Regulatorische Netzwerke der Genexpression in Herz- und Skelettmuskelzellen auf der Ebene von Histonmodifikationen und Transkriptionsfaktoren

Title and Contents I 1\. Introduction 1 2\. Aims 23 3\. Materials and Methods 25 4\. Results 41 5\. Discussion 85 6\. Outlook 105 7\. Summary 107 8\. Zusammenfassung 109 9\. References 113 10\. Supplementary Data 125 11\. Appendix 141 13\. List of Own Publications 158In this study the role of histone modifications and their potential interactions with four key cardiac transcription factors in the context of heart development and congenital heart diseases were studied. While histone modifications influence the compaction of chromatin and consequently the accessibility of DNA, transcription factors (TFs) are responsible for a fine tuning of expression. Two histone acetylations and two histone methylations were studied which were previously described to be associated with active transcription: H3ac, H4ac, H3K4me2 and H3K4me3. The transcription factors Gata4, Mef2a, Nkx2.5, and Srf are known to be essential for heart development and form a regulatory subnetwork in which they regulate each others expression. To gain insight into the processes regulating gene expression, the histone modifications and transcription factors were investigated, using heart and skeletal muscle cells as model systems. Their combinatorial occurrence was determined by chromatin immunoprecipitation followed by detection on custom arrays (ChIP-chip). The arrays represent the 12,625 transcription start sites of 8,585 murine genes. This information was combined with expression array data of the same genes and RNA interference (RNAi) experiments targeting the investigated transcription factors. The developed research tools such as array designs, the software package for the analysis, the raw data and a results database were made publicly available. The presented data set demonstrated that the average transcript levels associated with combinations of modifications are not simply related to those associated with individual modifications, supporting the histone code hypothesis: Different combinations of modifications are associated with significantly different transcript levels and the levels of these combinations are not additively related to the levels associated with the individual modifications. The dynamics of histone modifications during muscle cell differentiation suggests that they may have a major function as signaling marks for the recruitment of TFs. The four investigated transcription factors not only regulate each others expression but also have a high number of coregulated target genes, many of which are themselves transcription factors. An example is the T-box transcription factor Tbx20, which was identified as a novel target. This suggests that Gata4, Mef2a, Nkx2.5, and Srf can be placed at the top of several regulatory cascades. Analysis of the binding sequences showed that the conservation of binding sites is lower than previously suggested and furthermore revealed a novel binding motif for Srf. The TFs were found to frequently bind at sites of histone modifications and to mainly function as activators of transcription. The activating potential of Gata4 and Srf was even enhanced at sites of H3ac: possibly a consequence of the interaction between these transcription factors and the histone acetyl transferase (HAT) p300.In dieser Arbeit wurden die Rolle von