Interactions among the A and T Units of an ECF-Type Biotin Transporter Analyzed by Site-Specific Crosslinking

Energy-coupling factor (ECF) transporters are a huge group of micronutrient importers in prokaryotes. They are composed of a substrate-specific transmembrane protein (S component) and a module consisting of a moderately conserved transmembrane protein (T component) and two ABC ATPase domains (A components). Modules of A and T units may be dedicated to a specific S component or shared by many different S units in an organism. The mode of subunit interactions in ECF transporters is largely unknown. BioMNY, the focus of the present study, is a biotin transporter with a dedicated AT module. It consists of the S unit BioY, the A unit BioM and the T unit BioN. Like all T units, BioN contains two three-amino-acid signatures with a central Arg residue in a cytoplasmic helical region. Our previous work had demonstrated a central role of the two motifs in T units for stability and function of BioMNY and other ECF transporters. Here we show by site-specific crosslinking of pairs of mono-cysteine variants that the Ala-Arg-Ser and Ala-Arg-Gly signatures in BioN are coupling sites to the BioM ATPases. Analysis of 64 BioN-BioM pairs uncovered interactions of both signatures predominantly with a segment of ∼13 amino acid residues C-terminal of the Q loop of BioM. Our results further demonstrate that portions of all BioN variants with single Cys residues in the two signatures are crosslinked to homodimers. This finding may point to a dimeric architecture of the T unit in BioMNY complexes

Substratbindung und -freigabe während des Katalysezyklus eines biotinspezifischen ECF-Transporters

ECF (Energy-Coupling Factor)-Transporter sind prokaryotische Aufnahmesysteme für Mikronährstoffe, die eine spezielle Gruppe von Transportern mit ATP-Bindekassette (ABC) darstellen. Sie beinhalten zwei asymmetrische Membranproteine, von denen eins (S) für die spezifische Bindung und Translokation des Substrates und das andere (T) für die Kopplung mit den ATPasen (A1,A2) zuständig ist. Bei ECF-Transportern der Subklasse I bilden diese Komponenten eine Einheit, während bei Vertretern der Subklasse II ein AAT-Modul mit wechselnden S-Einheiten interagiert. In der vorliegenden Arbeit wurde der Transportmechanismus, der eine Drehung der kompletten S-Einheit in der Membran beinhaltet, anhand des Biotintransporters BioMNY erstmals experimentell validiert. Durch Rekonstitution in Lipid-Nanodiscs, chemische Quervernetzung, fluoreszenz- und ESR-spektroskopische Techniken sowie einen Bindungstest mit radioaktivem Biotin wurde gezeigt, dass (i) die ATP-Bindung an die ATPasen zu einer Aufrichtung der S-Einheit (BioY) führt, (ii) diese Bewegung die Substratbeladung ermöglicht und (iii) BioY dabei ununterbrochen mit der T-Einheit (BioN) interagiert. Dies stellt einen Gegensatz zu Systemen der Subklasse II dar, für die ein ATP-abhängiger Austausch von S-Einheiten im Transportzyklus gezeigt worden war. Darüber hinaus wurde ein Escherichia coli-Stamm konstruiert, der durch Blockierung seines hochaffinen Biotintransporters und des -synthesewegs auf Spuren von Biotin nicht wachsen kann. Dieser Stamm ermöglichte einen eindeutigen Nachweis der Transportaktivität einiger solitärer BioY-Proteine. Aufgrund der einheitlichen Topologie von S-Einheiten ist ein Kippen auch für solitäre BioY-Varianten wahrscheinlich. Auch die metallspezifischen S-Einheiten CbiM und NikM besitzen ohne AAT-Modul eine basale Co2+- bzw. Ni2+-Transportaktivität. Ein ESR-spektroskopischer Kobaltnachweises zeigte, dass die aus nur zwei Membranhelices bestehende CbiN-Einheit für die Metallbeladung von CbiM essentiell ist.ECF (Energy-Coupling Factor) transporters are a subgroup of ABC transporters that mediate uptake of micronutrients into prokaryotic cells. In contrast to canonical ABC importers, ECF transporters comprise two unrelated membrane proteins, one of which is responsible for specific and high affinity substrate binding (S) and the other one constitutes the coupling component (T) between S and the cytosolic ABC-ATPases (A1,A2). Subclass I transporters consist of four dedicated components whereas in subclass II transporters, a central AAT-module may interact with various S units. The biotin specific subclass I ECF transporter BioMNY was used to experimentally verify the hitherto hypothetic transport mechanism, which involves a rotation of the S unit within the membrane. With a series of experiments including reconstitution of BioMNY into lipid nanodiscs, site-specific cross-linking, a substrate binding assay with radioactive biotin and both fluorescence and EPR spectroscopic techniques, the ATP-dependent rotation of BioY (S) as a prerequisite for substrate binding and release was shown for the first time for an ECF transporter. Unlike subclass II transporters, for which an ATP-dependent release of the S unit was proposed, BioY interacts continuously with BioN (T) during the transport cycle. In a second focus of the work, an Escherichia coli reporter strain for biotin transporters was constructed. Due to inactivation of both biotin synthesis and the intrinsic high affinity biotin transporter, this strain was not capable of growing on trace amounts of biotin. With the use of this strain, transport activity of recombinantly produced solitary BioY proteins that naturally lack other ECF components was evidenced. Transport activity in the absence of AAT modules is also a feature of the Co2+ and Ni2+ specific S components CbiM and NikM. An EPR spectroscopic Co2+ detection assay helped underscoring the essential role of the small membrane protein CbiN for Co2+ loading of CbiM

