Design of a lentiviral vector as a therapeutic strategy against alzheimer´s disease

Alzheimer’s disease (AD) is a chronic neurodegenerative disorder characterized by a progressive loss of cognitive functions. One of the hallmarks is the formation of amyloid plaques, composed mainly by Aß peptide oligomers (AβOs). Neprilysin (NEP) is the most important endopeptidase and crucial for the degradation of Aß in the brain, avoiding amyloid plaques formation. Because NEP is decreased in brains of patients with AD, we aim to develop a lentiviral vector (LV) capable of specifically expressing in hippocampal neurons, to study its role in AD and therefore its possible therapeutic function.First, a construct containing the complete cDNA of NEP downstream of the hippocampal-specific promoter human synapsin (SYN-1) was performed. NEP cDNA was obtained from pBOB-NEP plasmid and was cloned under the SYN-1 promoter to obtain SYN-NEP plasmid. SYN-NEP also contains the ubiquitous CMV promoter, located outside the sequence to be packaged in LV. The correct cloning was checked by BamHI/KpnI digestion followed by 1% agarose gel electrophoresis and was verified by sequencing. To test NEP expression under the CMV promoter, 293T cells were transfected with SYN-NEP. SYN-RFP plasmid expressing the reporter red fluorescent protein (RFP) and pBOB-NEP were used as transfection and positive controls, respectively. After 48 hours NEP expression was evaluated by western blot (WB) and RFP by fluorescence microscopy.Electrophoresis of SYN-NEP digestion resulted in two bands of 3392pb and 7644pb, which coincided with the molecular weights of the insert containing NEP and backbone, respectively. This in turn was validated by sequencing. Transfection efficiency calculated by expression of RFP was 80%. WB showed a 85kDa band only in those lanes corresponding to transfection with pBOB-NEP and SYN-NEP.In conclusion, NEP was successfully cloned downstream of SYN-1 promoter and is expressed correctly under a ubiquitous promoter. This construction is the first step for the production of LV.Fil: Abrey Recalde, Maria Jimena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica.- Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica; ArgentinaFil: Gonzalez Hermida, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica.- Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica; ArgentinaFil: Baez, Veronica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencias; ArgentinaFil: Jerusalinsky, Diana Alicia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencias; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Frecha, Cecilia Ariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica.- Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica; ArgentinaLXI Reunión anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clinica; LXVI, Reunión anual de la Sociedad Argentina de Inmunología; XLVIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Farmacología Experimental; VII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Nanomedicina y V Congreso Nacional de la Asociación Argentina de Ciencia y Tecnología de Animales de LaboratorioArgentinaSociedad Argentina de Investigación ClinicaSociedad Argentina de InmunologíaSociedad Argentina de Farmacología ExperimentalSociedad Argentina de NanomedicinaAsociación Argentina de ciencia y tecnología de animales de Laboratori

Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión

La proteína STUB1 fue recientemente caracterizada como una enzima de tipo E3 ligasa, capaz de promover la degradación del factor de transcripción FOXP3 de manera específica. Es ampliamente conocido que FOXP3 tiene un rol clave en la diferenciación de células T regulatorias y por lo tanto en procesos de inmunosupresión. Además, se ha visto que STUB1 está sobreexpresada en algunas células tumorales cuya función en ellas es aún desconocida. Nos planteamosinvestigar si la administración de STUB1 en células T podría tener un efecto en los niveles de inmunosupresión. Entre las herramientas de transferencia genética más adecuadas para la expresión de genes en células hematopoyéticas se encuentran los vectores lentivirales. El objetivo de este trabajo es diseñar un vector lentiviral de expresión de STUB1 humana. En primer lugar, se estudió la expresión de STUB1 en las líneas celulares tumorales HEK293T y HeLa. Por RT-PCR se comprobó la presencia de RNA mensajero de STUB1 en células derivadas de cáncer cérvico-uterino. A partir del diseño de primers específicos con sitios de enzimas de restricción se aisló el cDNA de STUB1 y se clonó en un plásmido lentiviral autoinactivable (SIN), río abajo del promotor ubicuo EF1alfa, seguido por una secuencia IRES y la secuencia del gen reportero GFP (LV-STUB1). Los plásmidos se amplificaron por transformación en bacterias E. Coli competentes (TOP10), seleccionándose los clones positivos por PCR colony. Posteriormente, se comprobó la presencia del inserto mediante corte con enzimas de restricción específicas y se confirmó la correcta secuencia y orientación del cDNA de STUB1 por secuenciación. Los vectores lentivirales se produjeron en células productoras HEK293T. Se realizó una cotransfección de tres plásmidos: plásmido empaquetador portando los genes gag-pol, plasmido que codifica para la envuelta del virus de la stomatitis vesicular (VSVG), y aquél con la secuencia de STUB1IRESGFP. Se optimizó el método de transfección utilizando el sistema PEI, en preferencia a otros sistemas testeados (CaCl2, Lipofectamina). Los vectores lentivirales fueron recolectados al día 2 de la transfección y preservados -80 grados para su posterior utilización en células target. Se testeó la eficiencia de transducción de las partículas lentivirales en células Jurkat E6-1. Los niveles de GFP se midieron por Citometría de Flujo, 72h post transducción. Los resultados obtenidos demuestran que el vector LV- STUB1 es capaz de transducir más del 35% de las células a una multiplicidad de infección de 0.5 vectores/célula (MOI: 0.5), sin afectar la viabilidad celular. Estos resultados sugieren que sería posible obtener una mayor expresión del transgén a MOIs más altas. Los próximos experimentos incluyen la validación funcional del transgén y la optimización delvector para su utilización en modelos de inmunosupresión.Fil: Salcedo, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica.- Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica; ArgentinaFil: Gonzalez, Hermida P.. Hospital Italiano; ArgentinaFil: Abrey Recalde, J.. Hospital Italiano; ArgentinaFil: Oliver, Javier. Hospital Italiano; ArgentinaFil: Frecha, Cecilia Ariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica.- Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica; ArgentinaXXXVIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de VirologíaCordobaArgentinaSociedad Argentina de Virologi

