Interaction between Salmonella and Plants: Potential Hosts and Vectors for Human Infection

Fruits and vegetables are important for a healthy diet. However, when eaten raw and contaminated with human pathogens (HPs) they may cause a disease outbreak. Contamination with HPs can occur along the entire farm-to-fork production chain and Salmonella enterica is one of the most common foodborne pathogens. A range of biotic and abiotic environmental factors can influence the complex interactions between Salmonella and plants. Moreover, the outcome of experiments largely depends on the experimental design and parameters or methods employed, and on top, on the accompanying plant microbiome and the genetic equipment of the plant and the Salmonella strain. Particularly mobile genetic elements contribute to the diversification and adaptation of Salmonella to the plant environment. So far, little is known about the key processes and factors influencing the attachment and potential internalization of Salmonella in plants and the plant specific responses. It is therefore important to better understand the ecology of Salmonella in the soil and plant environment, in order to propose practicable recommendations for prevention of foodborne diseases. This also requires improved sensitivity and specificity of detection methods. In this chapter, we present the current knowledge, research needs, and methodology regarding the complex interactions between Salmonella and plants

Human pathogenic bacteria on plants

Obst und Gemüse wirken sich positiv auf die Gesundheit aus. Dazu tragen auch die mit Pflanzen assoziierten Mikro­organismen bei. Allerdings kann Obst oder Gemüse, wenn es mit humanpathogenen Keimen kontaminiert ist und roh verzehrt wird, auch Lebensmittelvergiftungen verursachen. In diesem Übersichtsartikel zeigen wir anhand einer Literaturstudie, wie humanpathogene Stämme von Escherichia coli oder Salmonella enterica auf Obst und Gemüse gelangen können und dass ein kom­plexes Zusammenspiel verschiedener biotischer und abiotischer Faktoren ihr Überleben im Boden und auf Pflanzen beeinflusst. Insbesondere mobile genetische Elemente, die durch horizontalen Gentransfer erhalten werden, tragen zur Diversität der pathogenen Eigenschaften, aber auch zur Anpassung an Habitate außerhalb des Darms bei. Wichtig für die erfolgreiche Etablierung von Humanpathogenen an der Pflanze ist deren Anhaftung und Aufnahme sowie die Reak­tion der Pflanze. Die komplexe Interaktion von Human­pathogenen und Pflanze wird wesentlich durch die genetische Ausstattung des Humanpathogens, vom Pflanzengenotyp und -mikrobiom, aber auch von einer Vielzahl von Umweltfaktoren bestimmt. Für das Überleben von Humanpathogenen ist insbesondere die Verfügbarkeit von Nährstoffen kritisch, um die sie mit der natürlichen Mikroflora konkurrieren.Empfehlungen für die Praxis setzen ein besseres Verständnis der Ökologie von Humanpathogenen im Boden und an Pflanzen, aber auch entlang der Produktkette voraus. Dafür sind die Entwicklung und Nutzung empfindlicher und spezifischer Nachweistechniken, die sowohl die mögliche Diversifizierung der Humanpathogene durch horizontalen Gentransfer als auch das Problem der Nichtkultivierbarkeit berücksichtigen, besonders dringlich. DOI: 10.5073/JfK.2015.09.01, https://doi.org/10.5073/JfK.2015.09.01Fruits and vegetables are beneficial for human health. A major contribution to this comes from the microorganisms associated with them. However, fruits and vegetables may cause food poisoning, when contaminated with human pathogens and eaten raw. In our review, based on a lite­rature survey, we show insights into the entry of Escherichia coli or Salmonella enterica into the fruit and vegetable environment via diverse routes and the complex interactions between various bio­tic and abiotic factors, which influence the survival of human pathogens in soil and on plants. In particular, mobile genetic elements acquired through horizontal gene transfer contri­bute to the diversity of pathogenic strains and to their adaptation to extra-intestinal habitats. For a successful establishment of human pathogens on plants, the attachment, internalization and the response of the plant are important. Mainly the genetic equipment of the human pathogen, the plant, and its microbiome determine the complex interaction between human pathogens and plants. However, also a multitude of environmental factors plays an important role. The availability of nutrients, for example, is fundamental for the survival of human pathogens and they have to compete for them with the indigenous plant and soil microorganisms. Recommendations for the practice require an improved understanding of the ecology of human pathogens in soil and on plants but also along the production chain. The development and use of sensitive and specific detection tools is essential and needs to consider the diversification of human pathogens through horizontal gene transfer as well as the problem of their non-cultivability under environmental stress conditions. DOI: 10.5073/JfK.2015.09.01, https://doi.org/10.5073/JfK.2015.09.0