Erstellung eines EDV-Programms zur Auslegung und Optimierung von kaltverformten Druckfeldern

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Oxytocin is associated with infant-care behavior and motivation in cooperatively breeding marmoset monkeys

The neurohormone oxytocin (OT) is positively involved in the regulation of parenting and social bonding in mammals, and may thus also be important for the mediation of alloparental care. In cooperatively breeding marmosets, infants are raised in teamwork by parents and adult and sub-adult non-reproductive helpers (usually older siblings). Despite high intrinsic motivation, which may be mediated by hormonal priming, not all individuals are always equally able to contribute to infant-care due to competition among care-takers. Among the various care-taking behaviors, proactive food sharing may reflect motivational levels best, since it can be performed ad libitum by several individuals even if competition among surplus care-takers constrains access to infants. Our aim was to study the link between urinary OT levels and care-taking behaviors in group-living marmosets, while taking affiliation with other adults and infant age into account. Over eight reproductive cycles, 26 individuals were monitored for urinary baseline OT, care-taking behaviors (baby-licking, -grooming, -carrying, and proactive food sharing), and adult-directed affiliation. Mean OT levels were generally highest in female breeders and OT increased significantly in all individuals after birth. During early infancy, high urinary OT levels were associated with increased infant-licking but low levels of adult-affiliation, and during late infancy, with increased proactive food sharing. Our results show that, in marmoset parents and alloparents, OT is positively involved in the regulation of care-taking, thereby reflecting the changing needs during infant development. This particularly included behaviors that are more likely to reflect intrinsic care motivation, suggesting a positive link between OT and motivational regulation of infant-care

Entstehung und Alter des Erdfalls "Seeloch" bei Bad Hersfeld (Nordhessen)

Der Erdfall „Seeloch" bei Bad Hersfeld ist ein etwa kreisrunder Einbruch im Buntsandstein mit einem Durchmesser von ca. 80 m, der auf Subrosionsvorgänge lm Zechsteinsalinar zurückgeführt wird. Einbrüche dieser Art sind typisch für Salzhänge, wie an anderen Beispielen gezeigt wird. Kaminartige Durchbrüche durch mehrere hundert Meter mächtiges Deckgebirge können nur entstehen, wenn eine vorgegebene Klüftung vorhanden ist. Ähnliche Erscheinungen sind über Lösungshohlräumen beobachtet worden, die beim Absaufen von Kaliwerken entstanden. Erfahrungen aus dem Salinenbetrieb zeigen, daß auch im Steinsalz größere Hohlräume längere Zeit existieren können, ohne daß es zu Bodensenkungen oder Erdfällen kommt. Die Sedimente des „Seeloch" sind palynologisoh und stratigraphisch bearbeitet worden. Das besondere Ergebnis dieser Untersuchungen ist daß Interglazial-Alter (Riß-Würrn) des Profilabschnittes. Die bisher untersuchten Salzauslaugungssenken enthalten Ablagerungen des Tertiärs, Altpleistozäns oder des Holozäns. Aus den Korrosionssenken des nordöstlichen Hessens waren bisher nur kohlig-torfige Ablagerungen bekannt geworden, die ein oberpliozänes bis altpleistozänes oder postglaziales Alter haben. Mit den Schichten aus dem "Seeloch" von Kathus werden erstmals Ablagerungen beschrieben, für die ein eemzeitliches Alter (Riß-Würm-Interglazial) wahrscheinlich ist.The collapse sink "Seeloch" near Bad Hersfeld (Northern Hesse) is a type of cylindrical collapse with small diameter (80 m) that is frequently found in the area of "Salzhang" (solution edge) where subsurface solution of the Zechstein halite is still continuing. Generally speaking, those pipe-like phenomena are more typical for deep-seated gypsum karst. Collapse sinks of this type can only originate when the overlying Buntsandetein is fractured and can break down along more or less vertical planes. Similar collapses at tbe surface occurred potish mines were floaded. Experiences from centuries-old solution mining show that larger hollows in halites can be stable without any subsidence occurring at The surface. The Sediments from the "Seeloch" were submitted to palynologiod und stratigraphical investigations. The important result of these investigations is the interglacial (Riß-Würm) of the profile section. All other subsidence area caused by subterranean solution of halites produced sediments of tertiary or of older pleistocene and holoceno age