Epstein-Barr virus down-regulates tumor suppressor DOK1 expression

The DOK1 tumor suppressor gene encodes an adapter protein that acts as a negative regulator of several signaling pathways. We have previously reported that DOK1 expression is up-regulated upon cellular stress, via the transcription factor E2F1, and down-regulated in a variety of human malignancies due to aberrant hypermethylation of its promoter. Here we show that Epstein Barr virus (EBV) infection of primary human B-cells leads to the down-regulation of DOK1 gene expression via the viral oncoprotein LMP1. LMP1 alone induces recruitment to the DOK1 promoter of at least two independent inhibitory complexes, one containing E2F1/pRB/DNMT1 and another containing at least EZH2. These events result in tri-methylation of histone H3 at lysine 27 (H3K27me3) of the DOK1 promoter and gene expression silencing. We also present evidence that the presence of additional EBV proteins leads to further repression of DOK1 expression with an additional mechanism. Indeed, EBV infection of B-cells induces DNA methylation at the DOK1 promoter region including the E2F1 responsive elements that, in turn, lose the ability to interact with E2F complexes. Treatment of EBV-infected B-cell-lines with the methyl-transferase inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidine rescues DOK1 expression. In summary, our data show the deregulation of DOK1 gene expression by EBV and provide novel insights into the regulation of the DOK1 tumor suppressor in viral-related carcinogenesis.Fil: Siouda, Maha. World Health Organization; FranciaFil: Frecha, Cecilia Ariana. World Health Organization; Francia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Accardi, Rosita. World Health Organization; FranciaFil: Yue, Jiping. World Health Organization; FranciaFil: Cuenin, Cyrille. World Health Organization; FranciaFil: Grufat, Henri. Inserm; Francia. Université Claude Bernard Lyon 1; Francia. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Ecole Normale Supérieure; FranciaFil: Manet, Evelyne. Inserm; Francia. Université Claude Bernard Lyon 1; Francia. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Ecole Normale Supérieure; FranciaFil: Herceg, Zdenko. World Health Organization; FranciaFil: Sylla, Bakary S.. World Health Organization; FranciaFil: Tommasino, Massimo. World Health Organization; Franci

Viral derived “nanoblades” loaded with cas9/ sgrna ribonucleoproteins and aav6 for donor dna cassette delivery

