Análise histopatológica e proteômica da resistência/suscetibilidade do tecido foliar de macieira (Malus domestica Borkh.) a Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais.A maçã é a segunda fruta de maior importância econômica no Brasil, e Santa Catarina é o principal Estado produtor com 53% nacional da produção total do Brasil. A sua maçã se concentra principalmente em duas cultivares, Gala e Fuji, que representam em torno de 95% da produção. Esta concentração em poucas variedades predispõe à ocorrência de várias doenças, dentre elas aquelas conhecidas como "podridão amarga" e "mancha foliar da Glomerella" (MFG), as quais causam elevadas perdas na produção. Estas doenças são ocasionadas pelo ataque do patógeno fúngico Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., responsável pela doença nos frutos e nas folhas da macieira, respectivamente. A MFG é uma doença típica de verão, podendo provocar desfolhamento superior a 75% e, como consequência, reduzir drasticamente a produção das plantas no ano seguinte. Esta doença ocorre principalmente na cv. Gala, enquanto que a cv. Fuji mostra-se resistente a ela. Recomendam-se várias medidas para controlar esta moléstia nas cvs. suscetíveis, medidas estas majoritariamente associadas ao controle com produtos químicos. Os resultados, contudo, são variáveis e pouco animadores. A incorporação de resistência nas cultivares suscetíveis para estas e outras moléstias poderá reduzir o uso de fungicidas em mais de 80%. O presente trabalho objetivou analisar o patossistema C. gloeosporioides - M. Domestica desde uma perspectiva microscópica, a qual visa analisar a dinâmica de crescimento do C. gloeosporioides ao longo do tempo (até 48 horas após a inoculação do patógeno sobre folhas de macieira cvs. Fuji e Gala) e as diferenças que apresentam os tecidos foliares das cvs, Fuji e Gala em resposta ao ataque pelo patógeno, até 48 horas da inoculação, mediante observações ao microscópio óptico e microscópio eletrônico de varredura (MEV). O trabalho objetivou também empregar metodologias associadas à proteômica, visando identificar as diferenças na expressão proteica que apresenta o tecido foliar das cvs. Fuji e Gala em resposta ao ataque pelo C. gloeosporioides, e identificar a estrutura primaria das proteínas expressadas exclusivamente em cada tratamento, para cada cultivar, até 48 horas da inoculação com o patógenoThe apple is the second most economically important fruit in Brazil, and Santa Catarina State is the main producing region with 53% of the total national production. The apple production is concentrated mainly in two cultivars Gala and Fuji, wich represent around 95% of production. This concentration in a few varieties predisposes to several diseases, among them those known as "bitter rot" and "Glomerella leaf spot" (GLS), wich cause high yield losses. These diseases are caused by the attack of the fungal pathogen Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. & Sacc., responsible for the disease on fruits and leaves of apple trees, respectively. Bitter rot and MFG are typically summer diseases, when they can cause defoliation above 75% and, consequently, dramatically reduce the production plant next year. The MFG occurs mainly in cv. Gala, while cv. Fuji is resistant to it. It is recommended several measures to control this disease in the cvs. suscetible, mostly associated with these measures to control with chemicals. The results, however, are variable and not very encouraging. The incorporation of resistance in cultivars susceptible to these and other diseases may reduce the use of fungicides in over 80%. This study aimed at to analyze the pathosystem C.gloeosporioides - M. domestica from a structural perspective, which aimed to evaluate the growth dynamics of C. gleosporioides over time up to 48 hours after inoculation of the pathogen on leaves of apple cvs. Fuji and Gala and the differences in the the leaf tissue of cvs. Fuji and Gala in response to pathogen attack by up to 48 hours after inoculations, by optical microscopy and scanning electron microscope (SEM). The work also aimed to employ methodologies associated with proteomics, to identify differences in protein expression that has the leaf tissue of cvs. Fuji and Gala in response to the attack of C. gloeosporioides, and to identify the primary structure of proteins ocurring exclusively in each treatment in each cultivar 48 hours after inoculation with the pathoge