Histon-Modifikationen sowie ihre möglichen Interaktionen mit vier Schlüssel-Transkriptionsfaktoren (TFs) im Kontext von Herz-Entwicklung und angeborenen Herz-Erkrankungen untersucht. Histon-Modifikationen beeinflussen maßgeblich den Grad der Kompaktierung von Chromatin und damit auch die Zugänglichkeit der DNA. Transkriptionsfaktoren dagegen sind für die Feinjustierung der Expression verantwortlich. Zwei Histonacetylierungen und zwei Histonmethylierungen wurden untersucht, deren Einfluss auf die Transkription als aktivierend gilt: H3ac, H4ac, H3K4me2 und H3K4me3. Die Transkriptionsfaktoren Gata4, Mef2a, Nkx2.5, und Srf sind essentiell für die Entwicklung des Herzens und bilden ein Teilnetzwerk, in dem sie ihre Expression gegenseitig regulieren. Um Einblicke in die Steuerung der Genexpression zu erlangen, wurden die Histon-Modifikationen und die vier Transkriptionsfaktoren in Herz- und Skelettmuskelzellen als Modellsysteme verwendet. Die Kombinatorik ihres Auftretens wurde mittels Chromatin-Immunopräzipitation und einer anschließenden Analyse auf maßgeschneiderten Arrays ermittelt (ChIP-chip). Die Arrays repräsentieren die 12.625 Transkription-Starts von 8.585 murinen Genen. Diese Information wurde mit den Ergebnissen einer Expressionsanalyse der gleichen Gene sowie mit RNA Interferenz (RNAi) Experimenten gegen die Transkriptionsfaktoren kombiniert. Die entwickelten Analyse-Werkzeuge, wie die Designs der Arrays, das Software- Paket für die Auswertung, die Rohdaten und eine Datendank der Ergebnisse, wurden über das Internet allgemein zugänglich gemacht. Die hier vorgestellten Daten zeigen, dass die durchschnittlichen Expressionswerte, die mit Kombinationen von Modifikationen einhergehen, sich nicht einfach aus den Expressionswerten der Gene, die mit einzelnen Modifikationen assoziiert sind, ableiten lassen. Diese Befunde unterstützen die Histon Code Hypothese: Verschiedene Kombinationen von Histon-Modifikationen sind mit signifikant unterschiedlichen Expressionswerten verknüpft, und das Expressionsniveau der Kombinationen ergibt sich mitnichten als Summe der Expressionsniveaus, die mit den einzelnen Modifikationen assoziiert sind. Die Dynamik der Histon- Modifikationen während der Differenzierung von Muskelzellen suggeriert, dass sie eine wichtige Rolle als Signale für die Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren spielen könnten. Die vier untersuchten Transkriptionsfaktoren regulieren sich nicht nur gegenseitig, sondern haben auch eine hohe Zahl von gemeinsamen Zielgenen, von denen zahlreiche selbst wieder Transkriptionsfaktoren sind. Ein Bespiel dafür ist der als neues Zielgen identifizierte T-box Transkriptionsfaktor Tbx20. Auf Grund dieser Ergebnisse können Gata4, Mef2a, Nkx2.5 und Srf am Beginn von mehreren regulatorischen Kaskaden plaziert werden. Die Analyse der von den Faktoren gebundenen DNA-Sequenzen zeigt, dass diese weniger gut konserviert sind als bisher vermutet wurde; weiterhin konnte ein neues Bindungsmotif für Srf identifiziert werden. Die untersuchten Transkriptionsfaktoren binden meist in Bereichen, in denen auch Histon-Modifikationen gefunden wurden, und fungieren überwiegend als Aktivatoren der Genexpression. Dieses aktivierende Potential wird im Falle von Gata4 und Srf noch verstärkt, wenn gleichzeitig H3ac vorliegt; dies ist möglicherweise eine Konsequenz der Interaktion der Transkriptionsfaktoren mit der Histonacetyltransferase (HAT) p300

