ELABORAÇÃO DE UM MEIO SEMI-SELETIVO COM BASE NA RESISTÊNCIA MÚLTIPLA CONSTITUTIVA DE PSEUDOMONAS PUTIDA (UFV-0073) A ANTIBIÓTICOS

O isolado UFV-0073 de Pseudomonas putida, autóctone do filoplano de tomateiro, foi selecionado para o controle biológico de doenças da parte aérea da cultura. No presente trabalho, foi elaborado um meio semi-seletivo para que no futuro seja estudada a dinâmica populacional desse agente de biocontrole na superfície das folhas, depois da dispensa nas plantas por pulverização, na tentativa de determinar como muitas vezes o agente de biocontrole, deve ser aplicado ao longo do ciclo da cultura. Vários passos foram seguidos para a construção de um meio seletivo com base na resistência múltipla constitutiva (RMC) do isolado UFV-0073 a antibióticos. Primeiramente foram feitos antibiogramas com 52 discos de impregnados com antibióticos e o isolado UFV-0073 foi insensível a nove. Desses, três antibióticos foram utilizados para futura investigação. Em segundo lugar, diferentes diluições dos três antibióticos escolhidos foram testadas, e o isolado UFV-0073 foi insensível até a concentração de 2500 μg.mL-1. Além disso, os três antibióticos foram incorporados juntos ao meio de cultura padrão até 64 μg.mL-1, tornando o meio semi-seletivo. Diluições seriadas do lavado de folhas do tomateiro, foram cultivadas no meio semi-seletivo, indicando que o meio não era repressivo ao agente de biocontrole alvo mas altamente repressivo aos outros microrganismos que vivem na superfície das folhas do tomateiro.Palavras-chave: Controle biológico; Antibiograma; Residente de filoplano

Deliver and populational tendencies of the biocontrol agent Pseudomonas putida in the tomato phylloplane

