível ao composto. Entretanto, embora várias alterações histopatológicas tenham sido identificadas, o IIBr calculado para cada alteração demostrou que apenas o descolamento epitelial apresentou uma relação direta com as concentrações de amônia testadas. O IIBr total calculado para cada concentração não apresentou qualquer relação com o aumento das concentrações de amônia. Os resultados obtidos no presente trabalho evidenciam que apesar dos efeitos tóxicos causados pelo óleo diesel, FSD e pela amônia, à espécie A. altiparanae as alterações histopatológicas avaliadas pelo IIBr não apresentaram-se como um indicador satisfatório de exposição a contaminantes ambientais

Effects of petroleum hydrocarbons to tropical and temperate fish species : a toxicity and multibiomarker approach for the assessment of environmental contamination

Orientador : Dr. Antonio OstrenskyCoorientadora : Dr. Luciana Rodrigues de Souza-BastosTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Zootecnia. Defesa : 29/03/2018Inclui referênciasResumo: Plantas industriais para o refino do petróleo são normalmente instaladas à uma distância considerável do local de extração do produto bruto. Assim, os derramamentos acidentais durante o transporte, como os ocorridos nos oleodutos OSPAR e OLAPA no estado do Paraná, sul do Brasil, em 2000 e 2001, respectivamente, continuam sendo uma importante ameaça ambiental. O vazamento contínuo de tanques de armazenamento e a descarga de resíduos industriais, municipais e domésticos também são considerados fontes de contaminação do ambiente aquático por petróleo e produtos derivados. A toxicidade desses produtos é geralmente atribuída à presença de hidrocarbonetos monoaromáticos (BTEX) e policíclico aromáticos (HPA). O impacto biológico da exposição ao BTEX e HPA já foi relatado. Quando essas mudanças biológicas podem ser mensuradas, elas são denominadas de biomarcadores. Entre os biomarcadores reconhecidos, utilizados para a avaliação da contaminação ambiental em peixes, podemos destacar as enzimas de biotransformação (fase I e II), estresse oxidativo, parâmetros genotóxicos, hematológicos, endócrinos, reprodutivos, fisiológicos, histológicos e morfológicos. Além disso, outras substâncias químicas podem alterar a respostas de biomarcadores, tais como alterações naturais nas características físicas e químicas em ambientes aquáticos tropicais. Apesar dessas evidências, nenhum estudo avaliou a associação entre variações abióticas, especialmente temperatura e pH, e a contaminação de hidrocarbonetos de petróleo. O objetivo desta tese foi estabelecer diferenças na toxicidade entre diferentes produtos derivados de petróleo e identificar possíveis alterações em biomarcadores induzidas por parâmetros fisicoquímicos da água durante a exposição à hidrocarbonetos de petróleo. Nossos resultados com A. altiparanae, uma espécie nativa da Bacia do rio Paraná (bacia que se estende do sul do Brasil ao norte da Argentina e Paraguai), demonstraram que a gasolina é o composto mais tóxico em comparação aos outros produtos testados. Também avaliamos a potencial influência dos parâmetros abióticos da água (temperatura e pH), em associação com a exposição à fração solúvel em água da gasolina (WSFG), sobre biomarcadores de biotransformação (EROD e GST), estresse oxidativo (CAT e proteína carbonilada) e neurotóxicos (AChE) e respostas fisiológicas em A. altiparanae. Nossos resultados demostraram e influenciaram a temperatura e do pH em todos os biomarcadores testados. Em condições "normais" (25 ° C e pH 7), a WSFG promoveu uma alteração das respostas de metabolização energética e hematológicas, devido a uma possível condição hipóxia metabólica. Quando a temperatura e o pH da água foram alterados, um conjunto secundário de mecanismos fisiológicos foi ativado para lidar com distúrbios osmorregulatórios e ácido-base induzidos. No caso da exposição à WSFG, A. altiparanae foi capaz de manter a integridade das membranas celulares, indicando que os mecanismos reguladores mantiveram a homeostase. Usando a espécie Carassius auratus, identificamos as alterações da absorção de ureia e Mg+2 de absorção de O2 (MO2) resultantes da exposição aguda à WSFG. Assim, os resultados obtidos neste trabalho fornecem uma importante base referente à toxicidade de diferentes produtos derivados de petróleo, bem como a possível influência das características abióticas da água na resposta de biomarcadores utilizados na avaliação da poluição por hidrocarbonetos de x petróleo e os possíveis mecanismos fisiológicos que são prejudicados agudamente. Palavras-chave: Astyanax altiparanae, Carassius auratus, Fração solúvel em água, Poluição ambientalAbstract: ABSTRACT Refinery plants can be located far away from the extraction sites. Hence, accidental spills during transportation, such