Knowledge-centered culture and knowledge sharing: the moderator role of trust propensity

Purpose: This research aims to evaluate if knowledge-centered culture (KCC) fosters knowledge sharing equally across employees with different levels of trust propensity, an enduring individual characteristic. Design/methodology/approach: A cross-sectional questionnaire study was conducted with 128 US-based employees. Findings: The authors found that KCC only promoted knowledge sharing in individuals with high levels of trust propensity. For individuals with low levels of trust propensity, KCC had no effect on knowledge sharing. Research limitations/implications: The authors focused exclusively on trust propensity as a moderator. Future research could analyze the role of other enduring individual differences in the relationship between KCC and knowledge sharing. Practical implications: A KCC may be inefficient in promoting knowledge sharing in employees with low propensity to trust. Recruitment and selection of individuals with a high propensity to trust is a possible solution to enhance the association between KCC and knowledge sharing in organizations. Originality/value: By identifying an enduring individual characteristic that shapes the relationship between KCC and knowledge sharing, the authors move toward the development of a contingent view of KCC and show that KCC fosters knowledge sharing differently across employees

Mechanical Performance Optimization of Bonded Composite Patch Repairs: a flexural analysis

The effect of the stacking sequence ([0,90,0,90,0,90]S or [90,0,90,0,90,0]S) and patch size (30, 40 or 60 mm) were studied, as well as the notch sensitivity of the parent plate to a 20 mm diameter hole. For this purpose, quasi-static three-point bending tests were performed to evaluate the bending stiffness and load-carrying capacity of the repaired structure. The FE numerical analysis was validated. The specimens were also low-velocity impacted in order to evaluate the influence of the studied variables in the damage mechanisms and residual properties. The specimens tested in three-point bending fatigue to verify the tendency of the fatigue effects depending on the patch dimensions. It was observed that the parent laminate, for both stacking sequences, is notch sensitive according to the studied conditions. For the specimens with 0º outermost ply, the 60 mm patch was revealed as an effective repair as its mechanical properties were restored. However, none of the studied patch sizes were considered as a valid repair for the 90º specimens. The impact damaged relative area, caused by an energy level of 12J, was inversely proportional to the increase of patch size,for both orientations, as the 60 mm patch presented a damage under 25% of the overall patch area, while the 30 and 40 mm presented damage in 38 to 50% of the overall patch area. The fatigue degradation, when exposed to fatigue loading, was found to be proportional to the patch size, as the 30 mm patches for both laminate types presented longer life cycles, 3933 for the 0º specimens and 6599 for the 90º cycles, while for the other patch sizes the maximum of life cycles were around 1667. The overall damage mechanisms were found to be consistent for the quasi-static and dynamic tests, as for the 0º specimens the ultimate failure was found to be the interlaminar delamination in the patch and, for the 90º specimens, the delamination was verified in the outermost ply of the parent laminate, due to the patch and adhesive pulling the ply yarns oriented at the transverse direction. Finally, the adhesive was proven not to be the weakest link in any of the repairs, as the failure damage was always verified in one of the composite laminates.Os efeitos da sequência de empilhamento ([0,90,0,90,0,90]S ou [90,0,90,0,90,0]S) e das dimensões do remendo (30, 40 ou 60 mm) foi estudada, tal como a sensibilidade do laminado de controlo ao furo de 20 mm de diâmetro. De forma a compreender estes efeitos, testes quase estáticos de flexão em três pontos foram desenvolvidos para avaliar a rigidez à flexão e capacidade de carga das amostras reparadas. Os espécimes foram impactados a baixa velocidade com o objetivo de estudar a influência das variáveis estudadas relativamente ao dano e propriedades residuais. Foram dinamicamente testados em testes de fadiga com flexão em três pontos para verificar a tendência dos efeitos de fadiga dependendo das dimensões do remendo. A análise numérica de elementos finitos foi validada. Verificou-se que os laminados de controlo, para ambas as sequências, são sensíveis ao furo de acordo com as condições estudadas. Para as amostras com orientação 0º (identificação relativa à orientação da camada mais externa dos laminados), o remendo de 60 mm revelou-se como uma reparação eficaz, já que as propriedades mecânicas originais foram restituídas. Nenhum dos remendos estudados foram considerados como sendo reparações válidas para as amostras de 90º. O dano obtido por impacto, com uma energia de 12J, foi inversamente proporcional ao aumento do tamanho do remendo, para as duas sequências, visto que o remendo de 60 mm apresentou dano em menos de 25% da sua área total. A degradação por fadiga, por ação de cargas de fadiga, mostrou-se proporcional às dimensões do remendo, sendo que o remendo de 30 mm apresentou o maior número de ciclos de vida, para ambas as orientações. Os mecanismos de dano gerais foram consistentes para os testes quase estáticos e dinâmicos, sendo que os nos espécimes 0º a rutura final foi a delaminação interlaminar no remendo e, para os laminados 90º, a delaminação verificou-se na lamina externa do laminado de controlo, devido à ação do remendo e adesivo a arrancar fibras dessa mesma lamina na direção transversal. Por último, foi provado que o adesivo não representa o elemento mais fraco em nenhuma das reparações, sendo que a falha ocorreu sempre em um dos laminados.This Master Dissertation has been supported by the project Centro-01-0145-FEDER- 000017-EMaDeS- Energy, Materials and Sustainable Development, co-financed by the Portugal 2020 Program (PT 2020), within the Regional Operational Program of the Center (CENTRO 2020) and the European Union through the European Regional Development Fund (ERDF)