Na maioria dos experimentos sobre controle biológico de fitopatógenos já descritos, Rizobactérias Promotoras de Crescimento em Plantas (PGPR s) são dispensadas por microbiolização de sementes e bactérias residentes do filoplano são dispensadas por pulverização da parte aérea da cultura. Procurou-se verificar, se outras formas de dispensa do agente de biocontrole são igualmente eficientes aos métodos clássicos de dispensa. Objetivou-se testar várias formas de dispensa do agente de biocontrole Pseudomonas putida no filoplano do tomateiro, estudar sua dinâmica populacional no filoplano e correlacionar a dinâmica populacional com o biocontrole de doenças da parte aérea da cultura. O isolado Pseudomonas putida (UFV-0073), autóctone do filoplano de tomateiro, foi selecionado para o controle biológico de doenças da parte aérea da cultura. Foram testadas quatro formas de dispensa do agente de biocontrole em plantas de tomate: 1- sementes microbiolizadas DO540nm= 0,3 e logo em seguida semeadas; 2-atomização do filoplano do tomateiro com a cultura bacteriana DO540nm= 0,3; 3- a aplicação dos tratamentos 1 e 2 conjuntamente e 4- atomização do filoplano com o sobrenadante DO540nm= 1,0. Para o patossistema tomateiro e Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, a melhor forma de dispensa foi a pulverização do filoplano com propágulos do agente de biocontrole. No patossistema Pseudomonas syringae pv. tomato e plantas de tomate, as melhores formas de dispensa do agente de controle biológico foram a pulverização do filoplano com o sobrenadante da cultura e a microbiolização de sementes associada à pulverização do filoplano com propágulos do isolado. Para o estudo da dinâmica populacional do agente de biocontrole UFV-0073, no filoplano foi desenvolvido e testado um meio semi-seletivo tirando partido da resistência múltipla constitutiva a antibióticos. Em condições de casa-de-vegetação, houve uma tendência de queda na população do antagonista. No dia 0 (zero), a população do antagonista foi de 8,92 x 107 UFC/g de tecido foliar e no quinto dia após a dispensa sua população foi de 4,13 x 105, ou seja, 215 vezes menor do que a população inicial. Em condições de campo, a queda populacional do agente de biocontrole foi mais branda, revelando uma tendência ao equilíbrio, com alternância entre aumento e queda da quantidade de bactérias recuperadas. No dia zero, a população foi de 4,62 x 106 UFC/g de tecido foliar, nove dias após a dispensa a população passou a 9,91 x 105 UFC/g, cerca de 5 vezes menor do que a população inicial. Por fim, foi correlacionada a dinâmica populacional com o biocontrole de P. syringae pv. tomato, quando os resultados indicaram que o biocontrole foi efetivo até o quinto dia após a dispensa do agente de controle biológico no filoplano do tomateiro. Estudos dessa natureza são necessários para se estabelecer qual a melhor forma de dispensa e qual o intervalo entre as aplicações com o agente de biocontrole, quando realizadas pulverizações visando ao controle biológico de doenças. São necessários mais estudos com o agente de biocontrole, testando o controle contra outros patógenos e em condições de casa-devegetação e no campo.In most experiments dealing with biological control of plant diseases, plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) are delivered by seed microbiolization while bacterial phylloplane residents are delivered by spraying. In this work aimed to test several procedures for delivering the biocontrol agent Pseudomonas putida to tomato plants, as well as to study populational tendencies of the biocontrol agent in plant surfaces and to make attempts to establish correlations among populational tendencies and efficiency of biological control. The bacterium Pseudomonas putida (isolate UFV- 0073), autochthonous in tomato phylloplane, was previously selected for the biocontrol of tomato aerial part diseases. Four deliver modes were tested, as follow: 1- seed microbiolization (OD540 = 0,3) followed by planting; 2 - spraying tomato phylloplane with bacterial live propagules (OD540 = 0,3); 3 microbiolization and spraying seedlings with the antagonist (treatments 1 and 2) and 4 - spraying tomato phylloplane with the supernate obtained from bacterial culture (OD540 = 1.0). Results indicated that for the pathosystem tomato - Xanthomonas campestris pv. vesicatoria the most efficient deliver mode was to spray tomato phylloplane with propagule suspension of the antagonist while for its counterpart tomato- Pseudomonas syringae pv. tomato pathosystem, the best deliver modes were to spray the phylloplane with culture supernates and seed microbiolization along with phylloplane spray with a propagule suspension. In order to study populational tendencies for the biocontrol agent UFV-0073 in tomato phylloplane, a semi-selective culture medium was developed and tested based on the constitutive multiple resistance to antibiotics exhibited by the aforementioned isolate of P. putida. Under greenhouse conditions, measurement of population tendencies as a function of time indicated a population decrease in the sense that at day 0, the population was estimated as 8,92 x 107 CFU/g of leaf tissue and in day 5 this population went down to 4,13 x 105 CFU/g of leaf tissue, what means a population 215 times smaller that the original one. On the other hand, under field conditions, the populational tendency did decrease but in a slower rate and presented a tendency to equilibrium, with up and down population peaks in terms of recovered bacteria. So, at 0 day , the population was estimated as being 4,62 x 106 CFU/g leaf fresh weight and nine days after deliver it was 9,91 x 105 UFC/g, what means five times smaller than the population at 0 day. Last but not least, it was established a correlation between populational tendencies of the P. putida in the phylloplane and biocontrol of tomato bacterial speck (P. syringae pv. tomato), when results indicated that the biocontrol was effective up to the fifth day after deliver. This work provides a better understanding about the best deliver mode of P. putida while biocontrol agent for tomato diseases in the aerial parts as well as about time intervals for delivering the biocontrol agent under investigation.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológic

Rhizobacteria and jasmonic acid in controlling tomato diseases

Foram isoladas bactérias da rizosfera de plantas-escape ou apresentando baixa seve- ridade de doenças em cultivo de tomateiro convencional e orgânico, de floresta de eucalipto e de floresta nativa. Utilizando metodologias para o isolamento de actino- micetos e de rizobactérias totais e endosporogênicas foram obtidos um total de 635 isolados bacterianos, sendo 590 obtidos no presente trabalho e 45 selecionados em outros trabalhos. Sementes de tomate foram microbiolizadas com suspensão bacte- riana de cada um dos isolados. Vinte e nove isolados (4,56%) foram capazes de reduzir as doenças do tomateiro causadas por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) e Xanthomonas gardneri (Xg) em 50% ou mais e em 60% ou mais, respectiva- mente em substrato esterilizado. No ensaio realizado em substrato não esterilizado, as plantas tratadas com os antagonistas foram novamente desafiadas contra Xg e Fol e também foi testado se os isolados seriam eficientes no biocontrole do fungo Alternaria solani (As). No ensaio realizado em solo não esterilizado, os antagonista foram dispensados no tomateiro por microbiolização de sementes e encharcamento de solo cinco dias antes da inoculação com o patógeno desafiante. Alguns isolados não foram eficientes em promover o biocontrole da mancha-bacteriana e da murcha- de-fusário em solo não esterilizado. Quinze dos isolados selecionados contra Xg e Fol também foram eficientes no biocontrole da pinta-preta. Todos os 29 isolados foram capazes de colonizarar o sistema radicular das plântulas de tomateiro. Os três isolados que mais reduziram as severidades de Fol, Xg e As, em percentagem média, foram os isolados UFV252 (não identificado), UFV618 (Streptomyces setonii) e UFV592 (Bacillus cereus) em 47,91, 46,32 e 42,02%, respectivamente. Esses três isolados e o ácido jasmônico (AJ) foram testados contra Xg, Fol e As e na atividade de enzimas de defesa: β-1,3-glucanases (GLU), quitinases (QUI), peroxidases (POX), polifenoloxidases (PFO), lipoxigenases (LOX) e fenilalanina amônia-liases (FAL), além da concentração de aldeído malônico (MDA). Os isolados foram aplicados nas plantas por microbiolização de sementes e também por encharcamento de solo cinco dias antes da inoculação dos patógenos desafiantes e o AJ foi pulverizado nas plantas 48 horas antes da inoculação. Mesmo nas plantas não inoculadas, os tratamentos tiveram maior atividade de algumas enzimas em relação ao tratamento-controle não inoculado. Esses resultados sugerem que as rizobactérias podem estar induzindo resistência sistêmica no tomateiro, uma vez que mesmo na ausência do patógeno ocorreu aumento na atividade enzimática. No patossistema tomateiro-Xg as maiores atividades das enzimas de defesa nas plantas inoculadas com Xg em comparação ao controle que resultaram em menor severidade da mancha-bacteriana foram: QUI e LOX, para o tratamento UFV618; PPO, QUI e LOX, para os tratamentos UFV592 e UFV252; e GLU, QUI, POX, PPO e FAL, para o tratamento AJ. Para o patossistema tomateiro-Fol, as maiores atividades das enzimas de defesa nas plantas inoculadas com Fol em comparação ao controle, que resultaram em menor severidade da murcha-de-fusário foram as enzimas QUI e LOX, para os tratamentos UFV618; e UFV592, para o tratamento AJ. Além dessas enzimas houve aumento na atividade da POX e PAL. No tratamento UFV252 houve aumento na atividade das enzimas PFO, FAL e QUI. Já no patossistema tomateiro-As foi observado que não houve aumento da atividade de nenhuma enzima para o tratamento UFV618, entre as plantas inocu- ladas com As e o tratamento-controle; também não ocorreu redução da severidade da pinta-preta. Entretanto, no tratamento UFV592 houve aumento na atividade das enzi- mas QUI e FAL e no tratamento UFV252 ocorreu aumento na atividade da PFO e FAL. Além da PFO, QUI e FAL houve aumento na atividade LOX no tratamento AJ. A maior atividade dessas enzimas parece ter contribuído para a redução da severi- dade da pinta-preta pelos tratamentos UFV592, UFV252 e AJ. Em todos os patossis- temas em pelo menos uma época de coleta a concentração de MDA foi maior no tratamento-controle, inoculado em comparação com os tratamentos UFV618, UFV592, UFV252 e AJ, indicando maior dano nas membranas no tratamento- controle, o que corrobora com os maiores valores de severidade observados nesse tratamento.Bacteria were isolated from the rhizosphere of plants escape or showing low disease severity in tomato cultivation of conventional and organic eucalyptus forest and native forest. Using methodologies for isolating actinomycetes, rhizobacterias, and endosporogenic bacterias. This gave a total of 635 bacterial isolates, 590 isolates were obtained in this study and 45 isolates were selected for further work. Tomato seeds were microbiolized with bacterial suspension of each isolate. Twenty-nine isolates (4.56%), were able to reduce the tomato diseases caused by Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) and Xanthomonas gardneri (Xg) in 50% or more and 60% or more, respectively, in sterile substrates. In the assay accomplished in substrate unsterile, plants treated with the antagonists were again challenged against Xg and Fol and also tested whether these isolates would be effective in the biocontrol fungus Alternaria solani (As). In the test carried out in non-sterile soil, the antagonist were dispensed by microbiolization in tomato seeds and soil drenching, five days before inoculation with the pathogen challenging. Some isolates were effective in promoting the biocontrol of bacterial spot and fusarium wilt in unsterilized soil. Fifteen of selected isolates against Xg and Fol were also effective in biocontrol of early blight. All 29 isolates were able to colonizarar the root system of tomato seedlings. The three isolates that most reduced the severities of Fol, Xg, and As, average percentage, the isolates were UFV252 (unidentified), UFV618 (Streptomyces setonii) e UFV592 (Bacillus cereus) at 47.91, 46.32, and 42.02%, respectively. These three isolates and jasmonic acid (JA) were tested agains Xg, Fol, and As and activity of defense enzymes: β-1,3-glucanases (GLU), chitinases (CHI), peroxidases (POX), polyphenoloxidases (PPO), lipoxygenases (LOX), and phenylalanine ammonia lyase (PAL), in addition the concentration of malondialdehyde (MDA). The strains were applied in plants by seed microbiolization and also by soil drenching, five days before inoculation of challenging pathogens and the JA was sprayed on plants 48 h before inoculation. Even in non-inoculated plants treatments had higher activity of some enzymes in relation to the control uninoculated. These results suggest that rhizobacteria may be inducing systemic resistance in tomato, since even in the absence of the pathogen caused an increase in enzyme activity. In pathosystem tomato-Xg the highest activities of defense enzymes in plants inoculated with Xg compared to the control that resulted in lower bacterial spot severity were: CHI and LOX for the treatment UFV618; PPO, CHI, and LOX for the treatments UFV592 and UFV252, and GLU, CHI, POX, PPO e PAL for the treatment JA. In pathosystem tomato - Fol the highest activities of defense enzymes in plants inoculated with Fol compared to the control, that resulted in lower fusarium wilt severity were the enzymes CHI and LOX for the treatments UFV618 and UFV592, for the treatment JA beyond these enzymes increased in activity of POX and PAL. In UFV252 treatment increased the activity of enzymes PPO, PAL e CHI. Already in the pathosystem tomato- As was noted that there was no increase in the activity of the enzyme for the UFV618 treatment, between inoculated plants with As and control treatment, there was also no reduction in severity of early blight. However, the UFV592 treatment was no increase in enzyme activity CHI and FAL, and UFV252 treatment occurred increase in PPO activity and FAL. Besides the PPO, CHI, and PAL there was an increase in LOX activity in JA treatment. The increased activity of these enzymes appears to have contributed to reducing the severity of early blight by UFV592, AJ, and UFV252 treatments. In all pathosystems at least one collection time the concentration of MDA in control treatment was higher in comparison to UFV618, UFV592, AJ, and UFV252 inoculated treatments. Indicating greater damage membranes in control treatment which corroborates with the highest severity observed in these treatments.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoTese liberada do sigilo pelo Orientador em 06 de junho de 2017. Documento anexado ao Termo de Autorização