Estrutura genética de Colletotrichum fructicola e mecanismos de defesa da macieira (Malus domestica Borkh.) à mancha foliar de Glomerella

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2016.Colletotrichum fructicola é a principal espécie causadora de podridão amarga (PA) na macieira e da Mancha foliar de Glomerella (MFG) no Sul do Brasil e PA no Uruguai, país onde a MFG não tem sido reportada até então. Este trabalho teve como primeiro objetivo geral determinar a estrutura genética do C. fructicola proveniente de ambos os países. Vinte e oito (90.3%) dos 31 isolados brasileiros incluídos neste trabalho causaram sintomas típicos da MFG, enquanto apenas seis de 25 (24%) isolados uruguaios foram capazes de colonizar folhas de mudas de macieira suscetíveis (cv. Gala) à MFG, mas causando sintomas atípicos. Ambas as populações mostraram níveis similares de diversidade genética de Nei (h = 0.088 e h = 0.079 para a população brasileira e uruguaia, respectivamente) e a análise Bayesiana inferiu dois blocos genéticos que mostraram correlação com a distribuição geográfica dos isolados. Da mesma forma, a análise de coordenadas principais e o cladograma UPGMA também segregaram os isolados brasileiros e uruguaios em dois grupos. Todos os isolados uruguaios foram agrupados em um único Grupo de Compatibilidade Vegetativa (GCV) (GCV 1), enquanto que os isolados brasileiros foram agrupados em 4 GCV (GCV 1-4). Os resultados demonstraram que as populações brasileiras e uruguaias de C. fructicola são geneticamente diferentes e sugerem que a população brasileira causadora de MFG evoluiu independentemente da população uruguaia causadora de PA. Por outro lado, o segundo objetivo deste trabalho foi determinar se a resistência completa da macieira à MFG está associada com indução de reação de hipersensibilidade (RH), aumento da atividade enzimática antioxidante e indução da expressão dos genes PR-1 e PR-10. Plantas suscetíveis apresentaram um incremento na severidade da doença das folhas mais velhas às mais jovens, demonstrando a existência na macieira de um grau de resistência do tipo ontogênica para o C. fructicola. Por outro lado, a germinação dos conídios e formação de apressórios tenderam a localizar-se nas junções das células epidérmicas, tanto em folhas resistentes quanto suscetíveis, sugerindo uma penetração do tipo intramural por parte deste fungo. O acúmulo de peróxido de hidrogênio nas paredes celulares anticlinais e o associado com a RH foi relativamente baixo e não esteve associado à resistência ao C. fructicola. Por outro lado, as atividades enzimáticas da ascorbato peroxidase, guaiacol peroxidase e superóxido dismutase não variaram nas plantas resistentes e suscetíveis após a inoculação. Em contraste, a enzima glutationa reductase apresentou incrementos significativos nas folhas resistentes inoculados com C. fructicola às 12 e 48 h.a.i. Finalmente, a expressão do gene PR-1 não variou ao longo do tempo nas plantas resistentes, nem nas suscetíveis inoculadas com o patógeno. No entanto, a expressão do gene PR-10 aumentou em duas, e três vezes nas plantas resistentes e suscetíveis às 24 h.a.i., respectivamente; e em quatro vezes nas plantas suscetíveis às 48 h.a.i., em relação ao controle. Em conjunto, os resultados sugerem que a resistência recessiva da macieira à MFG não está associada com o acúmulo foliar de peróxido de hidrogênio, indução da RH e incremento na expressão do gene PR-1.Abstract : C. fructicola is the main species causing apple bitter rot (ABR) and Glomerella leaf spot (GLS) in southern Brazil, and ABR in Uruguay where GLS remains unnoticed. This work aimed firstly to determine the genetic structure of C. fructicola species causing ABR and GLS in both countries. Twenty-eight from 31 brazilian isolates caused typical symptoms of GLS, while only six of 25 uruguayan isolates originating from fruits were able to infect leaves, but causing atypical symptoms. Both populations showed similar levels of Nei´s gene diversity (h = 0.088 and h = 0.079, for brazilian and uruguayan populations, respectively), and Bayesian cluster analysis inferred two genetic clusters correlated with the geographical origin of isolates. A principal coordinates analysis (PCoA) scatter plot, and a (UPGMA)-based dendrogram, also grouped brazilian and uruguayan isolates into two groups. By pairwise comparison of nitrate-non-utilizing (nit) mutants with a proposed set of testers, all uruguayan isolates were grouped into a unique vegetative compatibility group (namely VCG1), while