Ertrag und Futterwert von Mais-Bohnen Gemengen als Ganzpflanzensilage in der Milchviehfütterung

Silage maize is a valuable forage crop for dairy cows in Organic Farming due to its high energy concentration and the high yield potential. One limitation to maize silage as a feed for dairy cows is the low crude protein concentration (Armstrong et al. 2008). To improve the protein content of maize silage a field experiment of maize-bean intercropping was carried out at the Institute for Organic Farming (Schleswig-Holstein, sL, 740 mm, 8.7°C). In the experiment different bean varieties (Phaseolus vulgaris, Phaseolus coccineus, Vicia faba) and -species are evaluated. Especially the climbing Phaseolus beans have the potential to increase the protein content due to their high biomass production. The aim of the field experiment is to detect maize-bean intercropping systems with a high yield potential and good feed value. Furthermore the fermentability of the maize-bean silage was evaluated in a subsequent silage trial

Erhebung zur Ausbildung von Wurzelknöllchen an Stangen- und Feuerbohnen im Gemengeanbau mit Silomais

Since maize bean intercropping is not a common system in Germany, the nodulation of four cultivars of Phaseolus vulgaris and two cultivars of P. coccineus in intercropping with silage maize was evaluated at the end of bean flowering. The root samples were taken in 2015 from a randomized field trial with four replications at the Thünen Institute of Organic Farming with six samples per plot. The number of root nodules, dry matter weight of nodules and nodule activity were assessed. The statistical analysis, which was conducted with the SAS-program for nonparametric ANOVA, showed significant differences for dry matter weight and number of root nodules between the bean cultivars

Etablierung von Untersaaten zur Reduzierung des Unkrautdruckes im Mais-Bohnen-Gemengeanbau

Da eine mechanische Unkrautbekämpfung nach dem Auflaufen der Bohnen nur schwer möglich ist, haben wir untersucht, ob es möglich ist Untersaaten in Mais-Bohnen-Gemengen zu etablieren. Dazu wurden zwei Untersaatmischungen, sowohl in Mais-Reinsaat als auch in zwei Gemengevarianten mit Feuerbohnen (Phaseolus coccineus, cv. Preisgewinner) bzw. Stangenbohnen (Phaseolus vulgaris, cv. Tarbais) getestet. Als Kontrollvarianten wurden Parzellen ohne Untersaat geprüft. Die Untersaatmischungen bestanden aus Welschem Weidelgras (cv. Gersimi, Aussaatdichte: 15 kg ha-1), in Kombination mit Erdklee (cv. Seaton Park, Aussaatdichte: 30 kg ha-1) in US1 und Futterchicoree (cv. Puna II, Aussaatdichte 7,5 kg ha-1) in US2. Zum Zeitpunkt der Maisblüte (BBCH65) wurden der Gesamtdeckungsgrad sowie die Deckungsgrade der einzelnen Unkrautarten an zwei Stellen pro Parzelle geschätzt. Zur Ernte wurde die gesamte Biomasse der Untersaaten und des Unkrauts erfasst. Beide Untersaatmischungen konnten erfolgreich etabliert werden, wobei die Biomasse im ersten Jahr deutlich niedriger war als im zweiten Jahr. Daher unterschied sich die Unkraut-Biomasse zwischen den Jahren signifikant. Beide Untersaatmischungen erzielten eine Reduktion der Artenzahl um 1-2 Arten. Ebenso wurde der Unkrautdeckungsgrad durch US1 in allen Hauptkulturen, aufgrund einer besseren Bodenbedeckung des Erdklees, signifikant reduziert, während nur die Kombination mit der Stangenbohne eine signifikante Reduktion mit US2 erreichte

Reduktion des Unkrautdruckes durch die Etablierung von Untersaaten in Mais-Bohnen-Gemengen

Am Thünen-Institut für Ökologischen Landbau (Schleswig-Holstein, sL, 740 mm, 8,7°C) werden von 2014-2016 Parzellenversuche zum Gemengeanbau von Mais mit Phaseolus-Bohnen durchgeführt. In vorangegangen Versuchen hat sich gezeigt, dass Mais und Bohnen infolge der langsamen Jugendentwicklung nur eine sehr geringe Konkurrenzkraft gegenüber Unkräutern aufweisen. Daher erfolgt die Aussaat der Bohnen erst nach Abschluss der mechanischen Unkrautbekämpfung mit Striegel und Hacke, zum 4-Blattstadium (BBCH 14) des Maises. Da mechanische Unkrautbekämpfungsmaßnahmen nach der Aussaat der Bohnen kaum durchgeführt werden können, wird in einem Untersaatenversuch geprüft, ob die Etablierung einer zusätzlichen Untersaat den Unkrautdruck im Gemenge nachhaltig reduzieren kann. Hierzu werden jeweils zwei Untersaatenmischungen in reinen Maisparzellen, sowie in den Gemengen mit Stangenbohnen (Phaseolus vulgaris, cv. Tarbais) und Feuerbohnen (Phaseolus coccineus, cv. Preisgewinner) geprüft. Als Kontrollvarianten dienen Parzellen ohne Untersaat. Die Untersaat (US)-Mischungen bestehen aus Welschem Weidelgras (Sorte: Gersimi, Saatstärke: 15 kg ha-1), das in US1 mit Erdklee (Sorte: Seaton Park, Saatstärke: 30 kg ha-1) und in US2 mit Futterchicorée (Sorte: Puna II, Saatstärke: 7,5 kg ha-1) kombiniert wird. Im ersten Versuchsjahr 2014 erzielte die US1 mit 50 g TM m-2 im Mittel der Varianten die höchsten Biomasse-aufwüchse, während die Biomasseaufwüchse der US2 mit 32 g TM m-2 signifikant geringer ausfielen. Infolge der gelungenen Pflegemaßnahmen und der zügigen Jugendentwicklung der Kulturpflanzen war der Unkrautdruck 2014 insgesamt sehr gering. Dennoch zeigen die Ergebnisse, dass die Untersaaten im Vergleich zu den Kontrollvarianten zu einer effektiveren Unkrautunter¬drückung beigetragen haben. Während in den Varianten ohne Untersaaten erwartungsgemäß die signifikant höchste Unkrautbiomasse zu verzeichnen war, konnte diese im Durchschnitt der Varianten mit der US1 um 70% und mit der US2 um 80% signifikant reduziert werden