as those occurred from the OSPAR and OLAPA pipelines at Paraná state, South Brazil, in 2000 and 2001, respectively, remain as an important environment threat. Non-stop leakage from commercial gas station storage tanks and the discharge of industrial, municipal and domestic waste are, also, considered sources of petroleum and refined products that could reach aquatic environments. The effects of contamination on aquatic ecosystems are normally linked with their chemical characteristics, as toxicity is usually attributed to the presence of monoaromatic (BTEX) and the polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH). The biological impact of BTEX and PAH exposure has been reported over the years. When these biological changes can be analytically measured they are called biomarkers. Among all the well-known biomarkers used for the assessment of environmental contamination in fish, we can highlight the biotransformation enzymes (phase I and II), oxidative stress, genotoxic, haematological, endocrine, reproductive, physiological, histological and morphological parameters. Additionally, other parameters, only than BTEX and PAH, may alter biological responses/biomarkers, such as natural changes in physical and chemical characteristics in tropical aquatic environments. Despite those evidences, no study evaluated the association between abiotic variations, especially temperature and pH, and petroleum hydrocarbon contamination. The main goal of this thesis was to stablish the differences among petroleum and refined products toxicity and to identify possible biomarkers alterations induced by water physicochemical parameters during petroleum hydrocarbons exposure. Our results with Astyanax altiparanae, a tropical native fish species from the Paraná river Basis (massive watershed spread throughout South Brazil, North Argentina and Paraguay), demonstrated that gasoline presented the highest toxicity when compared to petroleum and other refined products. We also assessed the potential influence of water temperature and pH, in association with gasoline water-soluble fraction (WSFG) exposure, to biotransformation (EROD and GST), oxidative stress (CAT and carbonyl protein) and neurotoxic biomarkers (AChE) and physiological responses (osmoregulation, acid-base, haematological and energetic metabolism) in A. altiparanae. Our results showed the influence of temperature and pH in all tested biomarkers. In "normal" (25 °C and pH 7.0) condition, WSFG promoted an alteration in energetic metabolization, hematopoietic mechanism, due to a possible metabolic hypoxic condition. When water temperature and pH were changed, a secondary set of physiological mechanism were activated to cope with osmoregulatory and acid-base disorders, induced. In in normal or altered temperature or pH conditions, during WSFG exposure, A. altiparanae sustain the integrity of cellular membranes, indicating that the trigged regulatory mechanisms were able to maintain general homeostasis. Using the temperate species Carassius auratus we identify alterations of urea and Mg+2 excretion rate and O2 uptake (MO2) resulting from WSFG acute exposure. Thus, the results obtained in this work provides an important baseline for the toxicity of different refined petroleum products , as well the possible influence of water abiotic characteristics in the response of stablished biomarkers used for the assessment of petroleum hydrocarbon pollution and the possible physiological mechanisms that are acute impaired. xii Keywords: Astyanax altiparanae, Carassius auratus, Environmental pollution, Water-soluble fractio

Potential of the Biotic Ligand Model (BLM) to Predict Copper Toxicity in the White-Water of the Solimões-Amazon River

In this study, we evaluated the capacity of the Biotic Ligand Model (BLM) to predict copper toxicity in white-waters of the Solimões-Amazon River. LC50 tests using the species Otocinclus vittatus (Regan, 1904) were performed with Solimões-Amazon river water (100%) at 20%, 40%, 60%, and 80% dilutions. A sevenfold decrease in both dissolved and total Cu toxicity was observed in the experiment conducted with 100% when compared to 20% white-water, indicating that physicochemical characteristics of white-water attenuate Cu toxicity. There was agreement between the observed LC50 and the LC50 predicted by the BLM after the adjustment of critical accumulation concentration (LA50) for O. vittatus. BLM modeling indicated that dissolved organic carbon (DOC) and pH were the most important water parameters influencing Cu toxicity, followed by Ca2+. Our results highlight the first evidence that the BLM presents potential to predict Cu toxicity to aquatic organisms in the white-water of the Solimões-Amazon River. © 2016, Springer Science+Business Media New York