The Proteomics of N-terminal Methionine Cleavage

Methionine aminopeptidase (MAP) is a ubiquitous, essential enzyme involved in protein N-terminal methionine excision. According to the generally accepted cleavage rules for MAP, this enzyme cleaves all proteins with small side chains on the residue in the second position (P1′), but many exceptions are known. The substrate specificity of Escherichia coli MAP1 was studied in vitro with a large (\u3e120) coherent array of peptides mimicking the natural substrates and kinetically analyzed in detail. Peptides with Val or Thr at P1′ were much less efficiently cleaved than those with Ala, Cys, Gly, Pro, or Ser in this position. Certain residues at P2′, P3′, and P4′ strongly slowed the reaction, and some proteins with Val and Thr at P1′ could not undergo Met cleavage. These in vitro data were fully consistent with data for 862 E. coli proteins with known N-terminal sequences in vivo. The specificity sites were found to be identical to those for the other type of MAPs, MAP2s, and a dedicated prediction tool for Met cleavage is now available. Taking into account the rules of MAP cleavage and leader peptide removal, the N termini of all proteins were predicted from the annotated genome and compared with data obtained in vivo. This analysis showed that proteins displaying N-Met cleavage are overrepresented in vivo. We conclude that protein secretion involving leader peptide cleavage is more frequent than generally thought

Multiple pathways of toxicity induced by C9orf72 dipeptide repeat aggregates and G4C2 RNA in a cellular model

The most frequent genetic cause of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia is a G4C2 repeat expansion in the C9orf72 gene. This expansion gives rise to translation of aggregating dipeptide repeat (DPR) proteins, including poly-GA as the most abundant species. However, gain of toxic function effects have been attributed to either the DPRs or the pathological G4C2 RNA. Here, we analyzed in a cellular model the relative toxicity of DPRs and RNA. Cytoplasmic poly-GA aggregates, generated in the absence of G4C2 RNA, interfered with nucleocytoplasmic protein transport, but had little effect on cell viability. In contrast, nuclear poly-GA was more toxic, impairing nucleolar protein quality control and protein biosynthesis. Production of the G4C2 RNA strongly reduced viability independent of DPR translation and caused pronounced inhibition of nuclear mRNA export and protein biogenesis. Thus, while the toxic effects of G4C2 RNA predominate in the cellular model used, DPRs exert additive effects that may contribute to pathology

Gel-like inclusions of C-terminal fragments of TDP-43 sequester stalled proteasomes in neurons

International audienceAggregation of the multifunctional RNA-binding protein TDP-43 defines large subgroups of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia and correlates with neurodegeneration in both diseases. In disease, characteristic C-terminal fragments of ~25 kDa ("TDP-25") accumulate in cytoplasmic inclusions. Here, we analyze gain-of-function mechanisms of TDP-25 combining cryo-electron tomography, proteomics, and functional assays. In neurons, cytoplasmic TDP-25 inclusions are amorphous, and photobleaching experiments reveal gel-like biophysical properties that are less dynamic than nuclear TDP-43. Compared with full-length TDP-43, the TDP-25 interactome is depleted of low-complexity domain proteins. TDP-25 inclusions are enriched in 26S proteasomes adopting exclusively substrate-processing conformations, suggesting that inclusions sequester proteasomes, which are largely stalled and no longer undergo the cyclic conformational changes required for proteolytic activity. Reporter assays confirm that TDP-25 impairs proteostasis, and this inhibitory function is enhanced by ALScausing TDP-43 mutations. These findings support a pathophysiological relevance of proteasome dysfunction in ALS/FTD

Integrative analysis of the N-terminal methionine excision role in cytoplasm of higher eukaryotes

Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N-terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l’état stationnaire ne présentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d’une maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l’Excision de la Méthionine N-terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidus émergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont les METhionine AminoPeptidases (METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles de délétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd’hui un nombre croissant d’études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les bases moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analyses protéomiques et métabolomiques, j’ai pu étudier les événements moléculaires précoces associés à l’inhibition de la NME cytoplasmique. J’ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j’ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisation fréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradation rapide. Ainsi, l’activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et les lignées de cellules humaines suggèrent l’existence d’un mécanisme ubiquitaire associé à la NME.The first amino acid incorporated in nascent polypeptide chain is always methionine so called N-terminale methionine. However, in a given proteome, more than fifty percent of proteins have not this first methionine. Indeed, the early proteolytic event affecting a majority of proteins is N-terminal Methionine Excision (NME) as soon as few residues exit from the ribosome. Enzymes ensuring NME process are conserved along species. This mechanism takes place in all compartments where protein synthesis occurs including cytoplasm, plastids and mitochondria and the enzymes responsible of N-methionine excision are METhionine AminoPeptidases (METAP). Early functional studies of gene deletion has quickly showed that NME is an essential process. Ten years ago, METAPs have been identified as the molecular target of natural compounds with anticancer activities. Now, a growing number of studies suggest that NME is a promising target for treatment of various deseases. Nevertheless, molecular mechanisms making NME an essential process is poorly understood in particular in higher eukaryote cytoplasms.Using a dedicated inducible system in the model organism Arabidopsis thaliana and multiple approaches, including proteomics and metabolomics, I examined the earliest molecular events associated with the inhibition of this process and the contribution of both METAP to NME process. In this context, I demonstrated that cytoplasmic NME in A. thaliana orchestrates a cross-talk between two fundamental signaling pathways frequently deregulated in pathological conditions: thiol status and proteolysis. In these studies, we demonstrated that developmental defects induced by cytoplasmic NME inhibition are associated with an increase of the proteolytic activity due to an increase of the proteins available for rapid degradation. Thus, NME activity that modifies the availability of several proteins for degradation is an integral and fundamental element protein turnover regulation. Finally my preliminary results obtained in Archea, Fungi and human cells seem to suggest the existence of a ubiquitous mechanism associated with NME process

Analyse intégrative du rôle de l’excision de la méthionine N-terminale dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs

The first amino acid incorporated in nascent polypeptide chain is always methionine so called N-terminale methionine. However, in a given proteome, more than fifty percent of proteins have not this first methionine. Indeed, the early proteolytic event affecting a majority of proteins is N-terminal Methionine Excision (NME) as soon as few residues exit from the ribosome. Enzymes ensuring NME process are conserved along species. This mechanism takes place in all compartments where protein synthesis occurs including cytoplasm, plastids and mitochondria and the enzymes responsible of N-methionine excision are METhionine AminoPeptidases (METAP). Early functional studies of gene deletion has quickly showed that NME is an essential process. Ten years ago, METAPs have been identified as the molecular target of natural compounds with anticancer activities. Now, a growing number of studies suggest that NME is a promising target for treatment of various deseases. Nevertheless, molecular mechanisms making NME an essential process is poorly understood in particular in higher eukaryote cytoplasms.Using a dedicated inducible system in the model organism Arabidopsis thaliana and multiple approaches, including proteomics and metabolomics, I examined the earliest molecular events associated with the inhibition of this process and the contribution of both METAP to NME process. In this context, I demonstrated that cytoplasmic NME in A. thaliana orchestrates a cross-talk between two fundamental signaling pathways frequently deregulated in pathological conditions: thiol status and proteolysis. In these studies, we demonstrated that developmental defects induced by cytoplasmic NME inhibition are associated with an increase of the proteolytic activity due to an increase of the proteins available for rapid degradation. Thus, NME activity that modifies the availability of several proteins for degradation is an integral and fundamental element protein turnover regulation. Finally my preliminary results obtained in Archea, Fungi and human cells seem to suggest the existence of a ubiquitous mechanism associated with NME process.Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N-terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l’état stationnaire ne présentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d’une maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l’Excision de la Méthionine N-terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidus émergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont les METhionine AminoPeptidases (METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles de délétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd’hui un nombre croissant d’études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les bases moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analyses protéomiques et métabolomiques, j’ai pu étudier les événements moléculaires précoces associés à l’inhibition de la NME cytoplasmique. J’ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j’ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisation fréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradation rapide. Ainsi, l’activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et les lignées de cellules humaines suggèrent l’existence d’un mécanisme ubiquitaire associé à la NME

Analyse intégrative du rôle de l'excision de la méthionine N-terminale dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs

Le premier acide aminé incorporé dans une chaîne polypeptidique naissante est toujours la méthionine. On identifie donc toujours ce premier résidu à la méthionine N-terminale. Cependant, les deux tiers des protéines accumulées à l état stationnaire ne présentent plus leur méthionine initiatrice. Cet enlèvement résulte essentiellement d une maturation protéolytique affectant chaque protéine. Ainsi, l Excision de la Méthionine N-terminale (NME) concerne la majorité des protéines et ce dès que les premiers résidus émergent du ribosome. Ce mécanisme est retrouvé dans tous les compartiments cellulaires où une synthèse protéique a lieu : le cytoplasme, les plastes et les mitochondries. Les enzymes responsables du clivage de la méthionine initiatrice sont les METhionine AminoPeptidases (METAPs) ; les METAPs sont conservées dans le Règne vivant. Des études fonctionnelles de délétions géniques ont montré le caractère létal du maintien de la première méthionine dans tous les organismes. Il y a plus de dix ans, les METAPs ont été identifiées comme étant la cible de composés naturels ayant des effets anticellulaires. Aujourd hui un nombre croissant d études rapportent que la NME est une cible prometteuse pour le traitement de nombreuses pathologies. Néanmoins, les bases moléculaires qui expliquent le caractère essentiel de la NME restent très peu comprises, en particulier dans le cytoplasme des eucaryotes supérieurs. Grâce à un système inductible permettant de moduler finement la NME cytoplasmique dans la plante modèle Arabidopsis thaliana et différentes approches incluant des analyses protéomiques et métabolomiques, j ai pu étudier les événements moléculaires précoces associés à l inhibition de la NME cytoplasmique. J ai également caractérisé la contribution relative des deux types de METAP cytoplasmiques au processus. Dans ce contexte, j ai pu démontrer chez A. thaliana que la NME cytoplasmique agit sur deux voies de signalisation fréquemment dérégulées lors de conditions pathologiques : le statut des composés thiolés et la protéolyse. La diminution de la NME cytoplasmique induit une protéolyse accrue principalement via une augmentation du nombre de protéines destinées à une dégradation rapide. Ainsi, l activité de la NME, en modulant la sensibilité de nombreuses protéines à subir la protéolyse, est un élément fondamental de la régulation de la demi-vie protéique. Finalement, mes résultats simialires obtenus également chez les Archées, levures et les lignées de cellules humaines suggèrent l existence d un mécanisme ubiquitaire associé à la NME.The first amino acid incorporated in nascent polypeptide chain is always methionine so called N-terminale methionine. However, in a given proteome, more than fifty percent of proteins have not this first methionine. Indeed, the early proteolytic event affecting a majority of proteins is N-terminal Methionine Excision (NME) as soon as few residues exit from the ribosome. Enzymes ensuring NME process are conserved along species. This mechanism takes place in all compartments where protein synthesis occurs including cytoplasm, plastids and mitochondria and the enzymes responsible of N-methionine excision are METhionine AminoPeptidases (METAP). Early functional studies of gene deletion has quickly showed that NME is an essential process. Ten years ago, METAPs have been identified as the molecular target of natural compounds with anticancer activities. Now, a growing number of studies suggest that NME is a promising target for treatment of various deseases. Nevertheless, molecular mechanisms making NME an essential process is poorly understood in particular in higher eukaryote cytoplasms.Using a dedicated inducible system in the model organism Arabidopsis thaliana and multiple approaches, including proteomics and metabolomics, I examined the earliest molecular events associated with the inhibition of this process and the contribution of both METAP to NME process. In this context, I demonstrated that cytoplasmic NME in A. thaliana orchestrates a cross-talk between two fundamental signaling pathways frequently deregulated in pathological conditions: thiol status and proteolysis. In these studies, we demonstrated that developmental defects induced by cytoplasmic NME inhibition are associated with an increase of the proteolytic activity due to an increase of the proteins available for rapid degradation. Thus, NME activity that modifies the availability of several proteins for degradation is an integral and fundamental element protein turnover regulation. Finally my preliminary results obtained in Archea, Fungi and human cells seem to suggest the existence of a ubiquitous mechanism associated with NME process.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Biochemical and structural analysis of N-myristoyltransferase mediated protein tagging

International audienceN-terminal myristoylation is an essential eukaryotic modification crucial for cellular homeostasis in the context of many physiological processes. Myristoylation is a lipid modification resulting in a C14 saturated fatty acid addition. This modification is challenging to capture due to its hydrophobicity, low abundance of target substrates, and the recent discovery of unexpected NMT reactivity including myristoylation of lysine side chains and N-acetylation in addition to classical N-terminal Gly-myristoylation. This chapter details the high-end approaches developed to characterize the different features of N-myristoylation and its targets through in vitro and in vivo labeling

N-terminal acetylation status of nuclear proteins upon proteotoxic stress

International audienceN-(α)-terminal protein acetylation (NTA) is a widespread and essential protein modification. The reaction is catalyzed by various N-acetyltransferases (Nats) composed of a catalytic subunit alone or in complex with one or several factors. Their substrate specificities are largely determined by the first two N-terminal amino acids of the substrate protein. NTA is considered as an irreversible mark and mostly occurs co-translationally. A multiplicity of NTA roles have been uncovered such as its involvement in influencing protein's half-life. However, the majority of the proteome undergoes NTA with a high stoichiometry suggesting that NTA fulfils a broader and collective function, yet to be discovered. In this context, it has been suggested that NTA participates in maintaining protein homeostasis or proteostasis. The nucleus is rich in metastable and stress sensitive proteins suggesting that specific protein quality control strategies are in place to maintain nuclear proteostasis. Indee