The Impact of Very Short-term Variability of Blood Pressure in Outcome after Successful Thrombectomy

Objetivos: Determinar se a variabilidade da pressão arterial a muito curto prazo após trombectomia mecânica eficaz em doentes com acidente vascular cerebral (AVC) isquémico tem um impacto relevante no prognóstico clínico destes doentes. Métodos: Este é um estudo prospectivo com inclusão consecutiva de doentes com AVC isquémico por oclusão de vasos da circulação intracraniana anterior, que realizaram trombectomia mecânica e atingiram recanalização completa (modified Treatment In Cerebral Ischemia graus 2b-3). A variabilidade da pressão arterial foi avaliada por análise espectral das oscilações espontâneas da pressão arterial sistólica no período pós trombectomia. Os outcomes avaliados foram a independência funcional aos 90 dias (escala Rankin modificada 0-2) e a resposta clínica inicial à trombectomia mecânica. Resultados: Foram incluídos 121 doentes. O aumento da variabilidade da pressão arterial a altas frequências (oscilações rápidas) mostrou-se independentemente associado a pior outcome funcional aos 90 dias (unidades normalizadas, odds ratio (OR) = 0.56, 95% intervalo de confiança (CI) 0.35 - 0.88, p=0.01; rácio baixas/altas frequências OR = 0.67, CI 0.46 - 0.98, p=0.04) em análise multivariada. Conclusão: A magnitude das oscilações rápidas da pressão arterial tem um impacto significativo na recuperação neurológica precoce e outcome funcional tardio nos doentes com AVC isquémico após recanalização completa. A variabilidade da pressão arterial a muito curto prazo pode ser avaliada rapidamente durante o período pós-intervencional e contribuir potencialmente para um controlo da pressão arterial mais eficaz nestes doentes, com um impacto prognóstico importante.Background and Purpose: We aim to determine if the very short-term blood pressure variability (BPV) after successful endovascular treatment of acute ischemic stroke has a relevant impact in the clinical outcome. Methods: This is a prospective multicenter study with inclusion of consecutive AIS patients with occlusion of intracranial anterior circulation vessels who achieved successful recanalization (modified Treatment In Cerebral Ischemia grades 2b-3) after thrombectomy. Very short-term BPV was assessed by spectral analysis of spontaneous fluctuations of beat-to-beat systolic blood pressure values recorded by finger plethysmography with Finometer device. Outcomes included independence at 90 days (modified Rankin scale 0-2) and the initial clinical response to mechanical thrombectomy. Results: We included 121 patients. Increased BPV at high frequencies (rapid oscillations) was independently associated with poor functional outcome at 90 days (normalized units, odds ratio (OR) = 0.56, 95% confidence interval (CI) 0.35 - 0.88, p=0.01; low/high frequency ratio OR = 1.38, CI 1.09 - 1.76, p<0.01) and early neurological recovery (normalized units, OR = 0.67, CI 0.46 - 0.98, p=0.04) in multivariate analysis. Conclusions: The magnitude of rapid oscillations of blood pressure has a significant impact in early neurological recovery and late functional outcome of ischemic stroke patients after successful recanalization. Very short-term BPV can be assessed quickly throughout the post intervention period and potentially contribute to a more efficient blood pressure control in AIS patients submitted to endovascular treatment

Equity research report: Corticeira Amorim SGPS, S.A.