Antagonistic rhizobacteria and jasmonic acid induce resistance against tomato bacterial spot

AbstractTomato bacterial spot on tomato may be caused by four species of Xanthomonas and among them X. gardneri(Xg) is the most destructive one, especially in areas irrigated using a center pivot system in Minas Gerais state and the midwest region of Brazil. Due to the ineffectiveness of chemical control and the lack of cultivars with high levels of genetic resistance, this study investigated the potential of three antagonists (Streptomyces setonii (UFV618), Bacillus cereus (UFV592) and Serratia marcescens (UFV252)), and the hormone jasmonic acid (JA) as a positive control, to reduce bacterial spot symptoms and to potentiate defense enzymes in the leaves of tomato plants infected by Xg. Tomato seeds were microbiolized with each antagonist, and the soil was drenched with these bacteria. The plants were sprayed with JA 48 h before Xginoculation. The final average severity on the tomato plants was reduced by 29.44, 59.26 and 61.33% in the UFV592, UFV618 and JA treatments, respectively. The UFV618 antagonist was as effective as JA in reducing bacterial spot symptoms on tomatoes, which can be explained by the greater activities of defense enzymes that are commonly involved in host resistance against bacterial diseases. These results suggest that JA and the UFV618 antagonist can be used in the integrated management of bacterial spot on tomatoes

Antagonistic rhizobacteria and jasmonic acid induce resistance against tomato bacterial spot

