Rapid and selective capture of nucleic acids using carbon nanotubes

Gene therapy is raising as one of the most promising options for treating genetic and acquired disorders. However, recombinant plasmid DNA (pDNA) must be recovered from complex extracts with a diversity of biomolecules that share similar characteristics and properties. Moreover, those biomolecules can cause immunogenicity, and their removal is a fundamental prerequisite in preparing high-purity, stable, and biological active pDNA for therapeutic application. To respond to this challenge and isolate pDNA from complex extracts, a promising alternative is proposed, based on using carbon nanotubes (CNTs). In recent years, biological applications of CNTs have been explored, motivated by their interesting size, shape, structure, biocompatibility, and high affinity for biomolecules. In this work, an effective method to isolate pDNA was developed, using multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) to capture proteins and other contaminating nucleic acids, like RNA and genomic DNA (gDNA). MWCNTs with different diameters were evaluated, while mixtures of RNA and pDNA were prepared to address the selectivity of the material. The results of this work evidenced the ability of MWCNTs to capture RNA from complex samples, enabling the clarification of pDNA. The results also demonstrated that MWCNTs can reduce the amount of impurities in the first cycle of extraction, reducing about half of the proteins, and significantly reducing the levels of genomic DNA in solution, with a pDNA recovery rate of 86%. When performing up to three consecutive cycles, the purity of soluble pDNA can be significantly improved. To further reduce the environmental impact of this technology, the possibility of recycling CNTs has also been confirmed, as well as it was assured the safety on their use by verifying the biocompatibility of this material. Thus, attained results demonstrate the development of a simple, efficient, and reliable method for rapid purification of pDNA biopharmaceuticals.A terapia genética tem-se destacado como uma das opções mais promissoras para o tratamento de doenças genéticas e adquiridas. Para isso, o DNA plasmídico recombinante (pDNA) deve ser recuperado de extratos complexos cuja composição compreende uma alta diversidade de biomoléculas que partilham características e propriedades semelhantes. Além disso, estas biomoléculas podem causar imunogenicidade, aquando da administração, sendo a sua remoção um pré-requisito fundamental na preparação de pDNA estável, de alta pureza e biologicamente ativo para aplicação terapêutica. Consequentemente, a purificação de pDNA é um processo muito dispendioso para a indústria farmacêutica, e apresenta também um grande impacto para o ambiente, devido ao uso de solventes orgânicos e sais. Para responder a este desafio e isolar o pDNA de extratos complexos, é proposta uma alternativa promissora, baseada no uso de nanotubos de carbono (CNTs). Devido à sua versatilidade, os CNTs têm sido amplamente explorados em diversas áreas, sendo que, as suas propriedades únicas, como o tamanho, forma, estrutura, biocompatibilidade e elevada afinidade por biomoléculas levaram a que nos últimos anos tenham também ganho muita relevância para aplicações biológicas. Neste âmbito, o presente trabalho descreve o desenvolvimento de um método eficaz para isolar o pDNA a partir de um lisado complexo de Escherichia coli, utilizando nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNTs) para capturar proteínas e outros ácidos nucleicos contaminantes, como RNA e DNA genómico (gDNA). Primeiramente, foram avaliados diferentes diâmetros de MWCNTs (<10 nm, <10/20 nm, 20/40 nm, 60/100 nm), paralelamente à realização de ensaios de screening de adsorção e de desorção de RNA. Misturas de RNA e pDNA foram também preparadas de forma a estudar a potencial seletividade na separação destas duas biomoléculas por parte dos MWCNTs. A captura de outros contaminantes foi avaliada através da aplicação de amostras mais complexas provenientes de lisado de E. coli aos MWCNTs, seguida pela quantificação das proteínas e do gDNA presentes na amostra. Para reduzir ainda mais o impacto ambiental desta tecnologia, a possibilidade de reciclagem e reutilização dos MWCNTs foi também estudada. Os resultados deste trabalho evidenciaram a capacidade dos MWCNTs em capturar com alguma seletividade o RNA de amostras complexas, possibilitando a clarificação rápida do pDNA. Os resultados também demonstraram que os MWCNTs podem reduzir a quantidade de impurezas no primeiro ciclo de extração, reduzindo cerca de metade das proteínas, e reduzindo também significativamente os níveis de gDNA em solução, com uma taxa de recuperação de 86% de pDNA. Após 3 ciclos consecutivos, a pureza do pDNA solúvel aumentou significativamente. Por último, e de forma a averiguar a biossegurança na utilização dos MWCNTs, foi avaliada também a sua toxicidade em linhas celulares humanas, ao longo de 48 h. Através deste ensaio, ficou comprovado que os MWCNTs não apresentam qualquer toxicidade para as linhas celulares usadas, nomeadamente fibroblastos humanos. Assim, os resultados obtidos demonstram que foi possível desenvolver um método simples, eficiente e confiável para a purificação rápida de pDNA