Projeto de mestrado em Management (specialisation in General Management)O presente projeto consiste num relatório de avaliação da empresa portuguesa Corticeira Amorim SGPS, S.A., desenvolvido utilizando informação publicamente disponível. O principal objetivo do relatório é chegar a um preço-alvo para as ações da empresa para o final de 2023 e fornecer uma recomendação de investimento. Fundada originalmente em 1870 como uma fábrica de produção de rolhas de cortiça, a Corticeira Amorim é, atualmente, o maior fabricante de cortiça do mundo, liderando o sector e contribuindo para a inovação da indústria da cortiça e para economia de uma forma incomparável. As rolhas de cortiça continuam a ser o seu principal negócio, mas a empresa opera em quatro outros segmentos: Matérias-Primas, Revestimentos, Aglomerados Compósitos e Isolamentos. Com um capital social de 133 milhões de euros, a Corticeira Amorim está cotada na bolsa de valores de Lisboa desde 1988 e é uma das empresas integradas no PSI20. O principal método utilizado para realizar a avaliação foi um Modelo de Fluxos de Caixa Atualizados, começando por calcular os fluxos de caixa libertos para a empresa até 2027 e descontando os ao custo de capital, chegando um valor intrínseco da ação de 10,94€ para o final de 2023, o que equivale a uma valorização de 25% em relação ao preço de 8,72€ ao qual estava a ser transacionada a 30 de dezembro de 2022. Considerando a valorização de 25% no valor da ação e a liderança da Corticeira Amorim no sector, este relatório representa uma recomendação para comprar as ações da empresa, e o investimento é avaliado como sendo de risco médio.This project consists of an Equity Research Report of the Portuguese company Corticeira Amorim SGPS, S.A., developed using only publicly available information. The main goal of the report is to perform a valuation of the company to arrive at a price target for its shares for the end of 2023 and provide outsiders with an investment recommendation. Founded in 1870 as a cork stopper factory, which is still its primary business, Corticeira Amorim is now the biggest cork manufacturer in the world, leading the cork sector, and contributing to the innovation of the cork industry and the economy in an incomparable way. In addition to cork stoppers, the company works in four other segments: Raw-Materials, Floor and Wall Coverings, Composite Cork, and Insulation Cork. With a share capital of 133 million euros, Corticeira Amorim has been listed in Euronext Lisbon since 1988 and is part of PSI20. The main method used to carry out the valuation is a Discounted Cash Flows Model, by calculating the free cash flows to the firm (FCFF) until 2027 and discounting them at the weighted average cost of capital (WACC), reaching a price target of €10.94 for the 2023-year end, equivalent to a 25% upside from the €8.72 share price of December 30th, 2022. Considering the 25% upside and Corticeira Amorim’s leadership in the industry, this report supports a buy recommendation, and the investment is assessed as medium risk

Effects of a large irrigation reservoir on aquatic and riparian plants: a history of survival and loss

Dammed rivers have unnatural stream flows, disrupted sediment dynamics, and rearranged geomorphologic settings. Consequently, fluvial biota experiences disturbed functioning in the novel ecosystems. The case study is the large irrigation reservoir Alqueva in Guadiana River, Southern Iberia. The study area was divided into three zones: upstream and downstream of the dam and reservoir. For each zone, species composition and land use and land cover (LULC) were compared before and after the Alqueva Dam implementation. Data consist of aquatic and riparian flora composition obtained from 46 surveys and the area (%) of 12 classes of LULC obtained in 90 riverine sampling units through the analysis of historical and contemporary imagery. There was an overall decrease of several endemic species and on the riparian shrublands and aquatic stands, although di erences in the proportion of functional groups were not significant. Nevertheless, compositional diversity shows a significant decline in the upstream zone while landscape diversity shows an accentuated reduction in the reservoir area and downstream of the dam, which is likely related to the loss of the rocky habitats of the ‘old’ Guadiana River and the homogenization of the riverscape due to the irrigation intensification. The mitigation of these critical changes should be site-specific and should rely on the knowledge of the interactions between surrounding lands, ecological, biogeomorphologic, and hydrological components of the fluvial ecosystemsinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

Colite isquémica: fatores de risco, diagnóstico e prognóstico, em doentes submetidos a cirurgia

Berthelot Marcellin. Arrêté fixant la date de l'ouverture de la session d'examen pour les bourses des lycées et collèges de garçons. In: Bulletin administratif de l'instruction publique. Tome 41 n°738, 1887. p. 253