Eignung verschiedener Stangen- und Feuerbohnensorten für den Mais-Bohnen-Gemengeanbau und Optimierung der Bestandeszusammensetzung

Traditional intercropping systems with maize and climbing beans have the potential to improve the protein- and energy supply from locally grown roughage. As previous field experiments at the Thünen Institute of Organic Farming have shown, the crude protein content of maize silage can be enhanced by intercropping with climbing Phaseolus beans. Since 2014 further field experiments are conducted, that aim to optimize bean yield and fodder quality in intercropping with maize. Therefore four cultivars of Phaseolus vulgaris (Pv) and two cultivars of P. coccineus (Pc) are evaluated for their intercropping potential. Furthermore, the influence of varied seed densities on bean yield and crude nutrients are evaluated for two selected bean cultivars. The experiments have shown, that bean yield is mainly influenced by the choice of cultivar. Varied seed densities had little effect on the almost higher bean yields of cv. Tarbais (Pv) while the yield of cv. Preisgewinner (Pc) increased at higher seed densities. As the cv. Tarbais had the highest bean yields in both years, and total yield was comparable to the maize control, this cultivar has the highest potential for intercropping at our site

Silierung von Mais mit Stangen- und Feuerbohne

An intercropping system with maize and climbing beans has the potential to improve the protein- and energy supply from regional grown roughage. Up to now there is only limited knowledge to the ensilage and to silage quality. Therefore maize with six bean cultivars in mixed cultivation as well as maize with a controlled proportion of beans were tested on fermentability and silage quality. Additionally the use of chemical and biological silage additives were evaluated. With the mixed cultivation of maize and beans a good silage quality could be achieved when the harvest material showed good ensiling characteristics and the ensiling conditions were optimized. If this should not be the case, the application of silage additives can have a positive effect. Above all a good silage quality could be achieved by the chemical additive Kofasil stabil

Sorteneffekte von Stangen- und Feuerbohnen auf die Erträge und die Ertragszusammensetzung im Gemenge mit Silomais

Der Gemengeanbau von Silomais mit rankenden Phaseolus-Bohnen bietet die Möglichkeit, die energiereiche Maissilage durch höhere Rohproteingehalte aufzuwerten. Hierdurch kann ein wichtiger Beitrag zur Verbesserung der regional-basierten Versorgung landwirtschaftlicher Nutztiere aus dem Grundfutter geleistet werden. Wie bisherige Untersuchungen (Fischer und Böhm, 2013) am Thünen-Institut für Ökologischen Landbau gezeigt haben, werden die Bohnenerträge, neben witterungsbedingten Effekten, insbesondere durch die Sortenwahl beeinflusst. Daher wird seit 2014 die Eignung von vier Stangenbohnen, sowie zwei Feuerbohnensorten für den Gemengeanbau mit Silomais geprüft

Gemengeanbau von Mais mit Phaseolus-Bohnen: Einfluss von Sorte und Saatdichte der Bohnen auf die Bestandszusammensetzung