Diagnosis of quarantine organisms at the JKI in the National Reference Laboratory for organisms harmful to plants

Dem JKI wurde im April 2019 durch das Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft (BMEL) die Funktion des nationalen Referenzlaboratoriums (NRL) für Schadorganismen der Pflanzen zugewiesen. Mit dieser Funktion des NRL für Deutschland sind bestimmte Zuständigkeiten und Aufgaben verbunden, die in der EU-Verordnung 2017/625 (EU, 2017) geregelt sind. Dazu gehören auch Referenzuntersuchungen bzw. die Diag­nose von Quarantäneschadorganismen (QSO). Das NRL stellt eine übergeordnete Einheit innerhalb des JKI dar. Durch insgesamt 14 Prüflabore der JKI-Institute für Pflanzenschutz in Ackerbau und Grünland (A), nationale und internationale Angelegenheiten der Pflanzengesundheit (AG), Epidemiologie und Pathogendiagnostik (EP), Pflanzenschutz in Gartenbau und Forst (GF), Pflanzenschutz in Obst- und Weinbau (OW) wird die Referenzfunktion bei der Diagnose zu verschiedensten (Quarantäne)-Schadorganismen der Pathogengruppen Bakterien, Insekten, Nematoden, Pilze (einschließlich Oomyceten), Phytoplasmen und Viren wahrgenommen.In April 2019, the JKI was officially designated as the Natio­nal Reference Laboratory (NRL) for organisms harmful to plants by the Federal Ministry of Food and Agri­culture (BMEL). This function as NRL for Germany is associated with certain responsibilities and tasks, which are specified in the EU Regulation 2017/625 (EU, 2017). This also includes reference tests and the diagnosis of quarantine pests, respectively. The NRL represents a super­ordinate unit inside JKI. A total of 14 test laboratories from different JKI institutes, namely for Plant Protection in Field Crops and Grassland (A), for National and International Plant Health (AG), for Epidemiology and Pathogen Diagnostics (EP), Plant Protection in Horti­culture and Forests (GF), and for Plant Protection in Fruit Crops and Viticulture (OW) are in charge to carry out a reference function in the diagnosis of (quarantine) pests in the pathogen groups of bacteria, fungi (including oomycetes), insects, nematodes, phytoplasma und viruses