Retinoic acid in enteric lymphoid organogenesis

Tese de mestrado, Bioquímica , Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010O desenvolvimento embrionário é um período crítico da vida do indivíduo durante o qual são formados os sistemas biológicos essenciais à sua sobrevivência. Exemplo disso é o sistema linfóide dos mamíferos, sistema este que consiste numa rede de órgãos linfóides que são classificados em primários ou secundários. É de notar que ao longo da vida adulta outras estruturas linfóides denominadas “terciárias” podem ser formadas, o que acontece no caso de certas inflamações crónicas ou infecções persistentes. Enquanto os órgãos linfóides primários, tais como a medula óssea e o timo, são locais privilegiados onde ocorre o desenvolvimento das células hematopoiéticas; os órgãos linfóides secundários formam uma rede ao longo do corpo onde residem linhas celulares hematopoiéticas maduras. Os órgãos linfóides secundários incluem, entre outros, os nódulos linfáticos e as placas de Peyer. Estas estruturas são cruciais na iniciação de respostas imunes uma vez que providenciam as condições ideais que levam à activação, diferenciação e homeostasia dos linfócitos. Para o correcto desenvolvimento destes órgãos é necessária a expressão de diversos genes bem como a interacção entre diferentes tipos celulares. Durante o desenvolvimento dos nódulos linfáticos é necessária a interacção de células hematopoiéticas denominadas células indutoras do Tecido Linfóide (LTi) e de células mesenquimais designadas células organizadoras do Tecido Linfóide (LTo). Esta interacção celular conduz à maturação das células mesenquimais ou de estroma que por sua vez resulta na atracção de células LTi adicionais. Este “feedback” positivo resulta na formação do primórdio do nódulo linfático. O desenvolvimento das Placas de Peyer (PP) está bem caracterizado e, à semelhança dos nódulos linfáticos, requer interacções entre células hematopoiéticas e de estroma. No entanto, para além das células LTi e LTo, um outro tipo de células hematopoiéticas, denominado células iniciadoras do Tecido Linfóide (LTin) estão envolvidas neste tipo de interacções. O modelo correntemente proposto para o desenvolvimento das PP postula que as células LTin interagem inicialmente com as células LTo através do eixo de sinalização RET/ARTN. Este sinal inicial resultaria então na maturação inicial das células do estroma e consequente produção de quimiocinas que, por sua vez, atrairiam células LTi formando-se assim o cluster celular que está na origem do primórdio do órgão. Apesar dos paralelos existentes entre o desenvolvimento dos nódulos linfáticos e das PP, estas estruturas não utilizam exactamente os mesmos eixos de sinalização. No caso dos nódulos linfáticos as mais importantes vias de sinalização são TRANCE e Linfotoxina β (LTβ). Inicialmente a interacção entre os dois tipos celulares é feita através da expressão de TRANCE pelas células de estroma e do seu receptor pelas células LTi. Aquando desta interacção, ocorre a indução da expressão de LTαβ na superfície das células LTi. Por sua vez as células LTo são activadas através do receptor de LTβ expresso na superfície destas últimas. Esta activação induz a produção das quimiocinas CXCL12 e CXCL13 atraindo assim células LTi adicionais. No caso das placas de Peyer as vias de sinalização mais importantes são RET, IL-7R e LTβ. Pensa-se que é através da via de sinalização RET que ocorre a expressão de LTβ nas LTin, expressão esta que permite que ocorra a sua interacção com as células de estroma. À semelhança do que acontece nos nódulos linfáticos, esta interacção de ligando/receptor irá originar um “feedback” positivo, atraindo assim as células LTi para o local do cluster. Estas células por sua vez, através da sinalização dada pelo IL-7R, irão expressar LTβ como as células LTin e interagir finalmente com as células LTo. A análise de animais deficientes em certas vias de sinalização reforça também a ideia que o desenvolvimento dos nódulos linfáticos e das placas de Peyer não obedece exactamente aos mesmos princípios. A título de exemplo, ratinhos deficientes em TRANCE não possuem nódulos linfáticos uma vez que a maturação das células de estroma é deficiente, no entanto possuem placas de Peyer normais. Por outro lado, deficiências no receptor da quimiocina IL7 resultam no desenvolvimento de apenas alguns nódulos linfáticos, demonstrado que esta via é importante, mas não crucial, para o desenvolvimento destas estruturas linfáticas. Contudo, estes animais são totalmente desprovidos de placas de Peyer, provando que esta via é essencial para o desenvolvimento deste tipo de estruturas entéricas. É ainda de notar que a via de sinalização RET é apenas essencial para o desenvolvimento de placas de Peyer . Ratinhos deficientes nesta tirosina quinase apesar de desenvolverem nódulos linfáticos são totalmente desprovidos de placas de Peyer. O processo de desenvolvimento embrionário requer no sentido mais lato várias vias de sinalização, sendo exemplo disso a do ácido retinóico (RA). Recentemente, o ácido retinóico surgiu como uma das moléculas importantes no desenvolvimento dos nódulos linfáticos. Van Pavert et al. descreveram que o RA produzido por células nervosas, adjacentes a células de estroma, induzia nestas últimas a produção da quimiocina CXCL13. Desta forma, esta molécula parece estar envolvida no despoletar de uma retroacção positiva que origina o primórdio dos nódulos linfáticos. Uma vez que o ácido retinóico parece ser importante no desenvolvimento dos nódulos linfáticos, pretendemos determinar se esta via de sinalização é também importante para o desenvolvimento das estruturas linfóides entéricas, nomeadamente das Placas