Vor dem Hintergrund, dass eine nachhaltige Proteinversorgung landwirtschaftlicher Nutztiere zukünftig verstärkt mit betrieblich oder regional erzeugten Futtermitteln erfolgen soll, bietet der Mais-Bohnen-Gemengeanbau, insbesondere für den Ökologischen Landbau, einige Vorteile. Während Silomais, aufgrund der hohen Energiedichte und der guten Silierfähigkeit ein wichtiges Grundfuttermittel darstellt, müssen die geringen Proteingehalte in der Maissilage, durch eiweißreiche Futterkomponenten ergänzt werden. Durch den Gemengeanbau von Silomais mit rankenden Phaseolus-Bohnen besteht dagegen die Möglichkeit, ein silierfähiges und energiereiches Futtermittel zu gewinnen, das gegenüber der reinen Maissilage einen höheren Proteingehalt aufweist und in einem Arbeitsgang gewonnen werden kann. In ersten Versuchen am Thünen-Institut für Ökologischen Landbau konnte der Gemengeanbau von Mais mit Phaseolus-Bohnen bereits erfolgreich unter den Anbaubedingungen des Ökologischen Landbaus etabliert werden (Fischer und Böhm 2013)

Bidrar spridningskorridorer till ökad biodiversitet?

Det av människan påverkade och fragmenterade landskapet präglas ofta av en låg konnektivitet där många habitat är isolerade, vilket innebär en risk för att arter dör ut och en minskad biologisk mångfald. Ett populärt verktyg för att öka konnektiviteten i landskapet är korridorer, och det är fokus för den här uppsatsen. Frågeställningarna som uppsatsen utgått ifrån är: Kan spridningskorridorer bidra till ökad biologisk mångfald? Om så, vilka verkar de viktigaste bidragande faktorerna vara? 14 studier och tre analyser har studerats och analyserats i en litteraturstudie. Resultatet tydliggör att det är en komplex fråga där många olika aspekter påverkar olika arters val att använda eller inte använda en korridor. Men generellt verkar finnas fler argument som talar för än mot korridorer. Några aspekter som verkar betydelsefulla är bredden och karaktären på korridoren, att dämpa invasiva arters framfart, att minska störningar, samt att anpassa underhåll av korridorer utifrån deras syften. Liksom helhetsperspektivet där korridoren har ett tydligt syfte och är anpassad efter de behov målarterna har. Dock understryker samtliga undersökta studier vikten av att fler studier behövs och att framförallt är gedigen kunskap om målarterna grundläggande vid utformandet. En viktig poäng som framkommit under arbetes gång är vikten av att redan i början av landskapsekologiprojekt samarbeta med andra sakkunniga för att säkerställa att korridoren inte stannar vid en god tanke utan också lever upp till förväntningarna.The anthropogenic and fragmented landscape is often imprinted by a low connectivity where many habitat patches are isolated, the danger is species may go extinct in these habitats and thus decrease biodiversity. A popular way to increase connectivity in the landscape is corridors, which is the focus of this thesis. The questions which this thesis is based upon are: Could corridors support an increase in biodiversity? If so, which aspects appear to be the most significant? 14 research articles and three analyses have been reviewed and analysed in a literature review. The results show it’s a complex question with several factors that may have an impact on whether a species disperses through a corridor or not. But on the whole there appears to be a majority of studies that support corridors’ dispersing capabilities. Some aspects which appears to be important are the width and character of the corridor, the subduing of invasive species, the reducing of disturbances, and adapting maintenance of corridors according to their purposes. A wide perspective ensuring the corridor has a clear purpose and is designed according to the needs of the targetspecies is also vital. All studies and analyses strongly stress the need of further research, and above all thorough knowledge of the intended targetspecies is vital when designing corridors. An important point which has emerged during the course of the thesis is the importance to already in the beginning of landscape ecology projects cooperate with experts of the field to make sure the corridor won’t simply be a good intention but actually live up to the expectations