Programmable nucleases have enabled rapid and accessible genome engineering in cells andliving organisms. However, their delivery into target cells can be challenging, specially intoprimary cells. Here, we have designed Nanoblades, a new technology to deliver a genomiccleaving agent into cells. These are murine leukemia virus-derived virus like particle (VLP),which are loaded with Cas9 protein through fusion with the gag viral structural protein, andwith guide RNAs. Cas9 together with gRNAs introduces site specifics double strand break(DSBs) in target gene which can be repaired by non-homologous end-joining (NHEJ) or byhomology-directed repair (HDR) introducing a new sequence from an exogenous templateDNA bearing homology to the sequences flanking the DSBs (donor-DNA).Previously, we demonstrated that Nanoblades were extremely efficient in delivery of theirCas9/sgRNA cargo into K562 human cell line and human T, B , HSCs and HSCs derivedprogenitors T cells (pro-T cells ), thanks to their surface co-pseudotyping with baboonretroviral and VSV-G envelopes.The objective of this work was to edit Wiscott Aldrich Syndrome (WAS) gene locus by HDRusing Nanoblades and AAV6 carrying a donor-DNA, which consists in GFP reporter geneflanking by homologous arms of the WAS gene.AAV6 were added to K562 cells at different times points with respect to Nanobladesaddition, in order to find optimal time that maximizes HDR. Different multiplicities ofinfection (MOI) of AAV were tested. HDR-mediated gene editing was determined by PCRand GFP expression by FACS, 7 days after Nanoblades addition.Our results shows that HDR-mediated edition of WAS gene occurred in a 50% of cells, whennanoblades and AAV6 (MOI 100000 vg/cell) were added at same time. We are currentlytesting this protocol of AAV6 and Nanoblades in HSCs and pro-T cells.In summary, Nanoblades in combination with AAV6 carrying donor-DNA are efficienttools for gene editing and have important prospects for basic and clinical translation forgene therapy.Fil: Abrey Recalde, Maria Jimena. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; ArgentinaFil: Gutierrez Guerrero, Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; ArgentinaFil: Mangeot, Phillipe. Inserm; FranciaFil: Costa, Caroline. Inserm; FranciaFil: Bernandin, Ornelie. Inserm; FranciaFil: Froment, Giselle. Inserm; FranciaFil: Molina, Francisco Martin. No especifíca;Fil: Karim, Bellabdelah. No especifíca;Fil: Frecha, Cecilia Ariana. Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas. Oficina de Coordinacion Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica. - Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional E Ingenieria Biomedica.; ArgentinaFil: Ricci, Emiliano. Inserm; FranciaFil: Cosset, Francose. Inserm; FranciaFil: Verhoeyen, Els. Inserm; FranciaLXIII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Investigación Clínica;LXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Inmunologia y Reunión anual de la Sociedad Argentina de FisiologíaMar del PlataArgentinaSociedad Argentina de Investigación ClínicaSociedad Argentina de InmunologiaSociedad Argentina de FisiologíaSociedad Argentina de VirologíaAsociación Argentina de Nanomedicin

Diseño de vectores lentivirales regulados fisiológicamente para terapia génica del síndrome de Wiskott-Aldrich

Incluye resumen y conclusiones en inglésTesis Univ. Granada. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Leída el 26 de junio de 200

Búsqueda de nuevas terapias para el mal de Alzheimer

Los trabajos que les contamos aquí, se desarrollan en el Laboratorio de Neuroplasticidad y Neurotoxinas (LaNyN), del Instituto de Biología Celular y Neurociencias “Profesor Eduardo De Robertis”, en la Facultad de Medicina de la Universidad de Buenos Aires. El Profesor Eduardo De Robertis fue quien trajo el primer microscopio electrónico al país. En el año 1956 ganó por concurso el cargo de Profesor Titular de la Primera Cátedra de Histología, y trabajó en el Instituto (entonces llamado de Anatomía y Embriología) adjunto a la Cátedra, desde donde dio un gran impulso al estudio de la biología de las células, especialmente de su estructura. Comenzó entonces las tratativas para que la UBA adquiriese un microscopio electrónico y, en 1959, fue instalado en dependencias de la Cátedra de Histología y del Instituto, en la Facultad de Medicina, dando lugar a una etapa de gran desarrollo de la Biología Celular en el país. Escribió el primer libro de Biología Celular, que fue utilizado por varias generaciones de estudiantes y profesionales de la Medicina y la Biología del mundo entrero, ya que fue traducido a más de nueve idiomas. Sus investigaciones tuvieron proyección internacional y gran reconocimiento. En particular, De Robertis estudió las células del Sistema Nervioso y descubrió y describió las “vesículas sinápticas” (ver más adelante). Este hallazgo fue central para el desarrollo de las Neurociencias modernas. El ahora Instituto de Biología Celular y Neurociencias (IBCN), así bautizado desde 1992, lleva su nombre en homenaje a quien fuera su Director y un gran Maestro. Fue mentor de muchos investigadores, algunos de los cuales siguen trabajando en el IBCN, entre ellos Diana Jerusalinsky (autora de este artículo), quien continúa trabajando en el IBCN y dirige el LaNyN, fundado en 1998, continuando la tarea del Maestro. En el LaNyN se investigan mecanismos biológicos del aprendizaje y la memoria en modelos animales, tanto en condiciones normales como patológicas. Hace ya más de 15 años el LaNyN inició una colaboración con Francia, que dio lugar a la creación del Laboratorio Internacional Asociado (LIA) DeVeNIR (2010): un laboratorio virtual entre los laboratorios participantes, cuyo objetivo es el desarrollo de vectores neurotrópicos para investigación en neurociencias. De Francia, participan la Dra. Anna Salvetti y el Dr. Alberto Epstein (Ecole Normal Superieure, Lyon). Recientemente se ha incorporado un grupo de la Universidad Federal de Rio de Janeiro (UFRJ, Rio de Janeiro, Brasil), dirigido por el Dr. Sergio Ferreira, especializado en fenómenos que ocurren tempranamente en enfermedades neurodegenerativas. El objetivo principal de esta cooperación es el desarrollo de “vectores” capaces de llevar genes de interés, para ser utilizados para la investigación científica o con finalidades terapéuticasFil: Jerusalinsky, Diana Alicia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Baez, Maria Veronica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Cercato, Magalí Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; ArgentinaFil: Frecha, Cecilia Ariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; Argentin