de Peyer. Com este intuito, inicialmente utilizámos ratinhos geneticamente modificados que permitem a visualização, análise e manipulação ex vivo de todas as subpopulações hematopoiéticas durante a organogénese linfóide. A utilização destes modelos permite a micro dissecção de estruturas linfóides secundárias no embrião e a purificação ex vivo de populações hematopoiéticas e mesenquimais genuínas em diferentes estádios de desenvolvimento. Em paralelo, através de estudos imunocitoquímicos e genéticos, verificámos que o intestino embrionário alberga não apenas células que exprimen RALDH1, enzima importante na síntese de RA, bem como células alvo de RA. Tendo em conta estes modelos e os resultados assim obtidos prosseguimos com os objectivos propostos. De modo a compreender a influência do RA na formação das estruturas linfóides entéricas utilizámos culturas de intestinos embrionários nas quais é possível colocar micro-esferas de agarose impregnadas com ácido retinóico. Neste sistema observámos que o RA induz a formação de agregados de células hematopoiéticas que por sua vez induzem a expressão de VCAM-1 em células de estroma, formando assim estruturas linfóides embrionárias atópicas. É de notar que a composição celular dos agregados celulares formados pela sinalização RA é idêntica à composição das estruturas formadas pela sinalização via RET, isto é, células LTi e LTin. Relevante também é a correlação destas duas vias de sinalização, que foi possível estudar com base em culturas de intestinos embrionários onde se bloqueou a via de sinalização do ácido retinóico, fornecendo simultaneamente a sinalização por RET. Este bloqueio diminuiu significativamente a eficiência de agregação celular pela sinalização RET. Por outro lado, na ausência de RET, a eficiência de agregação por RA não foi modificada. Estes resultados sugerem que a via de sinalização por RA actua independentemente de RET e desempenhara a sua função maioritariamente a montante de RET. Adicionalmente verificámos que, o RA não aparenta estar envolvido na motilidade das células hematopoiéticas durante a organogénese entérica linfóide. O ácido retinóico está directamente interligado com a produção de quimiocinas durante o desenvolvimento dos nódulos linfáticos. Uma vez que esta molécula parece ter um papel semelhante no desenvolvimento das PP, é plausível que estas quimiocinas também estejam envolvidas na sinalização de RA durante o desenvolvimento destas estruturas. Com este pressuposto em mente, foram analisadas por reacção quantitativa de polimerase em cadeia (qPCR) amostras celulares de intestino fetal estimuladas com ácido retinóico durante 24h. Esta análise revelou que nem CXCL12 nem CXCL13 estavam sobreexpressas após estimulação. De forma a confirmar este resultado foram feitas culturas de intestinos embrionários onde foi fornecido o sinal de ácido retinóico e bloqueadas as quimiocinas em questão. Os resultados obtidos vieram confirmar a conclusão anterior, demonstrando que CXCL12 e 13 não são importantes para a sinalização de RA no desenvolvimento das placas de Peyer. Contudo, uma vez que outras quimiocinas podem estar envolvidas no desenvolvimento destas estruturas, foram feitos ensaios de expressão genética a partir de amostras celulares entéricas estimuladas com ácido retinóico. Estes estudos revelaram que a via de sinalização pelo ácido retinóico resulta numa assinatura genética que difere da previamente descrita durante o desenvolvimento dos nódulos linfáticos, apontando para um possível papel na diferenciação das células hematopoiéticas. Em conjunto, estes resultados apontam para um papel do ácido retinóico no desenvolvimento das placas de Peyer. O ácido retinóico emerge então como uma nova molécula importante na organogénese destas estruturas.Secondary Lymphoid Organs (SLOs), such as Lymph Nodes (LN) and Peyer’s Patches (PP), are crucial structures for the initiation of immune responses. Several molecules are required for the development of these structures, namely Lymphotoxin and several chemokines, while the tyrosine kinase RET has been shown to play a key role in PP organogenesis. Retinoic Acid (RA) has recently emerged as an important player during LN development through induction of CXCL13 expression. Despite many similarities, LN and PP development differ in several aspects. Here we show that RA specifically induces clustering of enteric haematopoietic cells, and is sufficient to induce the maturation of sessile mesenchymal cells. Interestingly, both RET and RA induced clusters are similarly composed by LTi and LTin cells. This finding suggested that RA and RET signalling could participate in the same events during PP formation. However, haematopoietic clustering induced by ARTN was only marginally affected by RA signalling block and absence of RET signalling did not impact on RA mediated clustering. Altogether, these results suggest that RA acts independently and mainly precedes RET signals. Furthermore, and contrary to LN development, we show that chemokines such as CXCL12 and 13 are not upregulated in gut samples stimulated with RA, neither affect clustering efficiency by RA. Altogether these results suggest that during PP development RET and RA signals act mostly independently of each other and that enteric RA signalling leads to a genetic signature that differs from what was previously described during LN development. RA emerges as a novel molecule in PP organogenesis. We suggest that this pathway may be involved with other signalling pathways in the processes that underlie enteric lymphoid organ formation and haematopoietic differentiation. These hypotheses will be further discussed taking advantage of both in vitro and in vivo approaches