Medição da qualidade de vida de insuficientes renais crónicos: criação da versão portuguesa do KDQOL-SF

A insuficiência renal é uma doença crónica, que acarreta imensas alterações e desafios na vida diária destes doentes e que constitui uma companhia perpétua. O objectivo último do tratamento desta doença, não só deve ser prolongar a vida do doente — utilizando se necessário terapias de substituição da função renal — mas também proporcionar um maior grau de reabilitação com a melhor qualidade de vida possível. A qualidade de vida relacionada com a saúde e a percepção do estado de saúde estão, assim, associados a um mais alto nível de bem-estar e de satisfação dos indivíduos e, também, a uma melhor adaptação às circunstâncias e a uma maior rentabilidade, contribuindo para uma menor morbilidade e, consequentemente, menor despesa. Por outro lado, é imprescindível a introdução da avaliação da qualidade de vida como indicador positivo dos cuidados de saúde, sendo fundamentais e imprescindíveis as percepções dos indivíduos sobre a sua própria saúde. Em Portugal, alguns profissionais sentiam a necessidade de um instrumento de medição que avaliasse a qualidade de vida relacionada com a saúde em insuficientes renais crónicos em diálise, através de um instrumento de medida específico de percepção e que, simultaneamente, efectuasse uma avaliação geral da saúde. Daí a pertinência em procurar validar para a língua e cultura portuguesas o KDQOL-SF, Kidney Desease Quality of Life, um instrumento que nos pareceu o mais adequado do ponto de vista de construção, conteúdo e tempo de aplicação. O objectivo desta comunicação é apresentar os resultados dos processos de tradução, adaptação cultural e validação da versão 1.3 do instrumento KDQOL-SF de medição de qualidade de vida de insuficientes renais crónicos. Este questionário é composto por perguntas agregadas em onze dimensões específicas de doentes renais em fase terminal (componente ESRD) e oito dimensões genéricas de estado de saúde (componente SF). O questionário foi traduzido para português, tendo sido adoptada a metodologia de tradução-retroversão. Posteriormente, foram constituídos dois painéis, um com um revisor clínico, e outro constituído por cinco pessoas com insuficiência renal crónica em hemodiálise, a quem foi feito um teste de compreensão. Para testar a fiabilidade do instrumento de medição tiveram-se em conta os conceitos de estabilidade intertemporal e de coerência interna. Assim, numa amostra de 26 pessoas com insuficiência renal crónica em tratamento dialítico, os valores das correlações entre duas avaliações consecutivas foram altos e positivos, variando entre 0,71 para a função cognitiva e 0,98 para o apoio social. A coerência interna ou homogeneidade de conteúdo foi testada através do α de Cronbach, em que se obtiveram resultados superiores a 0,70, com excepção da actividade profissional (0,69), do peso da doença renal (0,65) e da qualidade da interacção social (0,36). A validade de conteúdo foi garantida através dos resultados de ambos os painéis utilizados e a validade de construção pelas relações lógicas entre as variáveis e pelas correlações entre as dimensões. Verificou-se também uma associação linear positiva entre todas as dimensões das componentes ESRD e SF, o que garantiu a validade de critério. Foi desenvolvido posteriormente um estudo não experimental, transversal, descritivo, numa amostra de 231 pessoas com insuficiência renal crónica, que efectuavam tratamento dialítico no nordeste transmontano. Os resultados desta investigação demonstram a influência de diversas variáveis na qualidade de vida dos insuficientes renais crónicos em diálise, como sejam o tipo de admissão, as variáveis sociodemográficas (género, idade, nível de instrução, situação familiar, situação profissional, rendimento, área de proveniência e religião) e clínicas (tipo de tratamento, tempo de tratamento, doenças associadas e complicações). O presente estudo das características psicométricas da versão portuguesa do KDQOL-SF, permite que esta versão possa ser considerada certificada na sua tradução, adaptação cultural e validação para a língua portuguesa e para Portugal