AbstractTomato bacterial spot on tomato may be caused by four species of Xanthomonas and among them X. gardneri(Xg) is the most destructive one, especially in areas irrigated using a center pivot system in Minas Gerais state and the midwest region of Brazil. Due to the ineffectiveness of chemical control and the lack of cultivars with high levels of genetic resistance, this study investigated the potential of three antagonists (Streptomyces setonii (UFV618), Bacillus cereus (UFV592) and Serratia marcescens (UFV252)), and the hormone jasmonic acid (JA) as a positive control, to reduce bacterial spot symptoms and to potentiate defense enzymes in the leaves of tomato plants infected by Xg. Tomato seeds were microbiolized with each antagonist, and the soil was drenched with these bacteria. The plants were sprayed with JA 48 h before Xginoculation. The final average severity on the tomato plants was reduced by 29.44, 59.26 and 61.33% in the UFV592, UFV618 and JA treatments, respectively. The UFV618 antagonist was as effective as JA in reducing bacterial spot symptoms on tomatoes, which can be explained by the greater activities of defense enzymes that are commonly involved in host resistance against bacterial diseases. These results suggest that JA and the UFV618 antagonist can be used in the integrated management of bacterial spot on tomatoes

Rhizobacteria induces resistance against Fusarium wilt of tomato by increasing the activity of defense enzymes

Fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici (Fol), is one of the most important diseases that affect tomato yield worldwide. This study investigated the potential of three antagonists, Streptomyces setonii (UFV 618), Bacillus cereus (UFV 592) and Serratia marcescens (UFV 252), and as positive control the hormone jasmonic acid (JA), to reduce Fusarium wilt symptoms and to potentiate the defense enzymes in the stem tissues of tomato plants infected by Fol. The seeds were microbiolized with each antagonist, and the soil was also drenched with them. The plants were sprayed with JA 48 h before Fol inoculation. The area under the Fusarium wilt index progress curve was reduced by 54, 48, 47 and 45% for the UFV 618, JA, UFV 592 and UFV 252 treatments, respectively. The three antagonists, and even the JA spray, efficiently reduced the Fusarium wilt symptoms on the tomato plant stems, which can be explained by the lower malondialdehyde concentration (an indication of oxidative damage to lipids in the plasma membranes) and the greater activities of peroxidases, polyphenoloxidases, glucanases, chitinases, phenylalanine ammonia-lyases and lipoxygenases, which are commonly involved in host resistance against fungal diseases. These results present a novel alternative that can be used in the integrated management of Fusarium wilt on tomatoes

Resistência genética de plantas a patógenos

A segurança alimentar é um tema de inconteste relevo para os Estados e para a população mundial sendo considerada inclusive como questão de segurança nacional. Patógenos que atacam as culturas cultivadas emergem frequentemente como grandes vilões, comprometendo a qualidade e a disponibilidade de alimentos. As variedades resistentes constituem ferramentas fundamentais para amenizar os danos causados por patógenos, garantido, via de regra, incrementos em produtividade. O livro, Resistência genética de planta a patógenos, contempla, portanto, aspectos genéticos, bioquímicos e epidemiológicos de cultivares possuindo resistência genética aos patógenos. Organizado em 9 capítulos, este livro inicia com uma visão geral da resistência de plantas a microrganismos. Em seguida são tratados aspectos voltados ao melhoramento de plantas para obtenção de genótipos resistentes, bem como os aspectos evolutivos do patógeno que estão associados à suplantação da resistência. Aspectos epidemiológicos importantes para compreender o desenvolvimento das epidemias de doenças frente aos tipos de resistência de hospedeiro são apresentados e discutidos, bem como os mecanismos de defesa que encontramos em plantas que restringem o desenvolvimento da doença. Considerando as particularidades que existem para cada grupo de patógenos (fungos, bactérias, vírus e nematoides) dedicamos capítulos específicos para tratar dos assuntos relativos à resistência de plantas aos diferentes grupos, destacando particularidades inerentes a cada grupo de patógenos, os tipos de resistência efetiva e genes de resistência conhecidos. Em suma, este livro fornece ao leitor informações básicas e aplicadas para compreensão da resistência genética de plantas aos diferentes agentes causais, contendo informações que podem ser úteis para profissionais e estudantes das áreas de Fitopatologa e Melhoramento de Plantas