Evolutionary psychology and sexual dimorphism: the role of emotional expressions in male attractiveness

Há muito que a Psicologia Evolutiva tem estudado a atratividade em humanos. As três características mais estudadas pela sua desejabilidade na atratividade facial são: a simetria, a normalidade dos traços faciais e o dimorfismo sexual (ou marcadores hormonais). Sendo que as duas primeiras parecem ser suportadas pela literatura, o dimorfismo sexual tem-se mostrado alvo de dúvidas pelos resultados díspares entre os sexos. Dado que os traços faciais de dimorfismo sexual, em especial os mais masculinos, têm sido relacionados em estudos anteriores com a perceção de raiva, propomo-nos a estudar a influência das expressões emocionais nas preferências de masculinização/feminização de faces masculinas. Para isto, desenvolvemos uma tarefa interativa, em que mulheres heterossexuais puderam alterar os níveis de masculinização consoante as suas preferências de atratividade, sendo apresentadas faces masculinas que expressavam: raiva, felicidade e neutro. A nossa hipótese era que as participantes escolhessem masculinizar mais as faces com expressão de felicidade, já que isto iria contrariar a possível perceção de raiva em cara mais masculinas, em comparação com as faces neutras e com as faces com a expressão de raiva, respetivamente. No entanto, as participantes escolheram feminizar as faces independentemente da expressão emocional apresentada. Não foram encontradas diferenças significativas entre as condições, no entanto as participantes escolheram feminizar menos as caras com expressão de felicidade, indo um pouco ao encontro da nossa hipótese. Estes resultados sugerem que a relação entre a perceção de expressões emocionais e as preferências por características de dimorfismo sexual em faces masculinas é fraca ou nula

In vitro assessment of the oncogenic potential of novel MTC-associated germline RET mutations