Convection diffusion and reaction : bridging scales in science and engineering

Tese de doutoramento. Engenharia Química e Biológica. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 201

Medição da qualidade de vida de insuficientes renais crónicos: criação da versão portuguesa do KDQOL-SF

O objectivo deste artigo é apresentar os resultados dos processos de tradução, daptação cultural e validação da versão 1.3 do instrumento KDQOL-SF de medição de qualidade de vida de insuficientes renais crónicos. Este questionário é composto por perguntas agregadas em onze dimensões ESRD específicas de doentes renais em fase terminal e oito dimensões SF genéricas de estado de saúde. O questionário foi traduzido por dois tradutores independentes, de inglês para português. De seguida, realizou-se um painel intermédio, de onde resultou uma tradução de consenso, da qual foi efectuada uma retroversão, de português para inglês. Foi realizada uma nova reunião, em que a retroversão foi comparada com a versão original, dando origem a uma versão intermédia. Posteriormente, foram constituídos dois painéis, um com um revisor clínico, e outro constituído por cinco pessoas com insuficiência renal crónica em hemodiálise, a quem foi feito um teste de compreensão. O questionário foi bem aceite, considerado claro e de fácil compreensão pelos doentes. Para testar a fiabilidade do instrumento de medição tiveram- se em conta os conceitos de estabilidade intertemporal e de coerência interna. Assim, numa amostra de 26 pessoas com insuficiência renal crónica em tratamento dialítico, os valores das correlações entre duas avaliações consecutivas foram altos e positivos, variando entre 0,71 para a função cognitiva e 0,98 para o apoio social. A coerência interna ou homogeneidade de conteúdo foi testada através do α de Cronbach, em que se obtiveram resultados superiores a 0,70, com excepção da actividade profissional (0,69), do peso da doença renal (0,65) e da qualidade da interacção social (0,36). A validade de conteúdo foi garantida através dos resultados de ambos os painéis utilizados e a validade de construção pelas relações lógicas entre as variáveis e pelas correlações entre as dimensões. Verificou-se também uma associação linear positiva entre todas as dimensões do ESRD e do SF, o que garante a validade de critério. O estudo das características psicométricas do KDQOL-SF permite a utilização deste instrumento para a população portuguesa, quer na investigação científica quer na prática clínica

A medição de preferências em saúde na população portuguesa

Introdução: um tema estudado pelos investigadores da economia da saúde é a medição da qualidade de vida relacionada com a saúde, em especial captando as preferências dos indivíduos em relação a determinados resultados em saúde. Este tipo de medição permite a sua incorporação em modelos de decisão clínica, de planeamento e de políticas de saúde. Nos últimos anos, têm sido desenvolvidos instrumentos genéricos de avaliação dos estados de saúde baseados na teoria multi-atributo de utilidade, fáceis de aplicar e que permitem o cálculo dos valores de utilidade que os indivíduos atribuem aos estados de saúde, como os questionários EuroQol (EQ-5D), Health Utilities Index (HUI) e o SF-6D. Métodos: com base numa amostra aleatória da população activa portuguesa residente no continente e formada por 2459 indivíduos, obteve-se a preferência dos portugueses em relação ao seu estado de saúde e qualidade de vida e calcularam-se os respectivos valores normais para Portugal continental. Foi utilizada a versão portuguesa do instrumento de medição SF-6D e o algoritmo econométrico desenvolvido por Brazier, para a geração de valores de utilidade, para os diversos estados de saúde. Resultados: o valor médio da utilidade obtido pelo SF-6D para toda a população foi 0,697, variando de 0,30 a 1,00 e associado a um desvio padrão de 0,143. Níveis mais elevados de défice foram encontrados nas dimensões «desempenho », «dor», «saúde mental» e «vitalidade». Valores mais baixos de utilidade foram apresentados pelas mulheres e pelos idosos. Os indivíduos com níveis mais baixos de instrução, a viver em áreas rurais, trabalhadores manuais e os viúvos, divorciados e separados apresentaram, em geral, também valores mais baixos de utilidade. Em relação às doenças crónicas, a utilidade média variou de 0,56 para os enfartes do miocárdio a 0,66 correspondente à hepatite. Conclusão: deste estudo conclui-se que o instrumento de medição SF-6D é útil e efectivo na medição da qualidade de vida relacionada com a saúde na comunidade. As normas portuguesas são úteis para contextualizar os valores obtidos pelo SF-6D, sempre que aplicado a doentes ou mesmo a indivíduos portugueses saudáveis