brazilian into four VCGs (VCG1-4). Brazilian and uruguayan populations of C. fructicola were revealed to be genetically distinct, and suggest that isolates of C. fructicola from Brazil capable of causing GLS and ABR arose independently of those from Uruguay. By other hand, the second objective of this work was to asses if complete resistance of apple to GLS is associated to leaf accumulation of hydrogen peroxide, induction of hypersensitive responses (HR), and expression of PR-1 and PR-10 genes. Susceptible plants showed increasing leaf necrosis from older to younger leaves, demonstrating the expression of an ontogenic resistance to GLS. Most conidia and appressoria were developed on anticlinal cell walls, and the number of attempted penetration sites was similar in resistant and susceptible leaves. Enzymatic activity of ascorbate peroxidase, guaiacol peroxidase and superoxide dismutase were similar in resistant and susceptible leaves inoculated with C. fructicola, and accordingly, leaf accumulation of hydrogen peroxide was low and not associated with resistance. However, enzymatic activity of glutathione reductase was increased in resistant leaves at 12 and at 48 h.a.i with pathogen. Finally, the PR-1 gene showed a constitutive expression in the both resistant and susceptible leaves that was not affected by inoculation with C. fructicola. However, relative expression of PR-10 was up-regulated in the both resistant and susceptible leaves at 24, and in susceptible ones at 48 h.a.i. Results suggest that recessive resistance of apple to leaf infection by C. fructicola acts independently of hypersensitive reaction and expression of PR-1 gene

Variação morfo-cultural e agressividade de Colletotrichum fructicola em um pomar de macieira em Fraiburgo-SC

Resumo – A maçã é uma das frutas de clima temperado de maior importância para a economia do Sul do Brasil. Nessa região, as plantas são severamente afetadas pela mancha foliar de Glomerella (MFG), uma doença causada por espécies de Colletotrichum. O objetivo do presente trabalho foi identificar as espécies predominantes de isolados causadores de MFG provenientes de um mesmo pomar localizado em Fraiburgo, SC e verificar se dentro dessa população existia variação nos níveis de agressividade. A identificação molecular dos isolados foi realizada mediante sequenciamento e análise da homologia das regiões ITS, TUB2, GAPDH e HIS3. Para a caracterização morfo-cultural, os isolados foram cultivados em meio BDA a 25ºC e 12h de fotoperíodo durante 10 dias. Para avaliação da agressividade, plântulas suscetíveis (cv. Gala) foram inoculadas com uma suspensão contendo 1x106 conídios/ml. Todos os isolados foram identificados como Colletotrichum fructicola. Cerca de 50% dos isolados apresentaram micélio ralo com coloração de branco-oliva na frente e salmão no verso. Seis isolados formaram peritécios. Os conídios foram predominantemente cilíndricos com largura e comprimento médio de 4,2-4,5µm e 12,1-13,4µm, respectivamente. Os isolados foram classificados em três níveis de agressividade, sendo que o mais agressivo causou 80% de necrose em folhas. As implicações desses achados para o controle da MFG são discutidas.Abstract – Apple is one of the most important temperate fruit for the Southern Brazil’s economy. In this region, the production is severely affected by Glomerella leaf spot (GLS), caused by Colletotrichum spp. The objective of this study was to identify the predominant species causing GLS in an apple orchard in Fraiburgo, SC and to assess whether there were isolates with different levels of aggressiveness in the population. The molecular identification was carried out by sequencing and analysis of the homology regions ITS, TUB2, GAPDH and HIS3. For morphological and cultural characterization, the isolates were cultured on PDA at 25°C and 12h of photoperiod during 10 days. Susceptible seedlings (cv. Gala) were inoculated with a solution containing 1x106 conidia/ml for aggressiveness assessing. All isolates were identified as Colletotrichum fructicola. Fifty percent of isolates exhibited mycelium thin with white-olive coloration and a salmon reverse. Six isolates formed perithecia. Conidia were predominantly cylindrical with width and length ranged from 4.2 to 4.5µm and 12.1 to 13.4µm, respectively. The isolates were classified into three aggressiveness levels, and one of them was highly aggressive with 80% of necrotic leaf area. Implications of these findings for disease control are discussed