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013Thyroid carcinoma is the most frequent endocrine malignancy. Medullary thyroid carcinoma (MTC) is one of the thyroid tumors and represents about 5 to 8% of all cases. It arises from C cells (parafollicular cells), in contrast with the other thyroid tumors that arise from follicular cells. MTC can occur either in a sporadic or hereditary form, being the latter associated to multiple endocrine neoplastic type 2 (MEN2) and familial MTC (FMTC). RET (rearrangement during transfection) encodes a membrane receptor tyrosine kinase that, when mutated, can originate MTC. The aim of this project was to evaluate, through in vitro functional experimental approaches, the oncogenic potential of two newly identified RET germinal variants detected in two MTC patients from our institution: RET C515T (RET missense alteration TGCTGG at codon 515 - Cys515Trp) and RET T636M (RET missense alteration ACGATG at codon 636 - Thr636Met. By expressing the novel RET variants in non-transformed NIH 3T3 mouse fibroblasts, and comparing their effect with wild-type RET, we were able to observe an increase of cell growth and proliferation, loss of contact inhibition and an increase in cell migration rate. All these are common characteristics of tumoral cells, indicating that these new RET variants hold some relevant transforming potential. This transforming potential is, nevertheless, low when compared to that of RET MEN2A- causing mutation, C634R, which is consistent with the mild phenotype, observed in the patients of this study, characterized by late onset and low aggressiveness. The functional characterization of these two new variants not only contributes to the understanding of the molecular mechanisms behind the development of MTC in these families, but also provides useful information to optimize the diagnostic and clinical management of hereditary MTC.Após um quarto de século de grandes avanços, a investigação na área da oncologia tornou-se rica e complexa, mostrando assim que o cancro é uma doença que envolve mudanças dinâmicas no genoma. Muitas evidências indicam que a tumorigénese em humanos é um processo com várias etapas, que reflete não só as alterações no genoma, mas também que levam a uma transformação progressiva de células normais em células derivadas altamente malignas. Carcinoma é qualquer tumor maligno que provenha de células epiteliais, e que pode originar metástases. Existem inúmeros tipos de carcinoma, sendo os carcinomas endócrinos um deles, abrangendo uma enorme variedade, tanto a nível do fenótipo como do genótipo. Os carcinomas da tiróide são o tipo de carcinomas endócrinos mais frequentes, e podem ser divididos em dois grandes grupos: os carcinomas da tiróide que provêm de células foliculares e os carcinomas da tiróide que provêm de células parafoliculares. Os carcinomas medulares da tiróide (CMT) representam cerca de 5 a 8% dos carcinomas da tiróide. Estes desenvolvem-se a partir de células C (células parafoliculares), enquanto os outros tipos de tumores desenvolvem-se a partir das células foliculares. Os carcinomas medulares podem ocorrer de forma esporádica (cerca de 75% do total dos casos) ou hereditária (cerca de 25%), sendo esta última associada a síndrome de neoplasia endócrina múltipla de tipo 2 (NEM2), subdividida em NEM2A e NEM2B, e CMT familiar (CMTF). Os carcinomas medulares da tiróide possuem uma enorme variedade, que podem ir de tumores com bom prognóstico, a carcinomas altamentes agressivos, com uma elevada taxa de mortalidade. Mutações no proto oncogene RET (Rearranjado durante a transfeção) estão na origem do desenvolvimento do carcinoma medular da tiróide. Este proto oncogene codifica para um recetor membranar com atividade de tirosina-cinase e está envolvido em várias vias de sinalização que controlam processos como a sobrevivência e proliferação celular, migração e angiogénese, entre outros. Os casos de CMTF estão geralmente associados a mutações pontuais a nível germinal no gene RET que podem ser mutações que afetam a região extracelular ou o domínio de tirosina-cinase deste recetor. Nos casos onde não existe qualquer mutação na proteína RET, as cisteínas extracelulares formam ligações de bissulfito intramoleculares, estabilizando o recetor na sua conformação monomérica. O domínio das cisteínas é altamente conservado e tem um papel importante na manutenção da estrutura secundária e terciária do domínio extracelular do RET, através destas ligações de bissulfito. Quando ocorre uma mutação que leva à perda de um resíduo de cisteína esta torna-se livre para formar uma ligação intermolecular com outro receptor mutado, ocorrendo assim a dimerização e fosforilação da proteína RET, tornando-a ativa, mesmo na ausência de ligandos. Assim, mutações ativadoras neste gene conduzem a uma ativação não-regulada destas vias, levando assim ao surgimento do fenótipo tumoral. Este trabalho tem como objectivo a realização de estudos funcionais in vitro para duas variantes germinais do