Avaliação psicométrica e adaptação cultural e linguística de instrumentos de medição em saúde: princípios metodológicos gerais

Com este documento de trabalho pretendemos estabelecer critérios de avaliação de instrumentos de medição em saúde que possam ser reconhecidos pela comunidade científica, pelos prestadores de cuidados em saúde e pelos políticos da saúde. Tratando-se de especificações de natureza psicométrica e prática, o reconhecimento de dois instrumentos aparentemente com o mesmo objectivo não implica necessariamente que os resultados sejam idênticos. É também importante frisar desde o início que o peso relativo de um determinado critério depende da aplicação que lhes está subjacente. Assim, se o nosso objectivo na aplicação do instrumento de medição é a comparação entre dois ou mais grupos, os critérios mais relevantes não são necessariamente os mesmos do que quando pretendemos, por exemplo, avaliar a estabilidade intertemporal das avaliações de um grupo ou mesmo prever estados no futuro. Neste trabalho começamos por apresentar aspectos conceptuais e de modelos de medição necessários a ter-se em conta quando procedemos quer à criação de novos instrumentos de medição quer à adaptação de instrumentos já existentes noutras culturas. De seguida, debruçar-nos-emos sobre os aspectos psicométricos da medição. Assim, falaremos de fiabilidade, dos vários tipos de validade e consequentes formas de teste e, finalmente, dos poderes de resposta e de interpretação que é possível associar aos instrumentos de medição. Depois destes aspectos psicométricos, trataremos alguns aspectos de natureza prática como a avaliação do peso quer para o respondente quer para a aplicação do instrumento de medição para além de outras formas alternativas existentes de aplicação. Por fim, serão apresentadas as várias equivalências necessárias a uma boa adaptação cultural e linguística dos instrumentos de medição em saúde

Qualidade de vida em diálise

Este artigo pretende descrever e comparar a qualidade de vida relacionada com a saúde nas pessoas com insuficiência renal crónica em diálise de acordo com os diferentes tipos de admissão. Foi desenvolvido um estudo não experimental, transversal e descritivo numa amostra de 231 pessoas com insuficiência renal crónica, conforme o tipo de admissão à diálise e que efectuavam tratamento dialítico no nordeste transmontano. Utilizou-se o instrumento de medição KDQOL constituído por uma medida genérica de saúde — o SF-36 — e uma específica deste quadro clínico — o ESRD. Dos participantes estudados, a maioria era do sexo masculino (56,3%), casados (68,4%), reformados ou pensionistas (84,9%), provenientes de zona rural (67,4%) e com um nível de instrução básico ou inferior (89,1%). A idade dos respondentes variou entre os 18 e os 88 anos, com uma média de 61,6 anos e uma mediana de 65 anos. O tempo de diálise destes doentes foi entre 15 dias e 24 anos e o tipo de tratamento mais prevalente foi a hemodiálise (94,8%). A maior parte dos doentes apresentou outras doenças associadas (56,3%) e complicações (91%), tendo sido a diabetes a doença associada mais referida (26,4%) e o cansaço (69,7%), as mãos e pés adormecidos (58,9%), as cãibras (54,5%), as dores musculares (52,4%) e a comichão (51,5%), as complicações mais assinaladas. Os doentes com admissão programada para diálise apresentaram uma qualidade de vida mais satisfatória do que os admitidos de forma urgente, com diferenças estatisticamente significativas na actividade profissional, no desempenho físico, no desempenho emocional, na função social e na vitalidade. Os resultados evidenciaram também um impacto negativo de algumas variáveis sócio-demográficas e clínicas. Nesta investigação é reconhecida a importância da avaliação da qualidade de vida relacionada com a saúde, como um indicador de excelência dos cuidados de saúde, reflectindo a voz do utente