Factors influencing the fate of Salmonella in the plant and soil environment

Frisches Obst und Gemüse sind Teil einer gesunden Ernährung. Jedoch können diese Frischeprodukte, wenn sie roh verzehrt werden und mit Humanpathogenen kontaminiert sind, Krankheiten beim Menschen verursachen. Kontaminationen von Frischeprodukten mit bakteriellen Humanpathogenen wie Salmonella enterica können entlang der gesamten Produktionskette auftreten, und eine mögliche Kontaminationsquelle ist der Boden. Die Rhizosphäre und Phyllosphäre von Pflanzen sowie der Boden sind sehr heterogene Habitate, deren Bedingungen sich schnell verändern können, und das Überleben von Humanpathogenen in dieser Umwelt wird von vielen biotischen und abiotischen Faktoren beeinflusst. Bislang ist vieles über die Ökologie von Salmonella in der Umwelt noch nicht bekannt und das Ziel dieser Arbeit war es, das Wissen darüber zu erweitern, welche Faktoren die Persistenz von Salmonella in der pflanzlichen Umwelt beeinflussen. In dieser Arbeit wurden in Mikrokosmos- und Gewächshausversuchen Faktoren untersucht, die das Überleben von Salmonella unter definierten Bedingungen beeinflussen können. Kopfsalat (Lactuca sativa cv. Tizian) wurde als Modellpflanze verwendet und Salmonella enterica serovar Typhimurium Stamm LT2 als Modellhumanpathogen. S. Typhimurium LT2 wurde in den Boden inokuliert und das Überleben mithilfe kultivierungsabhängiger und -unabhängiger Methoden verfolgt. Zu den in dieser Arbeit untersuchten Faktoren gehört der Einfluss der Präadaption, d.h. der Bedingungen, denen Bakterien vor dem Einbringen in die untersuchte Umwelt ausgesetzt sind, auf das Überleben von S. Typhimurium LT2 sowie auf S. Typhimurium Stamm 14028s und S. enterica Serovar Senftenberg. In Mikrokosmosexperimenten wurde gezeigt, dass die Anzahl kultivierbarer Zellen von S. Typhimurium LT2 nach Präadaption signifikant höher im Vergleich zur Kontrolle ohne Präadaption war. Dies zeigt, dass Präadaptation das Überleben dieses Salmonella-Stamms im Boden fördert. Die Ergebnisse liefern einen Hinweis darauf, dass das für die Anzucht der Zellen für Inokulationsexperimente verwendete Medium einen stammspezifischen Effekt auf das Überleben im Boden hat. Das bedeutet, dass die Bedingungen, denen Zellen vor der Inokulation ausgesetzt sind, einen großen Einfluss auf das Überleben von Salmonella haben können. Im Hinblick auf die Vergleichbarkeit der Ergebnisse verschiedener Studien ist dieses Ergebnis von Bedeutung. Des Weiteren wurde die Hypothese untersucht, dass das Überleben von S. Typhimurium LT2 im Boden und die Besiedlung von Kopfsalatpflanzen mit S. Typhimurium LT2 aus kontaminiertem Boden durch die Behandlung des Bodens mit Klärschlamm oder die Inokulation der pflanzenparasitären Nematoden Meloidogyne hapla oder Pratylenchus crenatus in den Boden gefördert wird. Entgegen der Erwartung, dass Klärschlamm durch zusätzliche Nährstoffe das Überleben von Salmonella fördert, wurde jedoch eine höhere Anzahl kultivierbarer S. Typhimurium LT2 im unbehandelten Boden gefunden als im Boden, der mit Klärschlamm behandelt wurde. Zwischen Proben von Boden, der mit Nematoden inokuliert wurde, und Kontrollboden wurde kein Unterschied in der Anzahl kultivierbarer S. Typhimurium LT2 gefunden. In keiner der Blattproben, die nach 21 oder nach 49 Tagen von Kopfsalatpflanzen aus Boden mit Klärschlamm, mit Nematoden oder aus den jeweiligen Kontrollböden genommen wurden, wurde Salmonella detektiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Gegenwart von Klärschlamm oder Nematoden im Boden nicht die Besiedelung von Kopfsalatpflanzen mit S. Typhimurium LT2 fördert und dass auch hohe Konzentrationen von S. Typhimurium LT2 im Boden nicht unbedingt zur Kontamination der oberirdischen Teile der Pflanze durch Internalisierung über die Wurzeln führen. Da vermutet wurde, dass das geringere Überleben von Salmonella im Boden, der mit Klärschlamm behandelt wurde, auf die konkurrierenden Mikroorganismen zurückzuführen war, erfolgte eine kultivierungsunabhängige Analyse der Behandlung des Bodens mit Klärschlamm im Hinblick auf Veränderungen der bakteriellen Gemeinschaft im Boden sowie mobiler genetischer Elemente (MGE) und Antibiotikaresistenzgene (ARG) in einem Mikrokosmosexperiment über vier Monate. Ein Vergleich der Diversität und Häufigkeit von ARGs in Bodenproben mit Klärschlamm im Vergleich zum unbehandelten Boden zeigte eine erhöhte relative Abundanz von Plasmiden, Integrons, Transposons und Resistenzgenen, die teilweise auch nach vier Monaten detektierbar waren. Die bakteriellen Gemeinschaften im Boden zeigten nach Behandlung mit Klärschlamm verringerte Diversität im Vergleich zum Kontrollboden, und die Unterschiede wurden im Verlauf des Versuchs geringer. Resistenzplasmide aus Klärschlamm, die auf das Gammaproteobacterium Pseudomonas putida übertragbar sind, wurden mithilfe der exogenen Plasmidisolierung aus Klärschlamm extrahiert. Die isolierten Plasmide gehörten mehrheitlich zur Inkompatibilitätsgruppe IncP-1, die einen breiten Wirtsbereich hat. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit das Wissen über die Faktoren, die das Überleben von Salmonella in der pflanzlichen Umwelt und im Boden beeinflussen, erweitert und gezeigt, dass das Schicksal von Salmonella in der Umwelt sehr komplex ist und viele Faktoren das Überleben beeinflussen. Auf Wunsch des Autors / der Autorin ist diese Dissertation nur als Druckausgabe verfügbar.Fresh fruits and vegetables are increasingly recognized as part of a healthy diet. However, disease outbreaks caused by Salmonella linked to fresh produce indicate that raw fruits and vegetables could be a vector for human pathogens. Contamination of fresh produce with Salmonella can occur along the whole production chain and one possible source is contaminated soil. Soil, rhizosphere and phyllosphere are heterogenous habitats where conditions can change quickly and survival of human pathogens in this environment is influenced by various biotic and abiotic factors. So far, the ecology of Salmonella in the environment is largely unknown and this thesis aimed at extending the knowledge of factors influencing the persistence of Salmonella in the soil-plant environment.In this thesis, microcosm and greenhouse experiments were conducted to analyze factors influencing the fate of Salmonella under defined conditions. Lettuce (Lactuca sativa cv. Tizian) was used as a model plant and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain LT2 as a model human pathogen. S. Typhimurium LT2 was inoculated into soil and its fate was monitored using cultivation-dependent and -independent methods.Among the factors investigated in this thesis, the influence of preadaptation, meaning the conditions which the bacteria encounter before their introduction into the analyzed environment, on the survival of S. Typhimurium LT2 was investigated in soil microcosms. It was found that numbers of cultivable S. Typhimurium LT2 cells were significantly higher in the treatment with preadaptation than in the respective treatmment without preadaptation, showing that preadaptation can prolong survival of this strain in soil. These results indicate that the medium used to pre-grow Salmonella before inoculation into soil influenced the ability to survive in soil in a strain-specific manner. Therefore, conditions which bacteria encounter before their introduction into the environment might have a major influence on their survival and should be considered also with respect to comparability between studies. Furthermore, in this thesis it was analyzed whether survival of S. Typhimurium LT2 inoculated into soil and colonization of lettuce plants by this strain is fostered by addition of sewage sludge or the plant-parasitic nematodes Meloidogyne hapla or Pratylenchus crenatus to soil. Unexpectedly, higher counts of cultivable S. Typhimurium LT2 were observed in untreated soil compared to soil with sludge. There were no differences in numbers of cultivable Salmonella in samples with nematode inoculation compared to control samples. No S. Typhimurium LT2 was detected in any of the leaf samples of lettuce plants grown in soil that was inoculated with S. Typhimurium LT2 after 21 and 49 days; neither in the samples where sludge or nematodes were added to the soil nor in the respective controls, indicating that the presence of sewage sludge or nematodes in soil did not foster colonization of lettuce plants by S. Typhimurium LT2. This suggests that the presence of Salmonella in soil even in relatively high concentrations and after addition of sewage sludge or plant-parasitic nematodes does not necessarily lead to a contamination of the aboveground part of plants by internalization through the roots.The application of sewage sludge to soil was also analyzed with respect to the dynamics of the bacterial soil community as well as its associated mobile genetic elements (MGEs) and antibiotic resistance genes (ARGs) in a microcosm experiment over the course of four months. Comparison of the microbial diversity and relative abundances of ARGs in soil samples with sewage sludge compared to control soil revealed increased relative abundance of plasmids, integrons, transposons and resistance genes that in some cases were still detectable after four months. Soil bacterial communities showed reduced richness and diversity compared to control soil but differences decreasing with time. Resistance plasmids were captured directly from sewage sludge in Pseudomonas putida. The majority of the plasmids isolated belonged to the broad host range IncP-1 plasmids.Altogether, this thesis extends the knowledge of factors influencing the fate of Salmonella in the soil - plant environment demonstrating that the fate of Salmonella in the environment of plants is very complex with many factors influencing its survival. Upon author request this thesis is available as printed version only