Cancer Genomic Resources and Present Needs in the Latin American Region

In Latin America (LA), cancer is the second leading cause of death, and little is known about the capacities and needs for the development of research in the field of cancer genomics. In order to evaluate the current capacity for and development of cancer genomics in LA, we collected the available information on genomics, including the number of next-generation sequencing (NGS) platforms, the number of cancer research institutions and research groups, publications in the last 10 years, educational programs, and related national cancer control policies. Currently, there are 221 NGS platforms and 118 research groups in LA developing cancer genomics projects. A total of 272 articles in the field of cancer genetics/genomics were published by authors affiliated to Latin American institutions. Educational programs in genomics are scarce, almost exclusive of graduate programs, and only few are concerning cancer. Only 14 countries have national cancer control plans, but all of them consider secondary prevention strategies for early diagnosis, opportune treatment, and decreasing mortality, where genomic analyses could be implemented. Despite recent advances in introducing knowledge about cancer genomics and its application to LA, the region lacks development of integrated genomic research projects, improved use of NGS platforms, implementation of associated educational programs, and health policies that could have an impact on cancer care.Fil: Torres, Ángela. Universidad El Bosque; ColombiaFil: Oliver, Javier. Hospital Italiano. Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental; ArgentinaFil: Frecha, Cecilia Ariana. Hospital Italiano. Instituto de Ciencias Básicas y Medicina Experimental; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Montealegre, Ana Lorena. Universidad El Bosque; ColombiaFil: Quezada Urbán, Rosalía. Universidad Nacional Autónoma de México; MéxicoFil: Díaz Velásquez, Clara Estela. Universidad Nacional Autónoma de México; MéxicoFil: Vaca Paniagua, Felipe. Universidad Nacional Autónoma de México; México. Instituto Nacional de Cancerología; MéxicoFil: Perdomo, Sandra. Universidad El Bosque; Colombia. Hospital Universitario Fundación Santa Fe; Colombi

Expression of the epidermodysplasia verruciformis-associated genes EVER1 and EVER2 is activated by exogenous DNA and inhibited by LMP1 oncoprotein from Epstein-Barr virus

EVER1 and EVER2 are mutated in epidermodysplasia verruciformis patients, who are susceptible to human betapapillomavirus (HPV) infection. It is unknown whether their products control the infection of other viruses. Here, we show that the expression of both genes in B cells is activated immediately after Epstein-Barr virus (EBV) infection, whereas at later stages, it is strongly repressed via activation of the NF-κB signaling pathway by latent membrane protein 1 (LMP1). Ectopic expression of EVER1 impairs the ability of EBV to infect B cells.Fil: Frecha, Cecilia Ariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Prof. Eduardo de Robertis". Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Biología Celular y Neurociencia; Argentina. International Agency For Research On Cancer; FranciaFil: Chevalier, Sébastien A.. International Agency For Research On Cancer; FranciaFil: van Uden, Patrick. International Agency For Research On Cancer; FranciaFil: Rubio, Ivonne. International Agency For Research On Cancer; FranciaFil: Siouda, Maha. International Agency For Research On Cancer; FranciaFil: Saidj, Djamel. International Agency For Research On Cancer; FranciaFil: Cohen, Camille. Université Claude Bernard Lyon 1; Francia. Centre National de la Recherche Scientifique; FranciaFil: Lomonte, Patrick. Centre National de la Recherche Scientifique; Francia. Université Claude Bernard Lyon 1; FranciaFil: Accardi, Rosita. International Agency For Research On Cancer; FranciaFil: Tommasino, Massimo. International Agency For Research On Cancer; Franci