The impact of non-monetary factors on the primary care utilization in Portugal. Finite mixture models applied to on-site and truncated samples

In the Portuguese National Health Service (NHS) patients have to pay a co-payment of 2€ to visit a GP in the health centres. Therefore, the monetary price associated to each visit is low and, with a high probability, is not a factor that affects the utilization of consultations in health centres. On the other hand, in any health system in which the monetary cost to consume medical care is very low other kind of costs can emerge as determinants of medical care utilization. The Portuguese NHS suffers from several time-related inefficiencies and so, the non-monetary form of co-payment is a non negligible reality. With data in our database we have concluded that the average waiting time to visit a GP is approximately 9 days. Moreover, the average waiting time in the waiting room for a consultation is approximately 1 hour. Therefore, this study aims at analysing the impact of non-monetary factors on the utilization of public GPs. This study can be useful for policy making, as well as for econometric reasons. In the other hand, sometimes the empirical researcher faces non-random samples. So, modelling based on the assumption that we have a simple random sample can be inappropriate and misleading. In this research we face this same situation. Our data resulted from the application of two endogenous sampling schemes: a sample collected on-site and a truncated sample. Therefore each sampling scheme generates a selected sample. Thus, to make valid inference, adequate econometric modelling has to be used. To model our dependent variable, number of visits, and to take into account the unobserved heterogeneity, we relied on a semi-parametric specification through the use of finite mixture models. The data were obtained from the Europep questionnaire, a standardized questionnaire designed to measure primary patient satisfaction in European countries

Teste de dependência à nicotina: validação linguística e psicométrica do teste de Fagerström

O Teste de Fagerström para a Dependência da Nicotina tem uma utilização generalizada como medida da dependência tabágica. No entanto, a sua versão portuguesa nunca tinha sido sujeita a um processo de equivalência linguística e semântica nem a testes psicométricos de qualidade. Esse foi o objectivo do presente estudo. A adaptação cultural e linguística incluiu a utilização da técnica de tradução-retroversão, precedida de uma definição conceptual e seguida de testes piloto e de uma revisão final. Para validar a versão portuguesa obtida na fase anterior, foram recolhidas amostras compostas pelos fumadores que acorreram a consultas de Medicina no Trabalho e a consultas de Pneumologia e de Desabituação Tabágica, num total de 264 fumadores. A fiabilidade teste-reteste foi garantida por valores de correlação da escala original de 0,990 e das perguntas individuais de 0,975 a 1,000. O valor de alfa de Cronbach de coerência interna foi 0,660, valor baixo em relação aos valores padrão tradicionais, mas superior ao valor encontrado pelos autores e semelhante aos encontrados em outros estudos. O teste de validade de critério obteve bons resultados ao compararem-se os valores obtidos pela escala com algumas variáveis relacionadas com o hábito tabágico e com a própria auto-avaliação da dependência tabágica. A validade de construção através de análise factorial explicou 59% da variância e detectou dois factores referentes ao consumo de cigarros e ao fumo matinal. Em conclusão, algumas dúvidas persistem em relação à continuação da utilização do Teste de Fagerström para a Dependência Tabágica. Consideramos que os profissionais e os investigadores não devem confiar apenas nos resultados desta escala e devem incluir outras perguntas sobre a adição, não pertencentes à versão original

Universal Health Coverage, Long-Term Care, and Funding in an Aging Era

Universal health coverage has been gaining a wider attention since the beginning of the 2000s, and it has become an ideological reference for health systems across the world. Funding universal health coverage has been a major challenge faced by governments. Not only funding has to be efficient to guarantee people’s access to health services when they are needed, but also it has to ensure equity across people in the country. Aging implies a new constraint to funding as more people contribute less to the collection of financial revenues and more people are in need of healthcare, due to morbidity and end-of-life needs. This chapter aims to present the concept of universal health coverage and LTC and also to discuss how it may be financed under the current scenario of demographic aging and increasing demand for long-term care