The Transferable Resistome of Produce

Produce is one of the most popular food commodities. Unfortunately, leafy greens can be a reservoir of transferable antibiotic resistance genes. We found that IncF and IncI plasmids were the most prevalent plasmid types in E. coli isolates from produce. This study highlights the importance of the rare microbiome associated with produce as a source of antibiotic resistance genes that might escape cultivation-independent detection, yet may be transferred to human pathogens or commensals.Produce is increasingly recognized as a reservoir of human pathogens and transferable antibiotic resistance genes. This study aimed to explore methods to characterize the transferable resistome of bacteria associated with produce. Mixed salad, arugula, and cilantro purchased from supermarkets in Germany were analyzed by means of cultivation- and DNA-based methods. Before and after a nonselective enrichment step, tetracycline (TET)-resistant Escherichia coli were isolated and plasmids conferring TET resistance were captured by exogenous plasmid isolation. TET-resistant E. coli isolates, transconjugants, and total community DNA (TC-DNA) from the microbial fraction detached from leaves or after enrichment were analyzed for the presence of resistance genes, class 1 integrons, and various plasmids by real-time PCR and PCR-Southern blot hybridization. Real-time PCR primers were developed for IncI and IncF plasmids. TET-resistant E. coli isolated from arugula and cilantro carried IncF, IncI1, IncN, IncHI1, IncU, and IncX1 plasmids. Three isolates from cilantro were positive for IncN plasmids and blaCTX-M-1. From mixed salad and cilantro, IncF, IncI1, and IncP-1β plasmids were captured exogenously. Importantly, whereas direct detection of IncI and IncF plasmids in TC-DNA failed, these plasmids became detectable in DNA extracted from enrichment cultures. This confirms that cultivation-independent DNA-based methods are not always sufficiently sensitive to detect the transferable resistome in the rare microbiome. In summary, this study showed that an impressive diversity of self-transmissible multiple resistance plasmids was detected in bacteria associated with produce that is consumed raw, and exogenous capturing into E. coli suggests that they could transfer to gut bacteria as well

Persistence of Salmonella Typhimurium LT2 in Soil Enhanced after Growth in Lettuce Medium

The persistence of Salmonella in the environment is influenced by a multitude of biotic and abiotic factors. In addition, its persistence can be influenced by preadaptation before the introduction into the environment. In order to study how preadaptation changes the survival of Salmonella in soil and therefore its potential to colonize the phytosphere, we developed a new medium based on lettuce material [lettuce medium (LM)]. Salmonella enterica serovar Typhimurium strain LT2 was used as a model for Salmonella in this study. LT2 was inoculated into soil microcosms after pregrowth in Luria Bertani (LB) broth or in LM. Survival of LT2 in soil was monitored over 56 days by plate counts and quantification of the Typhimurium-specific gene STM4497 using qPCR in total community DNA for which primers and TaqMan probe were designed in this study. Significantly enhanced persistence was observed for LT2 pregrown in LM compared to LT2 pregrown in LB, indicating a preadaptation effect. Surprisingly, no improved survival could be observed for S. Typhimurium strain 14028s and S. enterica serovar Senftenberg after pregrowth on LM. This indicates a high strain specificity of preadaptation. Results from previous studies suggested that biofilm formation could enhance the survival of human pathogens in various environments and might contribute to enhanced survival on plants. In vitro biofilm assays with several Salmonella strains revealed a strain-specific effect of LM on the biofilm formation. While LM significantly improved the biofilm formation of S. Senftenberg, the biofilm formation of LT2 was better in LB. This indicates that the better survival of LM-pregrown LT2 in soil was not linked to an improved ability to form biofilms but was likely due to other factors. Most importantly, this study showed that the medium used to pregrow Salmonella can influence its survival in soil and its biofilm formation which might influence the fate of Salmonella in soil

Soil amendment with sewage sludge affects soil prokaryotic community composition, mobilome and resistome

International audienceMunicipal sewage sludge (MSS) is often directly applied to fields despite concerns regarding the spread of harmful microbes and associated resistance genes (RGs). In this four month microcosm study, the dynamics of prokaryotic communities in agricultural soil and changes in mobile genetic elements and RGs following amendment with stabilized MSS were investigated. TaqMan-based quantitative real-time (q)PCR showed that RG prevalence was high when compared to untreated soil and genes for class 1 integrons (intI1), streptomycin RGs (aadA, strA) and tetracycline RG (tet(W)) were detectable for the duration of the four month study. High-throughput qPCR revealed an enhanced prevalence of aminoglycoside RGs (aacC, aadE), macrolide lincosamide-streptogramin B RGs (ermB, ermF) and tetracycline RGs (tet(L), tet(M), tet(X)). Illumina MiSeq sequencing of 16S rRNA gene fragments amplified from total community DNA revealed significant changes in the prokaryotic community composition both at phylum and genus levels, with lower richness and evenness after MSS amendment followed by gradual recovery after 119 days. Conjugative plasmids captured from MSS using exogenous isolation belonged predominantly to the IncP-1 plasmid group. Our results provide new insights into short- and medium-term effects of MSS amendment on soil prokaryotic communities, including the mobilome and resistome