proto-oncogene RET, não descritas na literatura, associadas a dois casos distintos de carcinoma medular da tiróide (referidos como paciente A e paciente B), tentando assim avaliar seu o grau de patogenicidade. A paciente A, sem evidência clínica na família de síndrome NEM2A/2B ou CMTF, foi submetida, aos 79 anos, a tiroidectomia total devido a um CMT unifocal. O teste genético ao gene RET identificou uma variante heterozigótica no codão 636 (ACGATG) no exão 11, que resulta na substituição do aminoácido treonina por metionina na região extracelular da proteína RET, designada por RET T636M. Apenas um membro da família desta paciente foi testado, a filha de 50 anos que apresentava bócio multinodular, tendo-se verificado ser negativa para esta variante. A paciente B tinha 60 anos à data do diagnóstico, tendo sido submetida a tiroidectomia total devido a CMT multifocal. O teste genético ao gene RET revelou uma variante germinal presente em homozigotia no exão 8, codão 515 (TGCTGG), que leva à substituição de uma cisteína por um triptofano no domínio extracelular da proteína RET, designada por RET C515T. O facto dos pais desta paciente serem primos em primeiro grau levou provavelmente a esta variante se apresentar em homozigotia. Esta variante foi também encontrada, apesar de em heterozigotia, em oito de dez familiares estudados. Nenhum destes apresentou qualquer sintoma sugestivo de CMT ou NEM2, exceto uma prima que também veio a desenvolver CMT aos 63 anos. O potencial oncogénico de uma variante pode ser estimado através de diversos ensaios funcionais in vitro, avaliando-se assim sua capacidade de transformação induzida pela mutação comparativamente com o controlo normal, sem mutação. Para estes estudos tem-se em conta as características específicas das células tumorais, que as distinguem das células normais, não transformadas. Para tal, utiliza-se normalmente a linha celular de fibroblastos de ratinho NIH 3T3, comercialmente disponível, sendo analisado o efeito da expressão exógena do péptido mutante nestas células. Antes de se dar inicio aos ensaios funcionais, efetuou-se a análise funcional in silico para prever o efeito patogénico de cada variante. Os ensaios funcionais incluíram o ensaio de formação de focos, migração, crescimento e ciclo celular. A expressão exógena do gene RET nas células transfetadas foi monitorizada e quantificada pela técnica de western-blott. O resultado destes estudos funcionais revelou que as novas variantes do gene RET, RET C515T e RET T636M, em comparação com o efeito induzido pelo RET selvagem, levavam um aumento do crescimento e proliferação celular, à perda de inibição por contacto e um aumento da migração celular. Todas estas características são comuns às células tumorais, levantando-se assim a hipótese de que estas novas variantes podem possuir um potencial oncogénico relevante. O potencial transformante destas novas variantes foi, no entanto, inferior ao observado para a mutação RET C634R, causadora do fenótipo NEM2A e utilizada como controlo positivo neste estudo. Com base nos estudos funcionais in vitro, estas novas variantes apresentam um baixo potencial oncogénico, resultados estes consistentes com o fenótipo pouco agressivo observado em ambas as pacientes deste estudo. Apesar da variante RET T636M não envolver diretamente um resíduo de cisteína, poderá induzir a uma alteração conformacional na proteína que poderá afetar uma ligação intramolecular localizada na vizinhança deste codão. Isto poderá ter um impacto na estrutura da proteína RET, bem como na sua ativação. Curiosamente, esta variante está localizada na vizinhança de certos codões que, quando mutados, estão associados a fenótipos mais agressivos. Por outro lado, a variante RET C515W envolve diretamente um resíduo de cisteína, podendo a sua perda ter consequências diretas na ativação do recetor RET. Indivíduos com mutações pouco patogénicas no gene RET podem necessitar de uma segunda mutação germinal ou somática para desenvolver um fenótipo mais agressivo, que leve à expressão clínica da doença. Esta hipótese foi levantada para a paciente B que possuía a variante em homozigotia, mas foi descartada quando se descobriu que uma prima, que possuía a mesma variante embora em heterozigotia, veio igualmente a desenvolver CMT, sugerindo que apenas um alelo mutado é suficiente para a manifestação da doença. Fatores externos como o estilo de vida de cada indivíduo ou do próprio ambiente em que este se encontra inserido, adicionado ao desenvolvimento tardio da doença, bem como à sua baixa penetrância, são fatores que provavelmente contribuem para as variações na expressão clínica da doença, sendo assim difícil de perceber o efeito da mutação só por si. Apesar de serem necessários estudos funcionais adicionais, a caracterização destas duas novas variantes contribui, não só, para o conhecimento dos mecanismos moleculares inerentes ao desenvolvimento de CMT nestas famílias, como também para a optimização do diagnóstico e o aconselhamento clinico de CMT hereditário